Teste elisa

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  • O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foramEm seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse.
  • O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.
  • Teste elisa

    1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIATécnicas em Biologia Molecular
    2. 2. Técnicas em Biologia MolecularNo final da década de 50 os cientistas aprenderam acaracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares(DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.
    3. 3. Técnicas em Biologia Molecular•Clonagem•ELISA•PCR•Probind and Blotting (Western blotting)•Arrays•Oligonucleotídeos específicos
    4. 4. ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
    5. 5. ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent AssayELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção deanticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste éusado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produçãode imunoglobulinas.
    6. 6. APLICAÇÕ ES• Doenç as infecciosas (HIV...)• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)•Identificaç ão de antígenos (hormô nio da gravides, alergia adrogas...)• Doenç as auto-imunes•Concentraç ão sé rica de anticorpos
    7. 7. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ouanticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantesde cultura.2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade deuma reação enzimática, permitindo assim a detecção dequantidades mínimas de uma substância em particular e comgrande confiabilidade.3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com umsubstrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógenoincolor, o qual então desenvolverá coloração dependente daconcentração de Ag/Ac pesquisados.
    8. 8. Componentes•Anticorpo ou Ag ligado•Enzima ativa•Substrato•Produtos solúveis 2 Enzyme-linked Ab Serum Ab Antigen
    9. 9. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poçosdispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qualAg/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo. http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
    10. 10. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Elementos necessários para a realização:2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado)– nos ensaios quantitativos6Amostras a serem testadas7Placa de poliestireno8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Agou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reaçãoenzimática, produz cor11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidadede cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores dedensidade óptica - DO)
    11. 11. http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
    12. 12. http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
    13. 13. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS•Vantagens•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidadesmínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas naordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.•Teste com alta especificidade (característica que indica que o testeem questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menorrisco de falsos-positivos.•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médioem comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
    14. 14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS•Desvantagens•Necessidade de mão de obra especializada.•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, comexposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muitosusceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos deincubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
    15. 15. PRINCIPAIS TIPOS•INDIRETO: detecta principalmente Ac•DIRETO: detecta principalmente Ag•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular(monovalentes)•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando aação do fator reumatóide)
    16. 16. 1. ELISA INDIRETO 1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
    17. 17. ELISA INDIRETO1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac daamostra pesquisada.3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doençapesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo osnegativos.O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquelemomento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contatocom o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida. www.labimuno.org.br
    18. 18. ELISA INDIRETO1Aplicações na medicina humana e veterinária:2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde adetecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico daDoença de Chagas e da SIDA/AIDS.4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da LinfadeniteCaseosa e da Leishmaniose.5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à açãodo fator reumatóide.
    19. 19. www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
    20. 20. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentraçãode Ag da amostra pesquisada.3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construçãode uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partirda reação de padrões com concentrações conhecidas do antígenoa ser dosado. A curva serve como padrão de comparação paradeduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
    21. 21. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE•Aplicações na medicina humana e veterinária:•Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadorestumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecçãode antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina eem secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.•Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste dedetecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).•Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria dealimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nosalimentos).
    22. 22. www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
    23. 23. Gerações do ELISAHIV Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) trê ou squatro semanas apó s o contato.Quarta geraç ão já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV(a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janelaimunoló gica, podendo chegar a apenas duas semanas.Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado poroutros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detectaproteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
    24. 24. Os exames de anticorpos sã relatados como positivos ou negativos. oO desempenho destes exames é descrito em termos de:■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serãopositivos quando o HIV estiver presente.■especificidade — a percentagem dos resultados que serãonegativos quando o HIV nã estiver presente. oTodos os exames de diagnó stico tê limitaç õ e, algumas vezes, o m es,seu uso pode produzir resultados errô neos ou questioná veis.■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,quando, na verdade, nã está o .■falso negativo — os resultados nã identificam o HIV, que está opresente.
    25. 25. www.youtube.com/watch?v=elisaUb4vmt0

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