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  • O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foramEm seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse.
  • O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.

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  • UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIATécnicas em Biologia Molecular
  • Técnicas em Biologia MolecularNo final da década de 50 os cientistas aprenderam acaracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares(DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.
  • Técnicas em Biologia Molecular•Clonagem•ELISA•PCR•Probind and Blotting (Western blotting)•Arrays•Oligonucleotídeos específicos View slide
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay View slide
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent AssayELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção deanticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste éusado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produçãode imunoglobulinas.
  • APLICAÇÕ ES• Doenç as infecciosas (HIV...)• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)•Identificaç ão de antígenos (hormô nio da gravides, alergia adrogas...)• Doenç as auto-imunes•Concentraç ão sé rica de anticorpos
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ouanticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantesde cultura.2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade deuma reação enzimática, permitindo assim a detecção dequantidades mínimas de uma substância em particular e comgrande confiabilidade.3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com umsubstrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógenoincolor, o qual então desenvolverá coloração dependente daconcentração de Ag/Ac pesquisados.
  • Componentes•Anticorpo ou Ag ligado•Enzima ativa•Substrato•Produtos solúveis 2 Enzyme-linked Ab Serum Ab Antigen
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poçosdispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qualAg/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo. http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Elementos necessários para a realização:2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado)– nos ensaios quantitativos6Amostras a serem testadas7Placa de poliestireno8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Agou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reaçãoenzimática, produz cor11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidadede cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores dedensidade óptica - DO)
  • http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
  • http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS•Vantagens•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidadesmínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas naordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.•Teste com alta especificidade (característica que indica que o testeem questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menorrisco de falsos-positivos.•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médioem comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS•Desvantagens•Necessidade de mão de obra especializada.•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, comexposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muitosusceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos deincubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
  • PRINCIPAIS TIPOS•INDIRETO: detecta principalmente Ac•DIRETO: detecta principalmente Ag•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular(monovalentes)•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando aação do fator reumatóide)
  • 1. ELISA INDIRETO 1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
  • ELISA INDIRETO1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac daamostra pesquisada.3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doençapesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo osnegativos.O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquelemomento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contatocom o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida. www.labimuno.org.br
  • ELISA INDIRETO1Aplicações na medicina humana e veterinária:2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde adetecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico daDoença de Chagas e da SIDA/AIDS.4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da LinfadeniteCaseosa e da Leishmaniose.5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à açãodo fator reumatóide.
  • www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
  • ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentraçãode Ag da amostra pesquisada.3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construçãode uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partirda reação de padrões com concentrações conhecidas do antígenoa ser dosado. A curva serve como padrão de comparação paradeduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
  • ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE•Aplicações na medicina humana e veterinária:•Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadorestumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecçãode antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina eem secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.•Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste dedetecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).•Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria dealimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nosalimentos).
  • www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
  • Gerações do ELISAHIV Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) trê ou squatro semanas apó s o contato.Quarta geraç ão já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV(a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janelaimunoló gica, podendo chegar a apenas duas semanas.Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado poroutros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detectaproteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
  • Os exames de anticorpos sã relatados como positivos ou negativos. oO desempenho destes exames é descrito em termos de:■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serãopositivos quando o HIV estiver presente.■especificidade — a percentagem dos resultados que serãonegativos quando o HIV nã estiver presente. oTodos os exames de diagnó stico tê limitaç õ e, algumas vezes, o m es,seu uso pode produzir resultados errô neos ou questioná veis.■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,quando, na verdade, nã está o .■falso negativo — os resultados nã identificam o HIV, que está opresente.
  • www.youtube.com/watch?v=elisaUb4vmt0