Mg.Sc. Blgo. LUIS GUZMÁN MASIAS INSTITUO PERUANO DE BIOLOGÍA MOLECULAR [email_address] PCR en Tiempo Real
Uso de PCR en tiempo real en publicaciones indexadas (Medline)
PCR <ul><li>1983 – 1985  : Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) </li></ul><ul><li>  Kary Mullis </li></ul><ul><li>Ven...
<ul><li>   RT-PCR  :  detección de mRNA </li></ul><ul><li>PCR-RFLP  :  polimorfismo genético </li></ul><ul><li>RAPDs  :  ...
APLICACIONES DE PCR <ul><li>Diagnóstico clínico </li></ul><ul><li>   Monitoreo y Evaluación de terapia </li></ul><ul><li>...
POR QUÉ PCR EN TIEMPO REAL ESTÁ DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR? QUE VENTAJAS PRESENTA EL  PCR EN TIEMPO REAL?
PCR Standard  vs.  PCR Tiempo Real Análisis de punto final Detección del producto por Electroforesis en gel Análisis de la...
<ul><li>Compuestos fluorescentes:   -  compuestos que emiten fluorescencia cuando se   unen a dsDNA  -  interacción inespe...
<ul><li>SYBR Green </li></ul><ul><li>Absorbe a 480 nm, y emite a 520 nm. </li></ul><ul><li>Desventaja: se une a  </li></ul...
Beacons moleculares El Fluoróforo emite señal cuando el agente bloqueador (Quencher) se encuentra alejado por efecto de la...
TaqMan PCR :  generación de señal por hidrólisis   de sonda. FAM : maxima emisión a 535 nm TAMRA : máxima absorción a 560nm
FRET :   Fluorescence Resonance Energy Transfer
HARDWARE & SOFTWARE SOFTWARE
Ventajas del PCR en tiempo real <ul><li>Simple y rápida (semi-automatizada). </li></ul><ul><li>No hay manipulación post-PC...
<ul><ul><li>En teoría el Producto (P) se incrementa exponencialmente con el # ciclos (n). </li></ul></ul><ul><ul><li>Depen...
“ FASE PLATEAU” Sin embargo, reacciones con diferentes numero de copias iniciales llegan al mismo nivel de “plateau”
<ul><li>El producto de PCR no siempre se duplica con cada ciclo. </li></ul><ul><ul><li>  E = eficiencia del PCR </li></ul>...
EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO
<ul><li>Factores limitantes en la eficiencia del PCR: </li></ul><ul><ul><li>-  cantidad de cebadores disponibles </li></ul...
CANTIDAD DE DNA (escala aritmética)  vs.  NUMERO DE CICLOS Los productos de amplificación no se detectan en los primeros c...
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales.  Relación c...
Escala aritmética
La misma reacción de PCR en escala logaritmica - se aproxima a la gráfica teórica.  Según las curvas teóricas, se debe obt...
Analizando la misma región en una escala regular (aritmética), veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva...
Para cada muestra, el software determina en qué ciclo, el valor de la fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Thr...
NTC: tubo control sin DNA templado RUIDO CONTROLES DE REACCION :  ELIMINACION DE RUIDO
Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reacción.  Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmic...
Cuantificación de DNA o cDNA   (colocando diluciones de la misma muestra) A menor concentración de la secuencia target en ...
El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentración resulta en una gráfica lineal, y debe presentar un alto coeficie...
<ul><li>Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los primers a secuencias parcialmente complementarias pre...
CURVA DE DENATURACION Muesta el perfil de denaturación de los productos amplificados.  (no se observan productos inespecíf...
Una temperatura de denaturación diferente significa un  producto diferente.  Dímeros:  menor temperatura de fusión. dímeros
PCR en tiempo real <ul><li>Detección y cuantificación utilizando reporteros fluorescentes. </li></ul><ul><li>Fluorescencia...
<ul><li>Controles </li></ul><ul><li>Problemas de Inhibición - falsos negativos </li></ul><ul><li>Estándares internos  (gen...
APLICACIONES EN INVESTIGACION DNA :  -  Identificación de genes de virulencia  o de   resistencia a drogas   -  Genotipifi...
Detección de la expresión de genes (detección de mRNA) <ul><li>Perfíl de expresión génica en diferentes tipos celulares en...
APLICACIONES AL  DIAGNOSTICO CLINICO <ul><li>Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos: </li></ul><ul><ul>...
DETECCION DE SNPs o  DE MUTACIONES PUNTUALES
Células Madre y su diferenciación a Linaje Neuronal:  Ejemplo de Cuantificación Relativa
 
La herencia epigenética es regula procesos como proliferación y diferenciación celular manteniendo estados transcripcional...
 
RNA interferencia  30 min en hielo y cultivo
Análisis de Melt
ACTINA OSA1 End-Point
 
Curva patrón BCR-ABL CUANTIFICACION ABSOLUTA Translocación (9,22) Segunda Derivada
 
Real Time PCR ejemplo de detección en embarazadas a partir de la sexta semana
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PCR en tiempo real

  1. 1. Mg.Sc. Blgo. LUIS GUZMÁN MASIAS INSTITUO PERUANO DE BIOLOGÍA MOLECULAR [email_address] PCR en Tiempo Real
  2. 2. Uso de PCR en tiempo real en publicaciones indexadas (Medline)
  3. 3. PCR <ul><li>1983 – 1985 : Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) </li></ul><ul><li> Kary Mullis </li></ul><ul><li>Ventajas: </li></ul><ul><ul><li>Alta sensibilidad </li></ul></ul><ul><ul><li>Alta especificidad </li></ul></ul><ul><ul><li>Rapidez </li></ul></ul><ul><li>Otras ventajas: </li></ul><ul><ul><li>Detección a partir de cualquier muestra biológica (sangre, piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, etc…) </li></ul></ul><ul><ul><li>No es necesario que la muestra sea estéril </li></ul></ul><ul><ul><li>Detección de un patógeno en particular aún en presencia de otros patógenos. </li></ul></ul>
  4. 4. <ul><li> RT-PCR : detección de mRNA </li></ul><ul><li>PCR-RFLP : polimorfismo genético </li></ul><ul><li>RAPDs : amplificación con random primers - polimorfismo </li></ul><ul><li> PCR Nested : amplificación de una secuencia dentro de otra previamente amplificada </li></ul><ul><li> PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea </li></ul><ul><li> Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras </li></ul><ul><li>Long PCR : amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb. </li></ul>VARIANTES DE PCR
  5. 5. APLICACIONES DE PCR <ul><li>Diagnóstico clínico </li></ul><ul><li> Monitoreo y Evaluación de terapia </li></ul><ul><li> Detección de cepas resistentes a antibióticos </li></ul><ul><li> Detección de mutaciones puntuales </li></ul><ul><li> Polimorfismo genético </li></ul><ul><li>Filiación humana </li></ul><ul><li>Medicina Forense </li></ul><ul><li>Pedigrí animal </li></ul><ul><li>Control de calidad </li></ul>
  6. 6. POR QUÉ PCR EN TIEMPO REAL ESTÁ DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR? QUE VENTAJAS PRESENTA EL PCR EN TIEMPO REAL?
  7. 7. PCR Standard vs. PCR Tiempo Real Análisis de punto final Detección del producto por Electroforesis en gel Análisis de la cinética de la reacción Detección del producto en cada ciclo de la reacción
  8. 8. <ul><li>Compuestos fluorescentes: - compuestos que emiten fluorescencia cuando se unen a dsDNA - interacción inespecífica - Sybr green, EtBr,YOYO-1, entre otros… - Puede unirse a dimeros </li></ul><ul><li>Reporteros fluorescentes : - Sondas Taqman - Beacons moleculares - FRET </li></ul>DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION
  9. 9. <ul><li>SYBR Green </li></ul><ul><li>Absorbe a 480 nm, y emite a 520 nm. </li></ul><ul><li>Desventaja: se une a </li></ul><ul><li>cualquier DNA de doble cadena de forma inespecífica (dímeros </li></ul><ul><li>de primers y/o productos </li></ul><ul><li>inespecíficos). </li></ul>
  10. 10. Beacons moleculares El Fluoróforo emite señal cuando el agente bloqueador (Quencher) se encuentra alejado por efecto de la hibridación a la secuencia target
  11. 11. TaqMan PCR : generación de señal por hidrólisis de sonda. FAM : maxima emisión a 535 nm TAMRA : máxima absorción a 560nm
  12. 12. FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
  13. 13. HARDWARE & SOFTWARE SOFTWARE
  14. 14. Ventajas del PCR en tiempo real <ul><li>Simple y rápida (semi-automatizada). </li></ul><ul><li>No hay manipulación post-PCR: disminuye el riesgo de contaminación por amplicones. </li></ul><ul><li>Cuantificación precisa del DNA o RNA inicial. </li></ul><ul><li>Alta sensibilidad y especificidad </li></ul><ul><li>Discriminación de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve). </li></ul><ul><li>Detección de más de un producto específico en una misma reacción. </li></ul><ul><li>DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION LO CUAL PERMITE UN ANALISIS DE LA CINETICA DE REACCION </li></ul>
  15. 15. <ul><ul><li>En teoría el Producto (P) se incrementa exponencialmente con el # ciclos (n). </li></ul></ul><ul><ul><li>Depende del numero de copias templado iniciales (T) </li></ul></ul>
  16. 16. “ FASE PLATEAU” Sin embargo, reacciones con diferentes numero de copias iniciales llegan al mismo nivel de “plateau”
  17. 17. <ul><li>El producto de PCR no siempre se duplica con cada ciclo. </li></ul><ul><ul><li> E = eficiencia del PCR </li></ul></ul><ul><ul><li>Generalmente la eficiencia es de 80-90% </li></ul></ul><ul><ul><li>Los productos pequeños se amplifican con mayor eficiencia que los productos largos </li></ul></ul>PCR no es 100% eficiente
  18. 18. EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO
  19. 19. <ul><li>Factores limitantes en la eficiencia del PCR: </li></ul><ul><ul><li>- cantidad de cebadores disponibles </li></ul></ul><ul><ul><li>- actividad de la Taq DNA Polimerasa </li></ul></ul><ul><li>Plateau : no hay mayor incremento del producto </li></ul><ul><li>PCR Standard: Análisis de punto final (End point detection) Detección al final del total de ciclos por electroforesis en gel (en fase plateau) </li></ul>
  20. 20. CANTIDAD DE DNA (escala aritmética) vs. NUMERO DE CICLOS Los productos de amplificación no se detectan en los primeros ciclos porque están por debajo de la escala utilizada. Recién se observa la curva en los últimos ciclos hasta llegar a la fase de plateau.
  21. 21. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.
  22. 22. Escala aritmética
  23. 23. La misma reacción de PCR en escala logaritmica - se aproxima a la gráfica teórica. Según las curvas teóricas, se debe obtener una línea recta en la parte lineal de la reacción de PCR. En este caso entre ~20 a ~1500 unidades de fluorescencia arbitraria.
  24. 24. Analizando la misma región en una escala regular (aritmética), veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva. IMPORTANTE: se debe examinar la reacción de PCR mientras se encuentra en la fase lineal.
  25. 25. Para cada muestra, el software determina en qué ciclo, el valor de la fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Threshold). Este punto se denomina C T (Ciclo crítico / Threshold cycle). Este v alor es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas específicas en la muestra original. Valores de Threshold & C T
  26. 26. NTC: tubo control sin DNA templado RUIDO CONTROLES DE REACCION : ELIMINACION DE RUIDO
  27. 27. Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reacción. Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmica. Aún cuando el threshold estará cerca al fondo de la curva regular, deberá ser lo suficientemente alto para que los valores de fluorescencia sean debido a la amplificación y no al ruido. Grafica regular Grafica semi-logaritmica
  28. 28. Cuantificación de DNA o cDNA (colocando diluciones de la misma muestra) A menor concentración de la secuencia target en la muestra inicial, se necesitará mas ciclos para ser detectada, por lo tanto se obtienen valores de C T mayores para muestras mas diluidas .
  29. 29. El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentración resulta en una gráfica lineal, y debe presentar un alto coeficiente de correlación (>0.990).
  30. 30. <ul><li>Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en el DNA o cDNAs de la muestra </li></ul><ul><li>Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando productos pequeños </li></ul>PROBLEMAS PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.
  31. 31. CURVA DE DENATURACION Muesta el perfil de denaturación de los productos amplificados. (no se observan productos inespecíficos)
  32. 32. Una temperatura de denaturación diferente significa un producto diferente. Dímeros: menor temperatura de fusión. dímeros
  33. 33. PCR en tiempo real <ul><li>Detección y cuantificación utilizando reporteros fluorescentes. </li></ul><ul><li>Fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto del PCR. </li></ul><ul><li>Se puede realizar el análisis de varios targets a la vez (Multiplex) utilizando sondas marcadas con diferentes fluoróforos </li></ul>
  34. 34. <ul><li>Controles </li></ul><ul><li>Problemas de Inhibición - falsos negativos </li></ul><ul><li>Estándares internos (genes de referencia, control interno, control de carga, triplicados) </li></ul><ul><li>Optimización </li></ul><ul><li>Reproducibilidad </li></ul><ul><li>V alidación </li></ul><ul><li>Personal </li></ul><ul><li>Costos </li></ul>Otras consideraciones
  35. 35. APLICACIONES EN INVESTIGACION DNA : - Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas - Genotipificación de cepas o subespecies - Detección de mutaciones puntuales - Estudio de de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) - Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células iniciales en una muestra. RNA : - Detección de la expresión de genes - Efecto de mutaciones sobre la expresión - Análisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial - Cuantificación de la expresión
  36. 36. Detección de la expresión de genes (detección de mRNA) <ul><li>Perfíl de expresión génica en diferentes tipos celulares en adultos o durante el desarrollo /diferenciación </li></ul><ul><li>Cambios en la expresión génica en condiciones patológicas </li></ul><ul><li>Expresión génica en respuesta a estímulos: hormonas, citoquinas, etc… </li></ul><ul><li>Expresión génica en respuesta a la presencia de antígenos de patógenos </li></ul><ul><li>Efecto de drogas sobre el perfíl de expresión </li></ul>
  37. 37. APLICACIONES AL DIAGNOSTICO CLINICO <ul><li>Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos: </li></ul><ul><ul><li>Virales (carga viral, carga pro-viral) </li></ul></ul><ul><ul><li>Bacterianos </li></ul></ul><ul><ul><li>Protozoarios </li></ul></ul><ul><ul><li>Hongos </li></ul></ul><ul><li>Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos) </li></ul><ul><li>Detección de genes de resistencia – mejor elección de terapia </li></ul><ul><li>Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recaída) </li></ul><ul><li>Detección de marcadores tumorales </li></ul><ul><li>Estado del desarrollo / progresión de la enfermedad </li></ul>
  38. 38. DETECCION DE SNPs o DE MUTACIONES PUNTUALES
  39. 39. Células Madre y su diferenciación a Linaje Neuronal: Ejemplo de Cuantificación Relativa
  40. 41. La herencia epigenética es regula procesos como proliferación y diferenciación celular manteniendo estados transcripcionales (Modificada de Mohrmann y Verrijzer 2005) (Turner 2002) Modificación de la cromatina por complejos multi-ptoteícos que hidrolizan ATP Modificaciones covalentes de las histonas nucleosómicas ATP ADP NUCLEOSOMA
  41. 43. RNA interferencia 30 min en hielo y cultivo
  42. 44. Análisis de Melt
  43. 45. ACTINA OSA1 End-Point
  44. 47. Curva patrón BCR-ABL CUANTIFICACION ABSOLUTA Translocación (9,22) Segunda Derivada
  45. 49. Real Time PCR ejemplo de detección en embarazadas a partir de la sexta semana
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