Microscopia

MICROSCOPIA La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la biología. El microscopio, el instrumento más peculiar del laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación gracias a la cual el hombre es capaz de ver organismos y estructuras que a simple vista serían invisibles. Se dispone de microscopios que permiten amplias escalas de aumento, desde centenares hasta centenares de miles de diámetros. Microscopio y microscopia Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (óptico) y el electrónico, según el principio en que se base la amplificación. El microscopio electrónico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen amplificada. Estos tipos de microscopia se usan para propósitos especiales o trabajos de investigación. Sin embargo, los estudiantes conocen sus aplicaciones porque cada uno tiene propiedades convenientes para demostrar estructuras morfológicas específicas. Microscopia de transmisión electrónica La microscopia electrónica difiere en muchos aspectos de las técnicas de microscopia óptica. El microscopio electrónico tiene la ventaja de su extraordinaria amplificación, con un poder de resolución 100 veces mayor que el del microscopio óptico por la gran cortedad de longitud de onda del haz electrónico usado para ampliar el espécimen. Desde 1900 el uso del microscopio electrónico se ha extendido prácticamente a todos los campos de la investigación biológica. El microscopio electrónico se vale de ondas de electrones y campos magnéticos para producir la imagen, mientras que el microscopio de luz hace uso de ondas luminosas y lentes de vidrio. El Supermicroscopio o Microscopio electrónico 4381560960El quid de la microscopia radica, en la utilización de rayos de longitud de onda cada vez más corta. Al tenor de este imperativo nace el Microscopio electrónico. quot;
De la óptica de la luz, pasando por la microscopía de rayos ultravioleta y la interferometría de rayos X llegamos por camino directo a la óptica electrónicaquot;
, ha dicho el Prof. E. Hintzsche. Este instrumento nos permite el estudio y conocimiento de la ultra o infraestructura protoplasmática por su extraordinario poder de resolución, ofreciéndo imágenes considerablemente ampliadas, no vistas hasta hoy, de la textura de una célula. Así, por ejemplo, con él se ha podido reconocer que las neurofibrillas son un quot;
aparato neurotubularquot;
. Y algunos misterios de la Bacteriología han sido dilucidados. Mas no sólo la morfología y textura física de los seres y de las cosas submicroscópicas ha sido destacada, puédase, inclusive, analizar la constitución química de los mismos gracias a un aditamento llamado defractómetro. La construcción de este aparato tiene por base o descansa en el conocimiento de la quot;
propiedad de los rayos catódicos de ser desviados por un campo magnético, y de que esta desviación se realiza en forma estrictamente comparable a la que sufren los rayos lumínicos al atravesar una lentequot;
. Dedúcese de ello que los rayos electrónicos (invisibles) ofician de fuente de quot;
luzquot;
y de quot;
lentesquot;
los campos magnéticos (que no son de cristal). Trabaja con una corriente de 30 o 60 mil volts. La utilización de la descarga de rayos emitidos por un cátodo (quot;
filamento de alambre calentado en un ambiente al vacíoquot;
) es la clave básica de este instrumento como fuente poderosa de rayos, aún cuando originalmente se utilizó el cátodo frío. Para la difusión rectilínea y de velocidad constante de los rayos electrónicos es indispensable un alto vacío. La imagen es proyectada sobre una pantalla impregnada con materias fluorescentes, y hay que recurrir a las fotografías hechas sobre placas ad-hoc para su estudio. Pudiera resumirse que el microscopio electrónico difiere del aparato luminoso óptico común en que el objeto que se examina es virtualmente quot;
iluminadoquot;
por un rayo (un haz) concentrado de electrones, donde la imagen es observada indirectamente; en tanto que en el microscopio corriente la iluminación se realiza simplemente gracias a la luz del día (luz natural) o mediante luz artificial, siendo directa su objetivación. Y se dice que la observación del objeto es quot;
indirectaquot;
porque la imagen -en el supermicroscopio- es proyectada sobre una pantalla florescente, semejante a la de los rayos X (fluroscopía). En el supermicroscopio la imagen es aumentada considerablemente por una combinación de lentes magnéticas, un tanto parecidas a las lentes ópticas de un microscopio corriente. Las lentes electrónicas se construyen a base de dos tipos principales: las llamadas quot;
electrostáticasquot;
y las quot;
electromagnéticasquot;
. Con el microscopio óptico la mayor amplificación que se logra es del orden de 1000 X, mientras que con el electrónico se han alcanzado amplificaciones mayores a los 100 000 X. Otro avance espectacular reciente en este campo es un perfeccionamiento substancial del microscopio electrónico, en Suiza, por Gerd Binning y Heinrich Rohrer. Con este nuevo instrumento, llamado microscopio electrónico de barrido con efecto túnel, se ha podido por primera vez observar átomos individuales, aunque con poco detalle. Ruska compartió el premio Nobel con Binning y Rohrer en 1986. Exceptuando técnicas como el microscopio de fuerza atómica, el microscopio de iones en campo y el microscopio de efecto túnel, la microscopía generalmente implica la difracción, reflexión o refracción de radiación incidente en el sujeto de estudio. En la microscopía de luz clásica, esto implica el paso de luz transmitida a través o reflejada desde el sujeto mediante una serie de lentes, para poder ser detectada directamente por el ojo o impresa en una placa fotográfica. En el microscopio compuesto, para tener una imagen detallada y fiel en cuanto a calidad, de los microorganismos y sus fenómenos, se debe tener correspondiente a la parte óptica: la luz, la cantidad de esta y su concentración en la muestra, además de que proviene de forma directa por medio de un bombillo incorporado (electricidad) o un espejo en donde se dé la reflexión de la luz. Están los lentes, con los poderes de aumento y resolución, y en tercer lugar está el índice de refracción con los distintos líquidos que se utilizan para las observaciones. En cuanto a la parte mecánica tenemos los tornillos y sus engranajes. Tipos de microscopios electrónicos Microscopio electrónico de transmisión (TEM) El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. 4139565108585La microscopia electrónica de transmisión es el método más antiguo para estudiar la microestructura de las capas. En comparación con la microscopia de fuerza atómica (AFM) este método consiste en el bombardeo de la prueba por iones energéticos. Una capa delgada de las muestras se recubre con carbono u oro para reflejar bien los electrones, puesto que este sistema consiste en la obtención de imágenes mediante la recolección de los electrones reflejados por la muestra. La fuente de electrones es generalmente un filamento caliente de tungsteno que por efecto termoiónico emite electrones. Éstos se focalizan en una zona situada enfrente del ánodo. La corriente total emitida por el cañón de electrones puede ser del orden de 100mA, pero sólo una pequeña fracción se utiliza para formar la imagen final. El resto se detiene en los distintos diafragmas dentro de la columna del microscopio. Mediante el incremento de la corriente, la fuerza del campo magnético aumenta y por lo tanto la graduación de las lentes se hace mayor a su vez. Microscopio electrónico de barrido (BEM) 15240314960En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. Diferencias entre el microscopio electrónico y el óptico La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 angstroms (1 angstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 angstroms. Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Por último, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones. Teoría del funcionamiento del microscopio Está formado por dos lentes convergentes: lente objetivo, situada muy cerca del objeto. lente ocular, al otro extremo del tubo, está situado más cerca del ojo y hace la función de lupa sobre la imagen que produce la lente objetivo. La lente objetivo es muy convergente (f=2 cm la de la siguiente figura) y el objeto debe colocarse más allá de su punto focal, pero cerca de él. El ocular se coloca de manera que la imagen formada por la lente objetivo (flecha amarilla) caiga sobre el punto focal de ella, F2. En la figura está un poco más cerca de la lente. Cuando una imagen se forma en el foco, F2, la luz emerge del ocular en forma de un haz de rayos paralelos y forma la imagen en el infinito, pero el ojo, sin esfuerzo de acomodación, la concentra en la retina. El ocular logra que veamos la imagen del objetivo con un ángulo aparente mayor que si el objeto estuviera en el punto próximo del ojo. La lente objetivo produce una imagen mayor, real e invertida, y la lente ocular, actuando sobre ella, la hace más grande pero la deja invertida y virtual. La imagen que da el microscopio es mayor, virtual e invertida. La imagen final después de pasar por el ojo se forma en la retina. La distancia entre el punto focal imagen del objetivo y el punto focal objeto del ocular se llama longitud del tubo, L. En los microscopios tiene un valor fijo: 16 cm. Se puede conseguir poder de resolución hasta 0.1 nm (1 A) con los nuevos diseños del microscopio electrónico. La distancia de enfoque del objetivo en el microscopio electrónico de 180 KV es de 1,1 mm. Este factor mejora la profundidad del campo y es cientos de veces mayor que la conseguida por el microscopio óptico. El microscopio electrónico moderno está basado en los principios generales de la lente electromagnética. Todo microscopio electrónico basa su funcionamiento en tres ejes fundamentales: Fuente de electrones que ilumina la muestra. Lentes electromagnéticas que dirigen el haz de electrones hacía la muestra de la manera más conveniente. Sistema que capta los efectos de dicho haz al incidir sobre el espécimen y los visualiza. ¿Cómo se logra la amplificación en un microscopio electrónico? Amplificadores y microscopios Cuando una lente óptica se usa para incrementar la imagen de un objeto nos referimos a un amplificador. Cualquier amplificador incrementa el tamaño aparente de un objeto incrementando la imagen del objeto en la retina del ojo. Generalmente el tamaño de la imagen retinar está limitada a cuan cerca puede ser emplazado un objeto visto con un solo ojo. En la práctica este ha sido estandarizado en 25 cm se ha llamado distancia de distinción de visión. Como un objeto es traído desde infinitamente cerca al ojo, el ángulo entre una línea horizontal y la altura del objeto (ángulo visual) se ve incrementado. Esta amplificación podemos decir que es proporcional al ángulo sostenido del objeto y Normal. Un ángulo sostenido de menos de 1º no puede ser visto por el ojo; entonces para ver dicho objeto el ángulo debe ser incrementado. Sistema de amplificación del microscopio electrónico de barrido 46355297180El sistema de amplificación recoge las señales y procesa la información procedente de la muestra, al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra. El generador de barrido está conectado al tubo de rayos catódicos (CRT) para que el haz de electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que, el haz principal. Sin embargo, la potencia de la corriente suministrada a la columna principal para de barrido puede ser atenuada mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una área constante. Como consecuencia de ello, cualquier reducción en el área de la muestra barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento viene determinado por la relación del área de la pantalla del tubo (constante) respecto al área de la muestra barrida (variable). Técnicas de Microscopia Óptica: se trabaja sobre el microscopio. Fijación: tratamiento químico para matar a las células de modo que quedan como eran in vivo, y que las moléculas queden fijadas, que no se eliminen/ laven en manipulaciones posteriores. Seccionado: se corta el tejido muy fino, de forma que lo atraviese la luz. Para ello se emplean los microtomos, estos pueden ser: De mano: la muestra debe incluirse en un medio, la médula de saúco (de sauce, Salix). De parafina: incluir la muestra en parafina, una especie de cera. Antes la muestra tiene que pasar un proceso: deshidratación, se impregna con disolvente Xilol/Xileno) de parafina, este junto a la parafina, y parafina únicamente. De congelación: la muestra se impregna de nitrógeno líquido, y luego se corta con cuchilla de acero. Es el procedimiento más rápido. Tinción: si el tejido es casi transparente hay que añadirle colorantes para permitir la visión. Normalmente se emplean más de un colorante de diferente color y también químicamente distintos. Esta es una sustancia química que reacciona con unas moléculas determinadas del tejido, quedándose fijado, así se obtiene el contraste. Montaje de la preparación: se montan los diferentes cortes en el portaobjetos. Habitualmente se emplea el cubreobjetos, entre porta y cubre no debe haber aire. Dependiendo de la duración, la preparación puede ser: Temporales: se emplea agua y otras substancias. Permanentes: indefinidas, se emplean bálsamo de Canadá y resinas. El orden entre montaje de la preparación y tinción, puede variar. Electrónica: se trabaja sobre fotografías. Fijación: tiene mucha importancia. Se sigue el mismo proceso que en la microscopía óptica. Seccionado: los cortes, muy finos, son atravesados por electrones (muy poco poder de penetración). Se usan los ultramicrotomos, para poder emplearlos se debe incluir la muestra en una resina muy dura (polimerizada). Montaje de la preparación: en una rejilla de cobre, que actúa como red en la mini piscina. La rejilla es el portaobjetos. Se usa cobre porque los tejidos se adhieren bien. Tinción: se tiñe siempre, aunque sin colorantes. En este caso se emplean metales pesados, ya que estos átomos pesados desvían a los electrones, mientras que los átomos ligeros no lo hacen. Y porque la materia viva está formada por átomos ligeros (C, N ,O, entre otros). Estos metales pesados se introducen formando parte de sustancias químicas, reaccionan selectivamente con las moléculas de una célula. Existen diversas técnicas de microscopia, entre las cuales se pueden destacar: Microscopia de campo oscuro.- El microscopio de campo oscuro está constituido por un microscopio óptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una dispersión de los rayos luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminoso, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo. El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz 394462099695y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llega hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partículas más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado por transparencia. 15240688340Los condensadores que se emplean en Microscopía de campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numérica mayor al del objetivo. Para que el efecto de campo oscuro se logre, la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la del objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeño y gran aumento no así con los de inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la apertura numérica. RESOLUCIÓN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema óptico es su límite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos. El límite de resolución depende de la apertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada. En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor. El límite de resolución del objetivo está dado por la siguiente fórmula: LR = k x Long. onda Donde * k = Constante ( 0.61) * Long. onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde –amarilla, por ser el ojo humano más sensible a estos colores que a otros. * AN = Apertura numérica no superior a 1.0 NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO 15240281305Las imágenes en auténtico fondo negro son remarcables por un efecto de borde, con numerosas franjas de difracción muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos, en el centro de una estructura parecen ópticamente vacíos, es por ello que deben adoptarse grandes precauciones en el momento de interpretar las imágenes. Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre más débil que la luz directa deben formarse fuentes lumínicas muy intensas, lo que no siempre es fácil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con la microscopía óptica ordinaria. VENTAJAS Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo. Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas. Se puede utilizar para la observación de preparaciones vivas, sin colorear. Visualiza los bordes destacados de las muestras. Técnica valiosa para observar microorganismos con diámetros superior a 0.2 um. DESVENTAJAS Inadecuada preparación de la muestra. Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. No deja visualizar estructuras celulares específicas, solo bordes de células o partículas. Microscopia de contraste de fase.- Para poder observar una célula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y hacerle una tinción, lo que implica, la muerte de la célula en cuestión. Esto siempre ha sido una preocupación para los expertos en el campo del estudio celular, debido que al pasar por todos estos procesos, algunas estructuras pueden dañarse o cambiar su forma. Para esto se utiliza el microscopio de contraste de fase (entre otros métodos más modernos), que permite realizar exámenes inmediatos y observar células vivas. El microscopio de contraste de fase permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. CONSTITUCIÓN DEL MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE 15240308610Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio óptico de campo claro con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales. El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos “anillos de fase”, que son discos transparentes con un diseño en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imágenes se ven diferentes en cada uno. FUNDAMENTOS FÍSICOS Este microscopio se basa en que la luz, al atravesar objetos con distintos índices de refracción, experimente retrasos (o desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder observarlos, el microscopio de contraste de fase, mediante las dos adaptaciones, acentúa dichos retrasos, haciendo que zonas con distintos índices de refracción se traduzcan en una variación de contraste lo cual puede ser observado. La manera de funcionar es la siguiente: Por medio del condensador, se logran separar los rayos luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen, al pasar por la muestra, los rayos que atraviesan objetos más densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan un cuarto de lambda más, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte más delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas luminosas se perciben como diferencias en el contraste, en distintos tonos de gris. Además el anillo de fase disminuye la intensidad de la luz. Además, existen distintas formas de discos de fase, positivos y negativos, los que tienen distintos efectos sobre la luz difractada, haciendo que las imágenes se vean de diferente manera dependiendo cual se use. 15240157480En la figura se muestra el diseño de los tipos de anillos de fase, el superior corresponde al positivo y el inferior al negativo, se muestra también el efecto sobre las ondas luminosas y un ejemplo de de cómo se ve la misma muestra con cada disco de fase. Además, existen discos de fase con distintas características de absorción y retardo de los rayos luminosos, lo que indudablemente influye en el contraste de las imágenes. APLICACIONESEl microscopio de contraste de fase, debido a sus propiedades, se utiliza para exámenes inmediatos (o invivo), este tipo de microscopio ha desplazado en uso al de campo claro. Cabe destacar como desventaja, el que los objetos se vean delimitados por un halo o aura brillante alrededor en el caso del contraste de fase positivo, o por una sombra en el caso del contraste negativo, defecto producido por la manera de que se producen las imágenes. Microscopia de fluorescencia.- La microscopía de fluorescencia confocal aporta otra solución mucho más directa. Mediante el empleo de fuentes de iluminación de gran intensidad y sincrónicas, de un juego de diafragmas y de un sistema de captación de imagen electrónico, permite la obtención de imágenes de finas secciones ópticas. A partir de series de secciones ópticas de estos tipos obtenidos a diferentes profundidades, archivados en un ordenador, resulta posible reconstruir una imagen tridimensional. En este tipo de microscopia una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosas: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante. PRINCIPIO DE LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos, inclusive conjuntos que permiten la observación simultánea de dos fluorocromos. Es de gran importancia seleccionar el adecuado conjunto de filtros para la observación. USO DEL MICROSCOPIO CONFOCAL A pesar de que los detalles ópticos del microscopio de fluorescencia confocal son complejos, la idea es sencilla. El sistema óptico del microscopio, generalmente fluorescente, no ilumina toda la preparación a la vez, sino que en cada momento sólo ilumina un pequeño punto a una cierta profundidad de la muestra. Para ello se necesitan fuentes luminosas de gran potencia, habitualmente haces láser, cuya luz pasa a través de un diafragma. La luz fluorescente emitida por la preparación se recoge y produce una imagen a la entrada de un fotodetector adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar que es confocal con el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el punto iluminado de la muestra quedan enfocados. La luz que procede de ese punto penetra en el detecto, mientras que la que procede de otras regiones de la muestra queda fuera de foco en el diafragma y no es detectada. La muestra es barrida por el punto luminoso de una manera similar al barrido que forma la imagen en una pantalla de TV. La imagen bidimensional, digital, se forma al almacenar en una matriz numérica las intensidades luminosas medidas en cada uno de los puntos del barrido. La imagen en un microscopio confocal se forma en un sistema electrónico y se genera uno o más ficheros que contienen tanto las imágenes obtenidas como la información acerca de las condiciones en que se han tomado. Gracias a esto podemos obtener lo siguiente: Colecciones de secuencias seriadas. 3758565952519869155715019621557150 Endocitosis de lipoproteínas. Reconstrucciones tridimensionales del objeto estudiado. 38157151047752005965104775215265104775 Imágenes laterales del objeto (o x-z). 163449095885 Superposición de imágenes obtenidas por diferentes técnicas. 1929765175260

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