Material para Aprendizaje Bioquimica
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Material para Aprendizaje Bioquimica Document Transcript

  • 1. Tabla de Contenidos 1.0 INTRODUCCIÓN AL MATERIAL DOCENTE 2.0 INSTRUCCIONES DE USO 3.0 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL: FOTOMETRÍA Y ENZIMOLOGÍA 3.1 INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 3.2 LA ESPECTROFOTOMETRÍA Y SU APLICACIÓN EN BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 3.2.1 LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA 3.2.2 APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA 3.2.3 ¿QUÉ ES ABSORBANCIA? 3.2.4 ¿QUÉ ES COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (Ɛ)? 3.2.5 ESPECTRO DE ABSORBANCIA Y LONGITUD DE ONDA DE MÁXIMA ABSORBANCIA 3.2.6 EL FOTÓMETRO (ESPECTROFOTÓMETRO) 3.2.7 ETAPAS PARA EL USO CORRECTO DE UN FOTÓMETRO 3.2.8 ¿QUÉ SON LAS TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS? 3.2.9 CURVA DE CALIBRACIÓN: CONSTRUCCIÓN, USO Y ANÁLISIS 3.2.9.1 ¿CÓMO SE PREPARA UNA CURVA DE CALIBRACIÓN? 3.2.9.2 ¿CÓMO GRAFICAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN? 3.2.9.3 LA INFORMACIÓN QUE PROPORCIONA LA CURVA DE CALIBRACIÓN 3.2.10 EL FACTOR DE CALIBRACIÓN 3.2.11 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA PROBLEMA 3.2.12 AUTOEVALUACIÓN SOBRE FOTOMETRÍA 3.2.13 RESPUESTAS DE LA AUTOEVALUACIÓN SOBRE FOTOMETRÍA 3.3 LA ENZIMOLOGÍA Y SU APLICACIÓN EN BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 3.3.1 INTRODUCCIÓN 3.3.1.1 ¿POR QUÉ ESTUDIAR LAS ENZIMAS? 3.3.1.2 ¿POR QUÉ LAS CÉLULAS NECESITAN DE LAS ENZIMAS? 3.3.1.3 PREGUNTAS BÁSICAS SOBRE DE UNA ENZIMA 3.3.1.4 ¿QUÉ DEBEMOS CONOCER ANTES DE ESTUDIAR UNA ENZIMA? 3.3.1.5 ¿CUÁL ES LA FUENTE U ORIGEN DE LA ENZIMA EN ESTUDIO? 3.3.2 EL ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.3 ¿CUÁLES SON LAS ETAPAS DEL ENSAYO ENZIMÁTICO? 3.3.4 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE UN ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.4.1 ¿QUÉ PODEMOS DEDUCIR DE LA TABLA DE UN PROTOCOLO EXPERIMENTAL? 3.3.4.2 PREGUNTAS SOBRE UN PROTOCOLO EXPERIMENTAL 3.3.4.3 RESPUESTAS A LAS PREGUNTAS SOBRE LA TABLA N° 3.3.1 3.3.5 CONTROLES DE UN ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.6 LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.7 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Y DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD ENZIMÁTICA 3.3.8 EL EFECTO DE LA TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIÓN EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.9 LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO 3.3.10 LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE UNA ENZIMA 3.3.10.1 ¿CÓMO OBTENER LOS VALORES DE KM y VMAX DE UNA ENZIMA? 3.3.11 AUTOEVALUACIÓN SOBRE ENZIMOLOGÍA 3.3.12 RESPUESTAS AUTOEVALUACIÓN ENZIMOLOGÍA
  • 2. Figuras FIGURA N° 3.2.1: ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO FIGURA N° 3.2.2:ESPECTROGRAMA DE ABSORCIÓN DE PIGMENTOS DE UNA CIANOBACTERIA FIGURA N° 3.2.3:ESQUEMA SIMPLIFICADO DE UN FOTÓMETRO FIGURA N° 3.2.4:CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN FOTOMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN CON ALMIDÓN FIGURA N° 3.3.1:GRÁFICO DE LOS DOBLES RECÍPROCOS O LINEWEAVER-BURK, PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE KM Y VMAX DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA Tablas TABLA N° 3.2.1:CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA TÉCNICA FOTOMÉTRICA DEL IODO Y DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN (K) TABLA N° 3.3.1:PROTOCOLO EXPERIMENTAL SIMPLIFICADO PARA UN ENSAYO ENZIMÁTICO TABLA N° 3.3.2:DATOS EXPERIMENTALES PARA LA DETERMINACIÓN DE VMAX Y KM DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA
  • 3. 1.0 INTRODUCCIÓN AL MATERIAL DOCENTE El propósito central de este material docente es que sea una herramienta de apoyo directo a los estudiantes de Bioquímica y otras disciplinas de las Ciencias Biológicas. Este libro está organizado en dos capítulos: Bioquímica Experimental y Metabolismo. Ambos capítulos contienen materiales teóricos y prácticos que están incorporados en las asignaturas de Bioquímica que imparte el Grupo de Bioquímica de la Universidad de Antofagasta. Por ello, se espera que sean de alta utilidad y apoyo complementario. El capítulo Bioquímica Experimental está organizado en dos módulos de alta aplicación en las sesiones de docencia realizadas en el laboratorio. El primero se focaliza en las técnicas fotométricas y el segundo en enzimología. Los módulos contienen una discusión breve sobre los términos y conceptos involucrados en cada temática y guían al alumno en los experimentos; por ejemplo, para determinar la concentración desconocida de una molécula de interés en solución o en la determinación de la actividad de una enzima. El capítulo Metabolismo contiene el módulo Catabolismo de la Glucosa, que se inicia con analizando antecedentes teórico-prácticos sobre los procesos metabólicos y, usando como modelo la degradación de la molécula de glucosa, guía a los alumnos a través de las diversas alternativas metabólicas que dispone la célula para extraer parte de la energía química de la glucosa. Cada módulo cuenta con preguntas incorporadas en el texto con el objetivo de incentivar al alumno a buscar respuestas en otras fuentes de información, y Autoevaluaciones que permiten al alumno descubrir su grado de conocimiento y, al contar con las repuestas, le permitan superar errores conceptuales. Benito Gómez Silva, Ph.D. Depto. Biomédico Facultad Ciencias de la Salud Universidad de Antofagasta Antofagasta, julio de 2012
  • 4. 2.0 INSTRUCCIONES DE USO Este libro docente ha sido editado bajo el formato abierto epub que es utilizado para la distribución de libros electrónicos – ebook. Para obtener todas las ventajas de utilización del libro el usuario tiene a su disposición varias aplicaciones que puede descargar de forma gratuíta en la web, aquí un listado para descarga: Adobe Digital Editions http://www.adobe.com/products/digitaleditions/ Aquí debes registrarte para descargar. Calibre http://calibre-ebook.com/ EpubReader para Firefox https://addons.mozilla.org/en-US/firefox/addon/epubreader/ Mobipocket http://www.mobipocket.com/en/DownloadSoft/ProductDetailsReader.asp Entre las ventajas de estas aplicaciones están: Mantener una biblioteca Tamaño flexible del contenido Introducir comentarios o marcadores al texto Convertir a otro formato Comprar libros Compartir con amigos Otra importante característica es que el libro se adapta multiples plataformas como Pcs, Mac, celulares, y tablets. Disfruta el libro. Milton Urrutia Editor.
  • 5. 3.0 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL: FOTOMETRÍA Y ENZIMOLOGÍA 3.1 INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Estimados alumnos, la Bioquímica es una disciplina científica experimental y cuantitativa que proporciona información clave sobre la gran variedad de moléculas orgánicas e inorgánicas y reacciones enzimáticas involucradas en los diversos procesos biológicos que ocurren en los seres vivos. Para incrementar nuestro conocimiento sobre los procesos biológicos y alguna de sus etapas, la investigación bioquímica a nivel de laboratorio requiere que el Bioquímico resuelva, entre muchas otras, las siguientes dos preguntas: 1. ¿Cómo medir la concentración de moléculas tan importantes como proteínas, ácidos nucléicos, ATP, glucosa o glicógeno, en un tejido, en un cultivo de bacterias, en un extracto celular u otro modelo de estudio? 2. ¿Cómo estudiar y comparar las propiedades y función de las enzimas? Las respuestas son, respectivamente: “mediante la aplicación de una técnica espectrofotométrica”. “mediante la aplicación de un ensayo enzimático”. Es interesante indicar que ambas respuestas abren un camino experimental de gran utilidad para enseñar la Bioquímica a alumnos de pregrado como ustedes; es decir, el conocimiento y manejo de los temas desarrollados en las clases se fortalece con la aplicación de algunos procedimientos fotométricos y ensayos enzimáticos en el laboratorio. A continuación, les proporcionaremos antecedentes teóricos y prácticos sobre estas dos importantes técnicas experimentales.
  • 6. 3.2 LA ESPECTROFOTOMETRÍA Y SU APLICACIÓN EN BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Para intentar entender por qué la fotometría es importante en el trabajo experimental en Bioquímica, primero contestemos la siguiente pregunta: ¿qué es espectrofotometría (o fotometría)? Algunas sustancias orgánicas tienen la capacidad de absorber parte la energía contenida en la luz visible o ultravioleta que incide sobre ellas y la Espectrofotometría es una herramienta experimental que permite cuantificar la cantidad de energía luminosa absorbida por la molécula en estudio, o un derivado de ella. Antes de seguir adelante, vale recordar que la aplicación de esta técnica involucra la interacción entre la materia (moléculas y sus átomos) con la luz o radiación electromagnética, de modo que detengámonos un momento para asegurarnos que entendemos lo suficiente sobre esta forma de energía.
  • 7. 3.2.1 LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Luz es un término coloquial que se usa para referirse a la Radiación Electromagnética de origen natural (el Sol y otras fuentes del espacio exterior) o de origen artificial (lámparas). La radiación electromagnética es energía radiante que posee una naturaleza dual: de onda y corpuscular (quantum o fotón). Entonces, la luz es energía concentrada en corpúsculos llamados fotones que no tienen masa y viajan en forma de ondas. El contenido energético de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda. Las ondas de luz poseen un largo o longitud de onda (λ) específica, que se expresa en nanómetros (1 nm = 10-9 m); por tanto, una luz o radiación roja de 780 nm es evidentemente distinta de una radiación verde de 525 nm. Adicionalmente, una radiación monocromática es aquella con una λ específica o un rango estrecho de longitudes de onda; en cambio, una luz o radiación policromática posee un conjunto de radiaciones que cubren un amplio rango de diferentes longitudes de onda; por ejemplo, la luz blanca o visible, es luz policromática debido a que está constituida por un conjunto de radiaciones en el rango 380 – 820 nm, aproximadamente. La FIGURA N° 3.2.1 muestra un esquema del Espectro Electromagnético. Este corresponde a un ordenamiento de todos los tipos de radiaciones electromagnéticas que existentes en la Naturaleza. Este ordenamiento se realiza de acuerdo a las longitudes de onda o la frecuencia de cada radiación (recordemos que la frecuencia indica el número de máximos de una onda que pasan por un punto por unidad de tiempo; en otras palabras, ciclos por segundo). Aún cuando no está explícitamente indicado en la FIGURA N° 3.2.1, las radiaciones se ordenan de acuerdo al contenido energético de sus fotones, que va disminuyendo de izquierda a derecha. Es interesante notar en este espectro que la Luz Blanca o Luz Visible sólo ocupa un pequeño rango entre aproximadamente 400 nm a 700 nm. Radiaciones como los rayos X y los rayos gama, que sabemos que son muy peligrosas para los seres vivos, se denominan radiaciones ionizantes. Los fotones de este tipo de radiaciones poseen un contenido energético tan alto que al ser absorbidos por los electrones de una molécula, ellos se pierden y la molécula resultante queda ionizada. Recuerde que una molécula ionizada es altamente reactiva y puede originar nuevas reacciones y daño celular.
  • 8. FIGURA N° 3.2.1 ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO Esta figura organiza e incluye todas las radiaciones electromagnéticas conocidas, de acuerdo a sus frecuencias y longitudes de onda. La zona coloreada es ampliada para mostrar las longitudes de onda y colores de las radiaciones que componen la luz visible. Listado de las longitudes de onda, frecuencias y energías aproximadas de las regiones del espectro electromagnético. Radiación Longitud de onda (m) Frecuencia (Hz) Energía (J) Radio > 1 x 10-1 < 3 x 109 < 2 x 10-24 Microondas 1 x 10-3 - 1 x 10-1 1 3 x 109 - 3 x 101 1 2 x 10-24- 2 x 10-22 Infrarroja 7 x 10-7 - 1 x 10-3 3 x 101 1 - 4 x 101 4 2 x 10-22 - 3 x 10-1 9 Visible 4 x 10-7 - 7 x 10-7 4 x 101 4 - 7.5 x 101 4 3 x 10-1 9 - 5 x 10-1 9 UV 1 x 10-8 - 4 x 10-7 7.5 x 101 4 - 3 x 101 6 5 x 10-1 9 - 2 x 10-1 7 Rayos X 1 x 10-1 1 - 1 x 10-8 3 x 101 6 - 3 x 101 9 2 x 10-1 7 - 2 x 10-1 4 Rayos Gama < 1 x 10-1 1 > 3 x 101 9 > 2 x 10-1 4 Revise las siguientes páginas web, donde hemos obtenido este material: http://www.absoluteastronomy.com/topics/Electromagnetic_radiation http://imagine.gsfc.nasa.gov/docs/science/know_l1/spectrum_chart.html
  • 9. 3.2.2 APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA Existen claramente dos aplicación para espectrofotometría: Aplicación Cuantitativa. Permite calcular la concentración desconocida de moléculas disueltas en una solución, mediante el uso de técnicas fotométricas. Aplicación Cualitativa. Apoya la identificación de algunos compuestos mediante el uso de sus espectros de absorción. La aplicación de la espectrofotometría es de gran interés y utilidad en el estudio de biomoléculas coloreadas o pigmentos; por ejemplo, carotenoides, antocianinas, clorofilas, entre otros. Sin embargo, las moléculas no coloreadas también pueden ser estudiadas por técnicas espectrofotométricas, como lo veremos más adelante (ver Técnicas Fotométricas). La Espectrofotometría está basada en la medición de la absorbancia de una sustancia en solución; por tanto, es necesario intentar entender el significado del fenómeno de la absorción de luz por parte de una molécula y los espectros de absorción (o espectrogramas de absorción).
  • 10. 3.2.3 ¿QUÉ ES ABSORBANCIA? La interacción entre la luz y la materia involucra una serie de fenómenos ópticos, que no discutiremos aquí, con la excepción de la absorción y transmisión de luz. A continuación, les proporcionamos tres intentos para explicar y analizar el significado de la absorción de luz por parte de una sustancia en solución. PRIMER INTENTO La absorbancia (A) es una medida de la cantidad de energía de una radiación monocromática capturada por una molécula en solución. Su valor numérico es adimensional (sin unidades). Años atrás, se utilizaba el término Densidad Óptica (DO) para referirse a este fenómeno óptico, pero ha sido remplazado por el término absorbancia en el lenguaje científico actual. El valor de la absorbancia de un compuesto en solución es: (1) directamente proporcional a la concentración (C) de la substancia absorbente, (2) directamente proporcional al largo (L) o grosor de la solución que es atravesada por la luz, (3) es proporcional a una constante denominada coeficiente de extinción (Ɛ), cuyo valor depende de la longitud de onda (λ) de la luz monocromática incidente usada. Lo anterior es resumido por la Ecuación de Lambert-Beer: A = Ɛ • L • C. SEGUNDO INTENTO Supongamos que una solución que contiene el compuesto en estudio es iluminada con luz monocromática (luz incidente) con una intensidad I0. Algunos fotones incidentes serán absorbidos y otros cruzarán la solución. La luz que cruzó y no fue absorbida es la luz transmitida y tendrá una intensidad IT. Evidentemente, luego que parte de la luz monocromática incidente (I0) es absorbida por una sustancia en solución, la intensidad de la luz transmitida (IT) será menor que I0. Matemáticamente, podemos definir a la Transmitancia (T) de la solución como la relación IT/I0 y definirla como la medida de la luz o radiación que no fue absorbida por la molécula en estudio. T es una razón entre la intensidad de la luz trasmitida dividida por la intensidad de la luz incidente; por ello es una medición adimensional. De lo anterior, se puede deducir que el valor mínimo y máximo de T son 0 y 1, respectivamente. Cuando T = 0, la solución absorbe totalmente la radiación incidente. Cuando T = 1, la solución no absorbe la radiación incidente. Los valores intermedios de T, entre 0 y 1, son valores decimales. Para evitar trabajar con decimales, se definió el porcentaje de transmitancia: %T. Por ejemplo, si %T = 30, la solución ha absorbido el 70% de la luz incidente y ha transmitido el 30% de ella; si %T = 100, la solución es transparente a la luz incidente y no la absorbe. Los estudios de Lambert y Beer y los anteriores a ellos, permitieron deducir la siguiente relación: IT = I0 x 10 - Ɛ•L•C . En ella, los términos Ɛ, L y C se localizan en un exponente negativo. Esto permite deducir que el aumento de cualquiera de ellos hará disminuir exponencialmente el valor de IT. Lo anterior puede ser planteado de la siguiente manera, que puede ser un poco más difícil de entender: la luz transmitida a través de una solución disminuirá exponencialmente si la concentración de la sustancia absorbente aumenta linealmente. Al aplicar logaritmos a la relación IT = I0 x 10 - Ɛ•L•C , el resultado es log (I0 / IT) = Ɛ • L • C. La relación log (I0 / IT) se define como la absorbancia (A) de la solución. Ya que A es una razón de intensidades, su valor no tendrá unidades. Lo mismo ocurre y es aplicable a transmitancia T= IT/I0. Absorbancia y Transmitancia están matemáticamente relacionadas por medio de la relación: A = 2 – log %T y, por tanto, se puede calcular el valor de una si se conoce el valor de la otra. Un fotómetro es el equipo en que podemos medir tanto %T como la absorbancia de la solución en estudio.
  • 11. TERCER INTENTO También, el fenómeno de absorción de la luz puede ser explicado a nivel atómico: En una molécula absorbente, la energía del fotón de luz incidente es capturada por un electrón localizado en un orbital específico, alrededor del núcleo atómico. Luego que la energía del fotón ha sido absorbida por el electrón, este puede alejarse del núcleo atómico, a un orbital más externo, pero sigue siendo parte de la molécula absorbente. Debido a ello, se dice que la molécula absorbente alcanza un “estado electrónico excitado”, que posee una corta vida media (aprox. 10-1 2 seg). Una vez transcurrido tan corto período, la molécula excitada pierde la energía absorbida y el electrón involucrado regresa a las cercanías de su orbital original y se dice que la molécula regresa a su “estado electrónico basal”. Parte de la energía absorbida es liberada como (i) energía calórica al medioambiente o (ii) es emitida como un fotón de luz de mayor longitud de onda (fenómenos de fluorescencia o fosforescencia). Regresando a la Ecuación de Lambert y Beer (A = ε • L • C), el significado de L y C es fácil de entender, pero no así el significado del coeficiente de extinción. Avancemos un poco más y veamos cuál es el significado de ε.
  • 12. 3.2.4 ¿QUÉ ES COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (Ɛ)? Este término fue usado anteriormente cuando analizábamos el significado de la absorbancia. Ɛ es una constante propia de la de substancia absorbente, cuyo valor numérico depende de la longitud de onda de la luz incidente y de la naturaleza química del solvente en que está disuelta la substancia en estudio; es decir, el valor numérico de Ɛ cambia al modificarse la luz incidente y/o el solvente de la solución. El valor máximo de Ɛ se obtiene cuando la solución con la substancia en estudio, es iluminada con la luz monocromática en que la substancia presenta la mayor o máxima absorbancia (λ MAX). Por tanto, el valor de Ɛ disminuye a medida que se usan radiaciones con longitudes de onda inferiores o superiores a λMAX. (Ver “Espectro de Absorbancia”, más adelante, para entender el significado de λMAX). ¿Cuáles son las unidades del coeficiente de extinción? Usando la ecuación de Lambert-Beer (A = Ɛ • L • C), podemos determinar las unidades de Ɛ: Primero, expresemos L en cm y C en moles/litro. Segundo, reordenemos la ecuación de la siguiente forma: Ɛ = A / L • C Tercero, las unidades de Ɛ serán 1 / cm • (mol/litro). El numerador es 1, ya que A es adimensional. Cuarto, las unidades pueden ser modificadas, considerando que un mol puede ser reemplazado por moléculas (un mol es el número de Avogadro de moléculas) y litro se reemplaza por cm3 (1.000 cm3 son un litro). Lo anterior nos lleva a que el coeficiente de extinción tiene las siguientes unidades: 1/ cm • (molécula/cm3). Finalmente, al reordenar esa fracción, las unidades de Ɛ son: cm2/ molécula. La conclusión que se desprende de este ejercicio es la siguiente: El coeficiente de extinción de una molécula es el valor numérico de la medida de su capacidad para absorber luz de una determinada longitud de onda, y sus unidades indican la mayor o menor superficie que presenta dicha molécula al paso de los fotones que inciden sobre ella. En los análisis y discusiones anteriores se ha hecho referencia a la λMAX de una molécula absorbente; por tanto, veremos a continuación cómo se le puede medir.
  • 13. 3.2.5 ESPECTRO DE ABSORBANCIA Y LONGITUD DE ONDA DE MÁXIMA ABSORBANCIA La medición de absorbancia en las técnicas fotométricas se realiza normalmente usando luz monocromática de longitud de onda de máxima absorción de la sustancia en estudio. Para definir cuál es la longitud de onda de una substancia en solución en la que presenta una absorbancia máxima (λMAX), se debe preparar un Espectro de Absorbancia o Espectrograma de Absorción (ver FIGURA N° 3.2.2, que muestra el espectrograma de absorción obtenido de una cianobacteria de origen andino). Experimentalmente, el Espectro de Absorbancia de una sustancia se obtiene midiendo el valor de absorbancia para cada una de las radiaciones monocromáticas de un rango predefinido: luz visible, luz UV o ambas. La solución, que contiene la substancia en estudio, está en una cubeta o tubo fotométrico y la absorbancia se registra en un fotómetro, para cada λ usada. Luego, se prepara un gráfico (A versus λ), con los datos de absorbancia para cada una de las longitudes de onda usada; este gráfico se denomina espectro o espectrograma de absorción. El espectrograma obtenido de esta manera mostrará la o las longitudes de onda con mayor absorbancia; evidentemente, aquella λ con mayor valor de A es λMAX (ver FIGURA N° 3.2.2). Bien, ahora es necesario conocer el instrumento que nos permite medir absorbancia o transmitancia de una sustancia en solución.
  • 14. FIGURA N° 3.2.2 ESPECTROGRAMA DE ABSORCIÓN DE PIGMENTOS DE UNA CIANOBACTERIA El microorganismo fue aislado de humedales alto-andinos de la Región de Antofagasta y los pigmentos fueron extraídos con acetona. El espectro de absorción permite identificar las longitudes de máxima absorbancia de los pigmentos extraídos. El máximo cercano a 670 nm corresponde a clorofila a. La zona de máximos de absorbancia entre 340 nm y 450 nm corresponde a diversos pigmentos (escitonemina, clorofila y carotenoides). Los máximos entre 550 nm y 650 nm corresponden a los pigmentos accesorios ficocianina y allo-ficocianina.
  • 15. 3.2.6 EL FOTÓMETRO (ESPECTROFOTÓMETRO) El fotómetro o espectrofotómetro es un instrumento que permite cuantificar la absorbancia (o transmitancia) de una substancia en solución, luego de ser irradiada con luz monocromática. Este equipo es de alto uso en Bioquímica Experimental y está constituido por componentes organizados en el siguiente orden: (ver FIGURA N° 3.2.3, que muestra un esquema con los componentes básicos de un fotómetro) Fuente de luz policromática: lámpara de luz visible (390-820 nm) o luz UV (190-390 nm). Monocromador: componente que recibe luz policromática y emite luz monocromática. Cubeta: reservorio que contiene la solución de la substancia en estudio. Detector: componente que recibe la luz transmitida desde la solución y traduce la energía transmitida en valores de absorbancia (o transmitancia). Existen diferentes tipos, volúmenes y formas de cubetas para el fotómetro pero, aquí nos centraremos en el material con que se construyen: cubetas de plástico, vidrio o cuarzo. La elección de la cubeta depende del rango de longitudes de onda en que se realizará la lectura de absorbancia de la substancia en estudio. Las cubetas de plástico, vidrio o cuarzo pueden ser usadas en trabajos en el rango visible del espectro electromagnético. Sin embargo, sólo la cubeta de cuarzo se debe utilizar para lecturas en el rango ultravioleta y, obviamente, cuando el trabajo incluye lecturas de absorbancia tanto en el rango UV como en el rango visible.
  • 16. FIGURA N° 3.2.3 ESQUEMA SIMPLIFICADO DE UN FOTÓMETRO El instrumento se compone básicamente de una fuente de luz (visible y/o UV), un monocromador (que recibe luz de un amplio espectro y emite una radiación de una longitud de onda fijada por el operador del equipo), una cubeta (de vidrio, plástico o cuarzo, usada para contener la muestra líquida en estudio) y un sistema de lectura (para recibir y convertir la luz transmitida en una señal eléctrica y traducirla en una lectura numérica). Esta lectura numérica puede representar la absorbancia o el % de transmitancia de la solución en estudio al ser iluminada con una radiación monocromática.
  • 17. 3.2.7 ETAPAS PARA EL USO CORRECTO DE UN FOTÓMETRO 1. Conectar el equipo a la red de 220 volts. 2. Precalentar el equipo. Se requiere que el fotómetro permanezca encendido por unos 10 minutos antes de usarlo; así, la temperatura de la lámpara llegará a un máximo, estabilizándose el espectro de la luz emitida. 3. Seleccionar la longitud de onda apropiada, según el protocolo en aplicación. 4. Calibración “0% T”: ajustar la lectura de %T a un valor de cero (0,00), en el modo de operación “transmitancia” y con el compartimento porta-cubeta cerrado y vacío. 5. Seleccionar la cubeta o tubo de fotómetro, en función de la longitud de onda de trabajo (vidrio o plástico para luz visible; cuarzo para luz visible y/o UV). 6. Calibración “100 %T”: ajustar la lectura de %T a un valor de 100, en el modo de operación “transmitancia”, con el compartimento porta-cubeta cerrado pero conteniendo el tubo o cubeta lleno con la solución “blanco colorimétrico”. 7. Lectura de absorbancia: el instrumento está calibrado con respecto a la longitud de onda pre-establecida y con respecto a la solución blanco; por lo tanto, se puede cambiar al modo de operación “absorbancia” e iniciar la lectura de los valores de absorbancia de cada una de las soluciones preparadas según el protocolo de la técnica fotométrica a usar. Me parece que hemos discutido algunos de los puntos centrales de la Fotometría, por lo que ahora nos corresponde aproximarnos a una de las aplicaciones más importantes: la obtención de la concentración desconocida de la sustancia en estudio, mediante la aplicación de una técnica fotométrica.
  • 18. 3.2.8 ¿QUÉ SON LAS TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS? Se entiende por Técnica Fotométrica al protocolo experimental, es decir, el conjunto de etapas, procedimientos y condiciones experimentales, que permite determinar la concentración desconocida de moléculas orgánicas o inorgánicas, disueltas en una solución o Muestra Problema, utilizando la Ley de Lambert-Beer. Moléculas como las proteínas y los ácidos nucléicos, poseen máximos de absorción en el rango de las radiaciones UV (280 nm y 260 nm, respectivamente) y la absorbancia se puede medir en un espectrofotómetro que disponga de una lámpara que emita luz UV. Por otra parte, la gran mayoría de las moléculas de interés biológico (proteínas, carbohidratos, nucleótidos, fosfato inorgánico y otras) son incoloras en solución y no es posible medir su absorbancia y; por tanto, no podemos medir la concentración de una muestra problema en el rango de la radiación visible (aprox. 400 – 700 nm). Para resolver esa dificultad, existen técnicas fotométricas diseñadas para determinar la concentración de substancias que son incoloras en solución y no presentan absorción en el rango visible (aún cuando algunas poseen máximos de absorbancia en el rango UV). Estas técnicas fotométricas requieren de un “truco” químico que consiste en tomar un volumen conocido de la solución que contiene a la molécula incolora (y cuya concentración se desea determinar) y agregar un exceso de uno o más reactivos para que, luego de reaccionar químicamente con la molécula en estudio, formen un producto final coloreado con un λMAX conocido. El exceso de reactivos permite que todas las moléculas del compuesto incoloro reaccionen y, por tanto, la concentración de las moléculas coloreadas formadas será proporcional a la concentración de las moléculas incoloras originales. De esta forma, la lectura de absorbancia del compuesto coloreado permite calcular su concentración (Ley de Lambert-Beer) que corresponderá a la concentración del compuesto incoloro original. (Ver: Determinación de la concentración de la muestra problema). La aplicación de una técnica fotométrica requiere del apoyo ineludible de una Curva de Calibración y es necesario que la molécula en estudio (o el derivado coloreado de ella) posea un máximo de absorbancia (λMAX) a una longitud de onda en el rango de las radiaciones visible (y/o ultravioleta). Por ello, debemos centrar ahora nuestra atención en la Curva de Calibración.
  • 19. 3.2.9 CURVA DE CALIBRACIÓN: CONSTRUCCIÓN, USO Y ANÁLISIS La Curva de Calibración de una técnica fotométrica es la representación gráfica de la relación entre absorbancia y concentración de la sustancia en estudio. De acuerdo a la Ecuación de Lambert-Beer (A = Ɛ • L • C), existe una relación lineal (directamente proporcional) entre las dos variables A y C, que se refleja gráficamente como una línea recta que nace, en la gran mayoría de los casos, en la intersección cero de los dos ejes (ver FIGURA N° 3.2.4, que muestra la curva de calibración usada en la determinación fotométrica de almidón). 3.2.9.1 ¿CÓMO SE PREPARA UNA CURVA DE CALIBRACIÓN? L a Curva de Calibración es una herramienta fundamental e ineludible en la aplicación correcta de una Técnica Fotométrica. Ella es preparada experimentalmente siguiendo un protocolo experimental, que considera las instrucciones, los pasos y condiciones que se deben cumplir. A continuación se resumen los pasos generales que se deben seguir en la construcción de una Curva de Calibración: 1. Preparar una batería de 4-6 tubos de ensayo conteniendo soluciones que forman una gradiente de concentración de la molécula en estudio. 2. Preparar una solución Blanco Colorimétrico, que sólo se diferencia de las anteriores en que no contiene la molécula en estudio (concentración cero). 3. Agregar los volúmenes necesarios de la o las soluciones de los reactivos a cada una de las soluciones anteriores. Esto permitirá la formación cuantitativa de un compuesto coloreado, según la molécula en estudio y la técnica fotométrica que se está aplicando. 4. Incubar las soluciones por el tiempo y temperatura que indicada la técnica. 5. Calibrar el fotómetro, usando la solución del tubo Blanco Colorimétrico. 6. Leer la absorbancia de cada una de las soluciones anteriores a la longitud de onda de máxima absorbancia del compuesto coloreado. 7. Graficar los datos de absorbancia versus concentración para obtener la Curva de Calibración de la técnica usada. 3.2.9.2 ¿CÓMO GRAFICAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN? Este es un gráfico muy simple de Absorbancia versus Concentración de la molécula en estudio. Para ello, se utilizan los datos de absorbancia y las concentración conocidas de las soluciones preparadas en la construcción de la Curva de Calibración (ver puntos 1 y 2 anteriores). La absorbancia es adimensional, los datos de A se localizan en el eje Y y la lectura se realiza a la longitud de onda indicada en el protocolo de la técnica fotométrica. La concentración se localiza en el eje X, pero usando unidades de concentración especiales que debemos explicar a continuación: los datos de concentración requieren que sepamos cuánta masa de la sustancia en estudio está en cada tubo. Para ello, es recomendable usar una unidad “artificial” de concentración: masa / tubo. “masa” se expresa generalmente en mg, µg, mmoles o µmoles de la sustancia en estudio. “tubo” representa al volumen final de los tubos usados en la confección de la Curva de Calibración y del tubo de la Muestra Problema. Todos estos tubos poseen el mismo volumen y no es necesario para los cálculos posteriores (incluido el cálculo de la concentración desconocida en la Muestra Problema). Ver TABLA N° 3.2.1, que muestra los datos necesarios para graficar una curva de calibración y determinación del factor de calibración; ver FIGURA N° 3.2.4 con la curva generada con los datos de la TABLA N° 3.2.1. 3.2.9.3 LA INFORMACIÓN QUE PROPORCIONA LA CURVA DE CALIBRACIÓN
  • 20. La Curva de Calibración de una Técnica Fotométrica permite lograr tres objetivos de gran importancia experimental: 1. Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer La formación de una línea recta demuestra que la Ley de Lambert-Beer “es obedecida o se cumple”, bajo las condiciones experimentales usadas en su confección y, por tanto, es válida para determinar la concentración desconocida en una solución del compuesto de interés. Este es un punto muy importante, ya que la aplicación de una misma técnica fotométrica en dos o más laboratorios distintos, puede originar variaciones en los valores de lectura de absorbancia, debido a diferencias en la calidad del agua usada, en la calidad y origen de los reactivos y entre las personas que aplican la técnica. 2. Rango de Trabajo La línea recta resultante permite identificar los rangos de absorbancia y de concentración en los que la Ley de Lambert-Beer se cumple. Ellos son los rangos válidos en que se debe calcular la concentración desconocida de la Muestra Problema; es decir, la absorbancia de la Muestra problema debe estar en dicho rango. 3. Factor de Calibración Corresponde a la constante K que se obtiene al multiplicar el Coeficiente de Extinción por el largo del paso de luz a través de la cubeta (K = Ɛ • L), de modo que la ecuación de Lambert-Beer queda expresada como A = K • C.
  • 21. FIGURA N° 3.2.4 CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN FOTOMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN CON ALMIDÓN La técnica fotométrica del iodo/ioduro se aplicó a una batería de tubos que contienen concentraciones conocidas de almidón. Luego de leer la absorbancia a 620 nm de cada tubo, se prepara el gráfico Absorbancia versus Concentración y se traza la mejor recta (aquella que pasa por todos o la mayoría de los puntos). El valor del Factor de Calibración se puede obtener calculando la pendiente de la recta o determinando el valor promedio de las razones A/C de cada tubo usado para trazar la mejor recta.
  • 22. TABLA N° 3.2.1 CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA TÉCNICA FOTOMÉTRICA DEL IODO Y DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN (K) La FIGURA N° 3.2.4 se confeccionó con los datos de esta tabla, se generó una línea recta que pasa por el origen y todos los puntos forman parte de la recta. En consecuencia, el Factor de Calibración K de la técnica puede ser determinado matemáticamente como el promedio de las razones A/C. Así, el valor de K es 7,4 x 10-4 (µg/tubo)-1 . TUBO N° CONCENTRACIÓN (µg/tubo) ABSORBANCIA (A620) RAZÓN A/C 1 0 0 - 2 50 0.04 0,0008 3 125 0.095 0,00076 4 250 0.19 0,00076 5 375 0,27 0,00072 6 500 0,34 0,00068
  • 23. 3.2.10 EL FACTOR DE CALIBRACIÓN El Factor de Calibración (K = Ɛ • L o K = A / C) de una técnica fotométrica es absolutamente necesario para determinar la concentración desconocida de la molécula en estudio, mediante la Ecuación de Lambert-Beer. (Ver: Determinación de la concentración de la muestra problema; más abajo) El valor de K para una Técnica Fotométrica se puede calcular de dos modos: (i) como el promedio de los valores de las razones A/C de cada uno de los puntos experimentales que forman la recta de la Curva de Calibración de la técnica (ver TABLA N° 3.2.1 y FIGURA N° 3.2.4). (ii) como el valor de la pendiente de la recta de la Curva de Calibración. Ya que K = A/ C, las unidades de K corresponden al inverso de las unidades de concentración usadas, esto es: tubo/masa o (masa/tubo)-1 . Los datos de la TABLA N° 3.2.1 nos permiten calcular un valor de K = 0.00074 (µg/tubo)-1 . Basados en la información entregada hasta ahora, a continuación discutiremos cómo se pude llegar a conseguir el valor de la concentración desconocida de una Muestra Problema.
  • 24. 3.2.11 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA PROBLEMA Para determinar la concentración del compuesto en estudio mediante una Técnica Fotométrica, es necesario preparar una Curva de Calibración y una Muestra Problema. La Muestra Problema es una solución que contiene todos los componentes usados en la preparación de los tubos de la Curva de Calibración, más una alícuota de volumen conocido de la solución que contiene el compuesto cuya concentración se desea conocer. El tubo que contiene la Muestra Problema se somete, en paralelo, a las condiciones que se aplican a todos los tubos con los que se confecciona la Curva de Calibración y su absorbancia se lee a la longitud de onda de máxima absorbancia del compuesto coloreado. Para determinar el valor de la concentración de una substancia en una solución problema mediante una técnica fotométrica, se utiliza la ecuación modificada de Lambert-Beer (A=K•C) en la forma de C = A / K, donde se remplazan los valores de K, obtenido de la curva de calibración, y el de A de la muestra problema. Ya que las unidades de K son (masa/tubo)-1 , la concentración que se obtiene de la razón A/K corresponderá a la cantidad de masa de la sustancia en estudio que está en el tubo de la muestra problema, pero… ¡esto no significa que ya hemos calculado la concentración desconocida! Para obtener el valor de concentración de la solución de la sustancia en estudio, es necesario incorporar en los cálculos, el volumen de la alícuota usada en la preparación de la solución de Muestra Problema (Ver: 3.2.9 Curva de Calibración). La masa por tubo calculada anteriormente corresponde a la cantidad de la sustancia en estudio que estaba contenida en la alícuota usada; por tanto y mediante un razonamiento basado en una “regla de tres”, podemos calcular la cantidad de la sustancia en un volumen más apropiado; por ejemplo, en un ml, en 100 ml o en un litro de la muestra problema. Así, podemos expresar el resultado final en unidades estándares de concentración: % p/v, concentración molar o en alguno de sus derivados (mg% p/v, mM, µM). Finalmente, si la alícuota de muestra problema proviene de una dilución de la muestra problema original, será necesario considerar el factor de dilución para calcular la concentración final de la muestra problema original. Hemos llegado al final del tema sobre Fotometría y ahora le invito a realizar el Test de Autoevaluación N° 3.2.12: Módulo Fotometría.
  • 25. AUTOEVALUACIÓN SOBRE FOTOMETRÍA 1. ¿Qué es luz monocromática? 2. ¿Qué es radiación ionizante? 3. ¿Qué es luz visible? 4. ¿Cuál es la relación entre contenido energético de un fotón y su longitud de onda? 5. ¿Qué es la longitud de onda de máxima absorbancia de una sustancia en solución? 6. ¿Cómo se realiza y qué información entrega un espectrograma o espectro de absorción? 7. ¿Puede un compuesto en solución que absorbe luz UV, absorber en el rango de luz visible? 8. ¿Todos los compuestos químicos en solución absorben luz visible? ¿Por qué? 9. ¿Cuál es el máximo de absorción de las proteínas y de los ácidos nucléicos? 10. ¿Por qué las proteínas y los ácidos nucléicos poseen esos máximos de absorción? 11. ¿Cuál es la ecuación básica de la Ley de Lambert-Beer? 12. ¿Cuál es el significado de cada uno de los componentes de dicha ecuación? 13. ¿Qué información proporciona el coeficiente de extinción de un compuesto? 14. ¿De qué manera se puede alterar el coeficiente de extinción de un compuesto? 15. ¿Por qué se dice que el coeficiente de extinción de una sustancia es un valor constante? 16. ¿Cuál o cuáles variables afectan el valor de la absorbancia de una solución? 17. ¿Cuáles son y qué rol cumple cada componente de un fotómetro? 18. ¿Qué es el factor de calibración de un método fotométrico? 19. ¿Cuál es la forma de calcular el factor de calibración? 20. ¿Cómo se prepara una curva de calibración? 21. ¿Para qué se prepara una curva de calibración? 22. ¿Cuándo una técnica fotométrica obedece la Ley de Lambert-Beer? 23. ¿Qué es el rango óptimo de un procedimiento fotométrico? 24. ¿Cómo se mide fotométricamente la concentración de una sustancia que no absorbe luz visible? 25. ¿Por qué en un método fotométrico se mide la absorbancia a 540 nm?
  • 26. RESPUESTAS DE LA AUTOEVALUACIÓN SOBRE FOTOMETRÍA 1. Aquella radiación electromagnética de una o un rango muy corto de longitudes de onda. 2. Aquella radiación electromagnética cuyos fotones poseen la energía suficiente para ionizar a la molécula absorbente. 3. El conjunto de radiaciones electromagnéticas en el rango aproximado de 400 – 700 nm, que también se le conoce como luz blanca y corresponde a la radiación en que el ser humano puede ver. 4. Una relación inversamente proporcional. 5. Aquella longitud de onda en que la molécula presenta máxima absorción. 6. Un espectro de absorción es un gráfico que muestra la capacidad que tiene una molécula de absorber radiaciones electromagnéticas. En este gráfico se puede deducir cuál o cuáles longitudes de onda son las de máxima absorción. Para obtenerlo, se requiere medir la absorbancia de la solución de la substancia en estudio en un rango de diferentes longitudes de onda para luego, graficar absorbancia versus longitud de onda. 7. Si. Existe una variedad de compuestos que presentan la capacidad de absorber radiaciones electromagnéticas del rango visible y ultravioleta; por ejemplo, las proteínas. 8. No. Sólo aquellos compuestos con la organización electrónica adecuada pueden absorber fotones del rango de la luz visible. 9. Las proteínas presentan un máximo de absorbancia alrededor de 280 nm. Los ácidos nucléicos presentan un máximo de absorbancia alrededor de 260 nm. 10. Debido a la presencia de residuos aminoacídicos aromáticos y bases nitrogenadas en las proteínas y los ácidos nucléicos, respectivamente. 11. A = ε • L • C. 12. A: absorbancia; C: concentración, L: largo del paso de luz, (L) y ε: coeficiente de extinción. 13. El coeficiente de extinción (ε) de un compuesto es una constante (cuyo valor numérico depende de la longitud de onda y del solvente usado) que representa la capacidad de absorción de luz del compuesto. Lo anterior se hace evidente al analizar las unidades de la constante Ɛ, esto es, unidades de área/masa. 14. El coeficiente de extinción de una molécula puede alterarse si (a) cambiamos el solvente de la solución, (b) si cambiamos la longitud de onda de la luz incidente y (c) en algunos compuestos, su coeficiente de extinción cambia al cambiar el pH de la solución o aumentando la concentración del compuesto en estudio. 15. El coeficiente de extinción de una molécula es constante ya que, según la ecuación de Lambert-Beer, ε = A/L • C; esto es, el valor de Ɛ se obtiene dividiendo la absorbancia de una solución de la molécula en estudio por L • C. Cambios en L y/o en C llevan a cambios proporcionales en A, de modo que siempre se obtendrá en mismo valor para ε. 16. La absorbancia de una solución se debe a que contiene ella un compuesto absorbente; por lo tanto y según la ley de Lambert-Beer, el valor de A cambiará cuando (a) cambie la concentración del compuesto, (b) si se cambia el largo L de la cubeta y (c) si se cambia la longitud de onda en que se realiza la lectura de A. 17. Lámpara: proporciona luz policromática (visible o ultravioleta); Monocromador: componente que filtra la luz de la lámpara y entrega luz monocromática; Detector: sistema complejo que captura los fotones de luz transmitida, la convierte en una corriente eléctrica que la traduce en un valor de absorbancia o transmitancia de la solución en estudio. La cubeta es el reservoreo que contiene la solución en estudio y podría ser considerada parte del equipo o un accesorio. 18. El factor de calibración de un método fotométrico es una constante (K) que reemplaza a ε • L en la ecuación de Lambert-Beer, cuando todas las lecturas de A se realizan con una cubeta de largo definido (por ejemplo, 1 cm). 19. El valor del factor de calibración de un método fotométrico puede ser calculado de dos maneras: (a) determinando el valor de la pendiente de la recta del gráfico A vs C (curva de calibración), y (b) primero, determinando la razón “A/C” de cada tubo usado en la confección de la curva de calibración pero que sea parte de la recta de dicho gráfico y, segundo, calcular el valor promedio de las razones “A/C” anteriores. 20. La curva de calibración de un método fotométrico es la representación gráfica del efecto de diferentes concentraciones de un compuesto en solución en su absorbancia, al ser irradiado con luz monocromática. Así, esta curva se construye preparando una batería de tubos con concentraciones crecientes del compuesto, se leen los valores de A para cada uno de ellos y se prepara el gráfico con los valores de A vs C. 21. Tres razones: (1) para demostrar que en las condiciones experimentales usadas, la ecuación de Lambert-Beer es obedecida (se cumple), (2) para definir los rangos de concentración del compuesto en estudio y los rangos de absorbancia en que la ley de Lambert-Beer se cumple y, (3) para determinar el valor y unidades del factor de calibración del método fotométrico usado. 22. Cuando la relación entre A y C es lineal, reflejándose como una línea recta en el gráfico de la curva de calibración
  • 27. correspondiente. 23. En general, se entiende por “rango óptimo de un método fotométrico” al rango de absorbancias en que existe una relación directamente proporcional entre A y C; por lo tanto, la absorbancia de la muestra problema debe estar dentro de dicho rango para que el cálculo de la concentración sea válido. 24. Existen dos posibilidades para medir fotométricamente la concentración desconocida de una muestra problema: (1) que el compuesto de interés tenga un máximo de absorbancia en el rango UV o, (2) que exista un método fotométrico que incluya una o más reacciones químicas que finalmente permitan la formación de un compuesto coloreado derivado del compuesto en estudio. 25. Porque la sustancia en estudio o un derivado de ella presenta un máximo de absorbancia a 540 nm.
  • 28. 3.3 LA ENZIMOLOGÍA Y SU APLICACIÓN EN BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL El segundo tema que desarrollaremos en conjunto se relaciona con el estudio de las enzimas, dada su importancia en los procesos bioquímicos de la célula.
  • 29. 3.3.1 INTRODUCCIÓN 3.3.1.1 ¿POR QUÉ ESTUDIAR LAS ENZIMAS? Nuestro actual conocimiento sobre la Vida y sus procesos asociados indica que es prácticamente imposible imaginar que ella transcurra en ausencia de enzimas. Estas proteínas participan como catalizadores en la gran mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los seres vivos y, por tanto, están involucradas directamente en todos los procesos esenciales para la Vida. En consecuencia, si queremos entender el rol particular de las diversas reacciones químicas que realiza la célula, las enzimas son uno de los factores claves que debemos estudiar y conocer. El estudio de las enzimas en el laboratorio le permite al estudiante de Bioquímica saber cómo se mide su actividad, adquirir una visión real sobre la acción de las enzimas y analizar críticamente la literatura en que las enzimas están involucradas. 3.3.1.2 ¿POR QUÉ LAS CÉLULAS NECESITAN DE LAS ENZIMAS? El producto de una reacción enzimática es formado para resolver una necesidad de la célula; por tanto, se requiere que el producto se sintetice en el lugar correcto, en la cantidad adecuada y en el momento apropiado. Ello se logra si la enzima está en el compartimento celular adecuado y, debido a su actividad como catalizador de dicha reacción, la cantidad apropiada del producto se formará en un muy corto período. Si la reacción no es catalizada por la enzima, la velocidad de formación y la cantidad del producto no serán los adecuados a las necesidades de la célula. 3.3.1.3 PREGUNTAS BÁSICAS SOBRE DE UNA ENZIMA Consideremos que la siguiente reacción: S + E → P + E, es el modelo básico de una reacción enzimática simple. Entre las diversas preguntas que nos podemos plantear sobre las propiedades y características de una enzima, y que sean educativas para el estudiante de Bioquímica, podemos mencionar las siguientes: ¿Cuán estable es la enzima? ¿Cuál es y qué es la temperatura óptima de la enzima? ¿Cuál es y qué es el pH óptimo de la enzima? ¿Cuál es el efecto de usar diferentes cantidades de enzima en la reacción? ¿Cuál es el efecto de la concentración de sustrato en la actividad catalítica de la enzima? ¿Cuál es el valor de sus constantes cinéticas KM y VMAX? Estas y otras preguntas pueden ser resueltas mediante el desarrollo y aplicación de ensayos enzimáticos. 3.3.1.4 ¿QUÉ DEBEMOS CONOCER ANTES DE ESTUDIAR UNA ENZIMA? Para iniciar el estudio de una enzima se requiere (1) disponer de una fuente de la enzima (comercial o preparada en el laboratorio), (2) saber cuál es la reacción que ella cataliza (el o los sustratos, el o los productos) y (3) disponer de los métodos analíticos (por ejemplo, fotométricos) para cuantificar el incremento en la concentración del producto o la disminución de concentración del sustrato, luego de la aplicación del ensayo enzimático. 3.3.1.5 ¿CUÁL ES LA FUENTE U ORIGEN DE LA ENZIMA EN ESTUDIO?
  • 30. La enzima puede estar disponible en la forma de un producto de origen comercial o como un extracto enzimático en algún grado de purificación, a partir de alguna fuente procarionte o eucarionte apropiada. Generalmente, se requieren varias etapas para separar una enzima de otras proteínas presentes. Las técnicas utilizadas deben evitar los extremos de pH y temperatura y algunos solventes orgánicos, para que la enzima en estudio no pierda su actividad biológica por denaturación irreversible. Las técnicas más utilizadas para el aislamiento y purificación de enzimas aprovechan las propiedades físicas y químicas de las proteínas, tales como solubilidad (salting-out o salazón), peso molecular (cromatografía de exclusión), ionización (cromatografía de intercambio iónico) y carga eléctrica (electroforesis en geles de poliacrilamida), entre otras.
  • 31. 3.3.2 EL ENSAYO ENZIMÁTICO Ante la pregunta ¿cómo medir la actividad catalítica de una enzima in vitro?, la respuesta es “aplicando un ensayo enzimático”. El Ensayo Enzimático es el conjunto de condiciones y procedimientos experimentales que permiten cuantificar la velocidad de una reacción en presencia de la enzima. Los ensayos enzimáticos están organizados en la forma de un Protocolo Experimental. Las condiciones óptimas del ensayo enzimático serán aquellas en que la enzima muestra su mayor actividad catalítica, comparado con la misma reacción en ausencia de la enzima (control). Las variables y componentes más importantes del ensayo enzimático son: La concentración de enzima La concentración del sustrato El pH del medio de incubación La temperatura de incubación El tiempo de incubación La concentración de activadores o inhibidores (si están considerados) El agente químico y/o físico que permita detener la reacción en estudio. Uno o más controles Si, por ejemplo, se desea estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima, el diseño experimental debe considerar la temperatura como la variable independiente y la velocidad de la reacción como la variable dependiente. El efecto de una variable independiente debe ser estudiado separadamente del efecto de otras (pH, concentración de sustrato, de enzima o de inhibidor). Lo anterior se organiza en la forma de un Protocolo Experimental que ordena las etapas del ensayo enzimático (ver TABLA N° 3.3.1, que proporciona un ejemplo de un protocolo simplificado para un ensayo enzimático).
  • 32. 3.3.3 ¿CUÁLES SON LAS ETAPAS DEL ENSAYO ENZIMÁTICO? Luego de haber preparado las soluciones de todos los reactivos necesarios, los pasos básicos a seguir en todo ensayo enzimático son los siguientes: 1°. Pre-incubar los tubos a una temperatura y por un tiempo, previamente definidos. 2°. Adicionar un volumen de la solución de la enzima para completar el ensayo enzimático. 3°. Incubar los ensayos por un tiempo y a una temperatura, previamente definidos. 4°. Detener la reacción química adicionando un inhibidor/inactivador químico o físico de la enzima. Generalmente, el ensayo enzimático se inicia agregando un volumen de la solución de enzima diluida, luego de una breve pre-incubación de 1-2 min. Una vez que el tiempo de incubación del ensayo enzimático ha terminado y se ha agregado el inhibidor/inactivador químico o físico de la enzima, el proceso continúa con la aplicación de una técnica, generalmente fotométrica, para cuantificar la cantidad de producto generado o la cantidad de sustrato transformado en producto. La elección de qué medir (sustrato o producto) dependerá de si existe una técnica para determinar la concentración de uno de ellos. Si existen técnicas disponibles para medir uno u otro, se seleccionará la técnica más simple y/o la de menor costo. Una vez aplicada la técnica fotométrica seleccionada (incluyendo la correspondiente Curva de Calibración de la técnica fotométrica seleccionada), es necesario realizar los cálculos necesarios para llegar al valor de la velocidad de reacción, que se analizará posteriormente.
  • 33. TABLA N° 3.3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL SIMPLIFICADO PARA UN ENSAYO ENZIMÁTICO E l protocolo experimental de un ensayo enzimático es el conjunto ordenado de componentes y condiciones necesarias para evaluar la actividad catalítica de una enzima. En este ejemplo, se muestra una versión simplificada en el que se utilizan dos tubos (control y ensayo) que reciben volúmenes predefinidos de reactivos en un orden preestablecido, son luego agitados e incubados para, finalmente, recibir un volumen de un agente inhibidor para detener la actividad de la enzima. El siguiente paso sería aplicar la técnica fotométrica adecuada para medir la cantidad de producto formado y calcular la velocidad de la reacción enzimática. Reactivo TUBO CONTROL TUBO ENSAYO SUSTRATO (5 mM) 0,20 0,20 AGUA DESTILADA 2,80 1,80 TAMPÓN pH 7,8 1 1 ENZIMA (1/800) 0 1 Agitar en un vortex e incubar a 45°C por 10 minutos AGENTE INHIBIDOR (0,1 M) 1 1
  • 34. 3.3.4 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE UN ENSAYO ENZIMÁTICO Un protocolo experimental es una herramienta de organización para las actividades, etapas y componentes del trabajo a realizar. Así, el experimento podrá ser realizado de la misma forma y tantas veces como sea necesario, por la misma u otras personas. Una de las formas más comunes y útiles para un protocolo es una tabla en la que sus filas, columnas y celdas identifican con precisión los reactivos, volúmenes y tubos a usar. La TABLA N° 3.3.1 es un ejemplo simplificado de un protocolo experimental para un ensayo enzimático diseñado para medir la actividad catalítica de una enzima. Columnas: primera columna es reservada para identificar las soluciones de los reactivos a usar y las siguientes columnas identifican los tubos con un número, palabra o código. Filas: cada fila es asignada a un reactivo o una instrucción particular. Celdas: proporcionan información sobre los volúmenes (en ml) de cada reactivo que deben ser transferidos a cada uno de los tubos. Finalmente, el protocolo experimental es una instrucción acerca del orden de adición de los reactivos a los diferentes tubos y, normalmente, los volúmenes de los reactivos se agregan uno a la vez, usando pipetas limpias individuales para cada reactivo y empezando aquel indicado en la parte superior de la tabla y luego, en orden descendente. 3.3.4.1 ¿QUÉ PODEMOS DEDUCIR DE LA TABLA DE UN PROTOCOLO EXPERIMENTAL? L a TABLA N° 3.3.1 muestra el protocolo experimental para evaluar la actividad enzimática de una enzima. Aun cuando este es simplificado, nos entrega más información de la que el estudiante puede deducir inicialmente: se usan dos tubos: el Blanco o Control y el Ensayo. los tubos Blanco y Ensayo se diferencian entre sí por la ausencia/presencia de enzima. la solución de Enzima está diluida 800 veces. la concentración de la solución de sustrato es 5 milimoles por litro de solución. el volumen final es 4 ml y es igual en todos los tubos. el tubo control recibe un volumen de agua que remplaza al volumen de enzima usada. el ensayo enzimático se realiza a 45°C, durante 10 min, a pH 7,8. ambos tubos se someten a las mismas condiciones de incubación. para detener la reacción, se agrega 1 ml del inhibidor a ambos tubos, al término del ensayo (10 min). 3.3.4.2 PREGUNTAS SOBRE UN PROTOCOLO EXPERIMENTAL La información contenida en la TABLA N° 3.3.1 también nos permite platear una serie de preguntas implícitas, entre ellas, las siguientes: 1. ¿cuál es la concentración de sustrato en el ensayo enzimático? 2. ¿por qué la solución de Enzima se usa 800 veces diluida? 3. ¿por qué el ensayo enzimático se realiza a pH 7,8? 4. ¿por qué el ensayo enzimático se realiza a 45°C? 5. ¿por qué el ensayo enzimático se realiza durante 10 minutos? 6. ¿por qué es necesario detener la reacción con 1 ml del agente inhibidor? 7. ¿por qué o para qué se usa un tubo Blanco (Control)?
  • 35. 3.3.4.3 RESPUESTAS A LAS PREGUNTAS SOBRE LA TABLA N° 3.3.1 A continuación están disponibles las respuestas a las preguntas planteadas anteriormente: 1. La concentración de sustrato en el ensayo es de 0,25 mM. (Se usaron 0,2 ml de una solución 5 mM y se llevó a un volumen final de 4 ml). 2. Si la cantidad de enzima usada en un ensayo es muy alta, ella transformará todo o gran parte del sustrato en producto en un muy corto tiempo. Ello producirá una cantidad de producto que probablemente quedará fuera del rango óptimo del método fotométrico a usar para medirle; por lo tanto, es absolutamente necesario diluir apropiadamente la solución inicial de enzima para que ella genere una cantidad de producto adecuada en el tiempo de incubación usado en el ensayo de su actividad y así poder cuantificarlo fotométricamente. 3. El pH es una de las condiciones de incubación más importantes para una enzima; en este ejemplo, el pH de 7,8 está probablemente en el rango óptimo para la enzima. 4. La temperatura de incubación es una de las condiciones más importantes para medir la actividad de una enzima; en este ejemplo, la temperatura de 45°C no es denaturante en cortos tiempos y está probablemente en el rango óptimo para la actividad de la enzima. 5. Durante el periodo de incubación, la enzima deberá producir una cantidad de producto adecuada para su medición fotométrica y su denaturación debe ser mínima; en este ejemplo, una incubación de 10 min debe ser la adecuada para que no se denature la gran mayoría de las moléculas de enzima. 6. El control sobre el tiempo de incubación a que se somete un ensayo enzimático es fundamental y la reacción enzimática se debe detener al momento en que este periodo se cumple. Para ello existe una variedad de procedimientos; por ejemplo, alterar el pH por adición de una base o un ácido, cambio brusco a una temperatura extrema. En la Tabla N° 3.3.1 se indica la adición de un ml del agente inhibidor a una concentración tal que 1 ml es suficiente. 7. En todo experimento bien diseñado, es necesario contar con uno o más controles. En el caso de un ensayo enzimático, existen diversas alternativas de controles (control sin enzima, control sin sustrato, control tiempo cero), y cada uno de ellos proporciona información relevante al momento de analizar los datos obtenidos en el experimento.
  • 36. 3.3.5 CONTROLES DE UN ENSAYO ENZIMÁTICO ¿Qué está sucediendo durante el periodo de incubación de una enzima con su sustrato en un ensayo enzimático, bajo las condiciones adecuadas (por ejemplo, ver TABLA N° 3.3.1: 10 min, 45°C, pH 7,8)? En ese periodo están ocurriendo dos reacciones en forma paralela y simultánea: (1) la reacción enzimática: S + E → P + E (2) la reacción no-enzimática: S → P Lo anterior tiene como consecuencia que: en la primera reacción, la presencia del catalizador acelera la transformación del sustrato en producto, la segunda reacción es más lenta por la ausencia de catalizador, pero también puede contribuir a la formación de producto, en menor grado y a menor velocidad, ambas reacciones darán origen a una cierta cantidad de producto y ambas cantidades de producto se sumarán al término del ensayo enzimático. Recordemos que el objetivo del ensayo enzimático es cuantificar la actividad catalítica de la enzima. Para ello, se necesita conocer cuál es la cantidad de producto formado en el tubo que contiene la enzima. Por tanto, es necesario restar la cantidad de producto formado en la reacción no-enzimática de la formada en la reacción enzimática (reacción 1 – reacción 2) y así, obtener la cantidad neta de producto formado sólo en presencia de la enzima. Lo anterior necesita que conozcamos cuánto producto se formó en la reacción sin enzima: ¿cómo podemos saberlo? La respuesta es: usando un control sin enzima. Existen tres tipos de controles para los ensayos enzimáticos y haremos una breve discusión para ellos: CONTROL BLANCO ENZIMA El control Blanco Enzima es ampliamente usado en los protocolos de Enzimología y corresponde al tubo control sin enzima. El Blanco Enzima es el control que contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de enzima es remplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite cuantificar, al término del ensayo, la cantidad de producto formado no-enzimáticamente (en ausencia de la enzima), a consecuencia de la transformación química del sustrato en producto. CONTROL BLANCO SUSTRATO Este control permite cuantificar la cantidad de producto que podría estar presente previamente en la preparación enzimática usada en el ensayo, es decir, la contaminación endógena. El Blanco Sustrato es un control que contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de sustrato es remplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. CONTROL TIEMPO CERO: Este control permite cuantificar la cantidad de producto que está presente al inicio del ensayo (tiempo cero de incubación). Teóricamente, no debería existir producto antes que se inicie la reacción enzimática; por tanto, este control mide el efecto de algún componente de la reacción que esté alterando los resultados de la actividad enzimática en el ensayo enzimático. El Control Tiempo Cero contiene todos los componentes del ensayo enzimático pero, la reacción enzimática se detiene agregando el agente inactivador antes o inmediatamente después de completar la adición del último componente de la mezcla de reacción. Un Ensayo Enzimático “perfecto” debería incluir a todos los controles o blancos indicados anteriormente; sin embargo, y para simplificar el trabajo experimental, generalmente sólo se usa el Control Blanco Enzima. Recuerde que para calcular la actividad enzimática, la cantidad de producto formado en los controles o blancos debe ser restado al producto formado en el Ensayo Enzimático. En los casos en que el diseño experimental incluya a los tres controles, se elige aquel control con el mayor resultado (mayor cantidad de producto o mayor absorbancia) obtenido para llevar a cabo la resta correspondiente. En la TABLA N° 3.3.1 se muestra con claridad que la reacción en el “Tubo Control” se realiza sin la enzima;
  • 37. entonces, la cantidad de producto formado al término de esa incubación, corresponde al producto formado en la reacción no-enzimática. Esta es la cantidad de producto que debe ser restada al producto formado en el “Tubo Ensayo”, para luego calcular la velocidad de la reacción enzimática. Cabe mencionar que muchas veces no es necesario calcular la cantidad de producto formado en el tubo control sin enzima; sólo podemos restar los valores de absorbancia de ambos tubos: A tubo ensay o – A tubo control. De este modo, obtendremos la “absorbancia corregida” (ver TABLA N° 3.3.2). Con ella podemos obtener la cantidad neta de producto formado exclusivamente por acción de la enzima (mediante la aplicación de la Ecuación de Lambert-Beer).
  • 38. TABLA N° 3.3.2 DATOS EXPERIMENTALES PARA LA DETERMINACIÓN DE VMAX Y KM DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA El ensayo enzimático se realizó en 10 tubos, en un volumen final de 4 ml c/u, conteniendo 1 ml de enzima diluida 1.000 veces. La tabla muestra los volúmenes de sustrato provenientes de una solución stock de p-nitrofenilfosfato 6 mM y las concentraciones finales de sustrato en cada ensayo. Los ensayos se incubaron a 40°C por 10 min; luego, la reacción en cada ensayo fue detenida con la adición de 1 ml de NaOH. La cantidad de producto formado (p-nitrofenol) fue determinada fotométricamente usando un Factor de Calibración de 3,9 (micromoles/tubo)-1 . Los datos proporcionados en esta tabla fueron usados para confeccionar el gráfico mostrado en la FIGURA N° 3.3.1. N° Volumen (ml) [pNFF] (mM) A420 A420 A420 Velocidad (mmol/min) AE (mmol/min/ml E) 1/S 1/v 1/AE BE EN Acorr 1 0,20 0,30 0,014 0,282 0,268 0,0069 6,87 3,33 144,93 0,15 2 0,22 0,33 0,016 0,301 0,285 0,0073 7,31 3,03 136,99 0,14 3 0,25 0,38 0,019 0,328 0,309 0,0079 7,92 2,63 126,58 0,13 4 0,30 0,45 0,020 0,357 0,337 0,0086 8,64 2,22 116,28 0,12 5 0,33 0,50 0,023 0,381 0,358 0,0092 9,18 2,00 108,70 0,11 6 0,40 0,60 0,027 0,416 0,389 0,0100 9,97 1,67 100,00 0,10 7 0,50 0,75 0,034 0,532 0,498 0,0128 12,77 1,33 0,08 8 0,67 1,01 0,042 0,531 0,489 0,0125 12,54 0,99 80,00 0,08 9 1,00 1,50 0,061 0,593 0,532 0,0136 13,64 0,67 73,53 0,07 10 2,00 3,00 0,106 0,675 0,569 0,0146 14,59 0,33 68,49 0,07 Abreviaturas: pNFF (mM): concentración final del sustrato p-nitrofenilfosfato AE: actividad enzimática v: velocidad BE: blanco enzima EN: ensayo Acorr: absorbancia corregida (AEN-ABE)
  • 39. 3.3.6 LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO El conocer la cantidad correcta de enzima que se debe usar en un ensayo enzimático es un factor clave en el diseño de un protocolo enzimático. ¿Por qué en necesario controlar la cantidad de enzima usada en un ensayo enzimático? A continuación se resumen algunos puntos clave que permiten explicar esta necesidad: La velocidad de una reacción catalizada por una enzima depende de la cantidad de enzima, ya que VMAX = k • [E]. Un exceso de enzima transformará, en pocos segundos, todo el sustrato en producto. La cantidad de producto formado se evalúa mediante una técnica fotométrica que posee de un rango limitado de concentración en que se obedece la Ley de Lambert-Beer. Un exceso de enzima catalizará la formación de una cantidad de producto que excede el rango del método fotométrico y la concentración de producto no se podrá medir con certeza. Dado lo anterior, el diseño del protocolo enzimático debe considerar que la reacción se realice con una cantidad de enzima y por un tiempo de incubación tales que la cantidad de producto formado al término del experimento, pueda ser medida fotométricamente.
  • 40. 3.3.7 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Y DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD ENZIMÁTICA Para un gran número de enzimas, el cálculo de la velocidad de la reacción (v) utiliza la cantidad de producto formado durante el periodo en que se realizó el ensayo enzimático; así, la velocidad de la reacción (v) corresponde a la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (generalmente, por minuto). V se expresa en unidades de masa de producto/unidad de tiempo. Un término más técnico pero equivalente a la Velocidad de la Reacción es la “Unidad Enzimática”. Bien…, hagamos un ejercicio: Si una reacción enzimática tiene una velocidad v = 5 µmoles/min, ¿cuál es su significado? La respuesta es: “se formaron cinco micromoles de producto por minuto, bajo las condiciones experimentales del ensayo enzimático”. Sigamos: La cantidad del producto formado depende de la cantidad de enzima usada en el ensayo enzimático, es decir, el volumen de la solución de enzima usado y está definido en el protocolo correspondiente. Además, la concentración de la enzima en las preparaciones de origen comercial o de extractos obtenidos en el laboratorio, es muy alta; por ello, es necesario diluirlas hasta alcanzar la cantidad de la enzima apropiada para su ensayo y en un volumen fácil de medir y pipetear (0,5 – 1 ml) (ver TABLA N° 3.3.1). Para complementar o mejorar la respuesta anterior sobre el significado de una velocidad de reacción de v = 5 µmoles/min, aprovechamos la información entregada por el protocolo de la TABLA N° 3.3.1, que indica que se usó 1 ml de enzima diluida 800 veces. Por lo tanto, la respuesta sería: “se formaron cinco micromoles del producto por minuto, usando 1 ml de la solución de enzima diluida 800 veces”. Una expresión alternativa para cuantificar la actividad catalítica de una enzima es la “Actividad Enzimática” (AE), cuyas unidades son las mismas de la Unidad Enzimática pero considerando que se usó 1 ml de la solución de la enzima sin dilución. Entonces, la Actividad Enzimática que se obtiene a partir de una velocidad de v = 5 µmoles/min es: AE = 4.000 µmoles/min (4 mmoles/min). En otras palabras, la actividad enzimática del ensayo es “cuatro milimoles de producto formado por minuto por ml de la enzima sin diluir”. Finalmente, la “Actividad Específica” es una expresión alternativa para aquellos casos en que la velocidad o actividad de una enzima se debe relacionar con la cantidad de proteínas que existe en la solución de la enzima en estudio; por ejemplo, en estudios de purificación de la enzima. La Actividad Específica se define como el Nº de Unidades Enzimáticas presentes en un mg de proteínas totales existentes en la preparación enzimática. En otras palabras, la Actividad Específica de una preparación enzimática corresponde a la cantidad de producto formado durante un minuto de incubación por la acción de un mg de proteínas totales. Si usamos el ejemplo anterior (v=5 µmoles/min, o AE=4.000 µmoles/min), y si suponemos que la solución de la enzima sin diluir tiene una concentración de 20 mg proteína/ml: ¿cuál es la actividad específica? La respuesta es: 200 µmoles producto/min/mg proteína.
  • 41. 3.3.8 EL EFECTO DE LA TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIÓN EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO Todas las reacciones químicas aumentan de velocidad al aumentar la temperatura, ya que se incrementa la energía cinética de las moléculas y el número de choques entre ellas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima también es dependiente de la temperatura pero con una limitación: su actividad disminuirá a altas temperaturas debido a la naturaleza protéica de la enzima y al proceso de denaturación. L a estabilidad de una enzima es una medida de la capacidad para mantener su actividad en el tiempo. Las enzimas son más estables a bajas temperaturas pero su actividad es menor. Entonces, para medir la actividad de una enzima es necesario someter la mezcla “enzima + sustrato” a una temperatura de incubación, lo suficientemente alta para que su actividad sea máxima, pero por un tiempo de incubación corto en que la denaturación sea mínima. Además, el tiempo de incubación debe ser el adecuado para que la cantidad de producto formado sea lo suficiente para aplicar una técnica fotométrica de acuerdo a la Ley de Lambert-Beer. Normalmente, y para proteger la actividad de la enzima, la solución que contiene a la enzima se mantiene en un baño de hielo cercano a los 0 – 4°C y es el último componente que se agrega al medio de reacción (ver TABLA N° 3.3.1). Para que un ensayo enzimático se realice en forma correcta, todos los reactivos involucrados deben estar a la temperatura de incubación, al momento de iniciar la reacción o tiempo cero. Ello se logra mediante una pre- incubación que consiste calentar la mezcla de reacción sin enzima en un tubo y la enzima en otro tubo, por un corto período de 1-3 minutos, en un baño termorregulado que está a la temperatura de incubación del ensayo enzimático. Luego que ha transcurrido el corto periodo de pre-incubación, se mide el volumen de enzima a usar según el protocolo, y se mezcla rápidamente con la solución del tubo que contiene el resto de los reactivos del ensayo. El proceso de incubación se inicia a partir de ese momento y transcurre hasta que se completa el tiempo de incubación, cuando la reacción debe detenerse agregando un volumen del inhibidor/inactivador de la reacción enzimática. Luego, sólo faltará aplicar la técnica fotométrica seleccionada para medir la cantidad de producto formado y con esos datos determinar el valor de la actividad enzimática.
  • 42. 3.3.9 LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO EN EL ENSAYO ENZIMÁTICO Todo ensayo enzimático debe contener una concentración predeterminada del sustrato (S) para evaluar la reacción en estudio: S + E → P + E. El sustrato se obtiene de una solución stock preparada a una concentración lo suficientemente alta para transferir alícuotas de poco volumen (0,1 – 2.0 ml) al ensayo enzimático. Por ejemplo, la TABLA N° 3.3.1 indica que la concentración de la solución stock de sustrato es 5 mM y se ocupan alícuotas de 0,2 ml. En experimentos enzimáticos que evalúan el efecto de algunas variables, tales como pH o temperatura, se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En cambio, experimentos diseñados para determinar KM y VMAX usan concentraciones de sustrato que comprenden un amplio rango de concentraciones. Este rango de concentraciones se obtiene preparando una batería de tubos en que cada tubo recibe un volumen creciente de la solución stock de sustrato. L a concentración final de sustrato en el ensayo enzimático se calcula considerando la concentración de la solución stock de sustrato, el volumen usado de la solución stock y el volumen final del ensayo enzimático. En base a los datos del protocolo de la TABLA N° 3.3.1, la concentración final de sustrato en el tubo ensayo es 0,25 mM, ¿puede demostrar que este valor es correcto?
  • 43. 3.3.10 LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE UNA ENZIMA Uno de los temas más importantes en el estudio de enzimas es la determinación de los valores de los parámetros o constantes cinéticas de la enzima: KM y VMAX. Para ello, es necesario hacer uso de gráficos y la siguiente dirección permite descargar un programa en forma gratuita, que facilita la confección de gráficos de interés en Enzimología: http://homepage.ntlworld.com/john.easterby/hyper32.html. 3.3.10.1 ¿CÓMO OBTENER LOS VALORES DE KM y VMAX DE UNA ENZIMA? Primero, debemos aplicar un ensayo enzimático diseñado para medir los valores de velocidad a diferentes concentraciones del sustrato. Segundo, debemos diseñar y aplicar un protocolo experimental, obtener los resultados y preparar una tabla con ellos. La TABLA N° 3.3.2 proporciona información sobre el estudio de la enzima fosfatasa ácida, que Usted debe intentar entender en detalle. Esta tabla ordena los valores de concentración del sustrato en cada tubo, el valor inverso de dicha concentración, la velocidad de la reacción enzimática y su valor inverso. Tercero, confeccionar dos gráficos, uno de velocidad versus concentración y el otro con los valores inversos (el inverso de la velocidad versus el inverso de la concentración). El primer gráfico debería generar una curva hipérbola y en el segundo, conocido como Gráfico de los Inversos Recíprocos o Gráfico de Lineweaver-Burk, se genera una recta con pendiente negativa. La prolongación o extrapolación de dicha recta generará dos interceptos. El intercepto del eje 1/V proporciona un valor numérico que corresponde al inverso de la velocidad máxima de la reacción, es decir, -1/VMAX. El otro intercepto, en el eje - 1/[S] proporciona un valor numérico correspondiente al inverso negativo de KM, es decir, (-1/KM). La información contenida en la TABLA N° 3.3.2 se ha usado para confeccionar la FIGURA N° 3.3.1 que contiene el Gráfico de Lineweaver-Burk para la enzima fosfatasa ácida. Les sugiero un serio análisis antes de continuar. En el contexto de lo avanzado hasta ahora, ¿cuál sería el objetivo para realizar el primer gráfico (velocidad versus concentración de sustrato) que genera la hipérbola? La respuesta la encontrará contenida en el material de la FIGURA N° 3.3.1. Finalmente, es importante tener en mente que el Gráfico de los Inversos Recíprocos o Gráfico de Lineweaver- Burk, es una de varias posibilidades para calcular gráficamente los valores de KM y VMAX de una enzima. Usted puede usar un texto guía de Bioquímica para averiguarlo o puede preguntarle a su profesor en la clase acerca de estas otras alternativas. Hemos llegado al final del tema sobre Enzimología y ahora le invito a realizar el Test de Autoevaluación N° 3.3.11: Módulo Enzimología.
  • 44. FIGURA N° 3.3.1 GRÁFICO DE LOS DOBLES RECÍPROCOS O LINEWEAVER-BURK, PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE KM Y VMAX DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA Esta figura se origina luego de usar los datos proporcionados en la TABLA N° 3.3.2 (ver más abajo) para graficar los valores inversos de velocidad versus valores inversos concentración de sustrato. Previo a esto, Usted grafica velocidad versus concentración para obtener un gráfico que genera una hipérbola. Si usted descarta aquellos puntos que no son parte de la hipérbola y sólo utiliza los datos de los puntos que si la forman, el gráfico de los dobles recíprocos mostrará una recta como la de esta figura. En este ejemplo, la extrapolación de la recta genera un intercepto en el eje Y (1/V) que tiene un valor de 56,61 y otro intercepto en el eje -X (-1/S) con un valor de -2,1. Ya que: V-1 = 56,61; entonces, VMAX = 0,017 micromoles/min. -S-1 = - 2,1; entonces, KM = 0,48 mM. Tabla de Datos (obtenidos de TABLA N° 3.3.2 ). N° Volumen (ml) [pNFF] (mM) A420 A420 A420 Velocidad (mmol/min) AE** (mmol/min/ml E) 1/S 1/v 1/AE BE EN Acorr* 1 0,20 0,30 0,014 0,282 0,268 0,0069 6,87 3,33 144,93 0,15 2 0,22 0,33 0,016 0,301 0,285 0,0073 7,31 3,03 136,99 0,14 3 0,25 0,38 0,019 0,328 0,309 0,0079 7,92 2,63 126,58 0,13 4 0,30 0,45 0,020 0,357 0,337 0,0086 8,64 2,22 116,28 0,12 5 0,33 0,50 0,023 0,381 0,358 0,0092 9,18 2,00 108,70 0,11 6 0,40 0,60 0,027 0,416 0,389 0,0100 9,97 1,67 100,00 0,10 7 0,50 0,75 0,034 0,532 0,498 0,0128 12,77 1,33 0,08 8 0,67 1,01 0,042 0,531 0,489 0,0125 12,54 0,99 80,00 0,08 9 1,00 1,50 0,061 0,593 0,532 0,0136 13,64 0,67 73,53 0,07 10 2,00 3,00 0,106 0,675 0,569 0,0146 14,59 0,33 68,49 0,07 *absorbancia corregida. **actividad enzimática
  • 45. AUTOEVALUACIÓN SOBRE ENZIMOLOGÍA 1. ¿Por qué o para qué se estudian las enzimas en los laboratorios de investigación? 2. ¿Qué se entiende por “ensayo enzimático”? 3. Nombre tres variables de un ensayo enzimático. 4. ¿Cuál o cuáles son las condiciones experimentales que permanecen constantes en la determinación del pH óptimo de una enzima? 5. ¿Cuál o cuáles son las condiciones experimentales que permanecen constantes en la determinación de la temperatura óptima? 6. ¿Por qué se debe detener el ensayo enzimático cuando se cumple el tiempo de incubación? 7. ¿Cuál es el siguiente paso experimental luego que se ha detenido un ensayo enzimático? 8. ¿Qué información necesita para determinar la concentración de sustrato usada en un ensayo enzimático? 9. ¿Por qué no es completamente correcto decir que para determinar la velocidad o actividad de una enzima se debe medir la cantidad de producto formado en un ensayo enzimático? 10. ¿Por qué podría ser necesario diluir una muestra de enzima antes de medir su actividad? 11. ¿Qué significa pre-incubación en un ensayo enzimático? 12. ¿En qué momento se usa pre-incubación en un ensayo enzimático? 13. ¿Para qué se usa la pre-incubación en un ensayo enzimático? 14. ¿Cuál es la diferencia entre incubación y pre-incubación para un ensayo enzimático? 15. ¿Por qué un ensayo enzimático se debe realizar por un período predefinido? 16. ¿Cuál es la ventaja de usar un sustrato cromogénico? 17. Defina VMAX y KM 18. ¿Por qué se requiere un tubo control sin enzima para medir la actividad catalítica? 19. ¿Por qué es necesario conocer la concentración de las proteínas en la solución de enzima usada, para determinar la actividad específica de una enzima? 20. ¿Por qué se debe usar el gráfico de dobles recíprocos para determinar KM y VMAX?
  • 46. RESPUESTAS AUTOEVALUACIÓN ENZIMOLOGÍA 1. Por varias razones, entre ellas: determinar sus valores de KM y VMAX, obtener la temperatura y pH óptimos para su actividad catalítica, comparar enzimas de diferente origen, etc. 2. Al conjunto de condiciones y reactivos necesarios para medir la actividad catalítica de una enzima. 3. El pH, la temperatura y la concentración de sustrato (tiempo de incubación, cantidad de enzima). 4. La temperatura de incubación, la concentración de sustrato y enzima, el tiempo de incubación, volumen final del ensayo, tipo y cantidad de agente inactivador. 5. El pH de incubación, la concentración de sustrato y enzima, el tiempo de incubación, volumen final del ensayo, tipo y cantidad de agente inactivador. 6. Pata evitar que la enzima continúe activa y catalizando la reacción química. 7. Determinar fotométricamente la cantidad de producto formado (o alternativamente, la cantidad de sustrato que no alcanzó a reaccionar). 8. La concentración de la solución stock de sustrato, el volumen usado de dicha solución stock y el volumen final del ensayo enzimático. 9. Debido a que en algunos casos, también es posible medir la cantidad de sustrato remanente al término del ensayo enzimático (si existe un método fotométrico disponible para ello). 10. Para evitar que el exceso de enzima catalice la transformación de gran parte del sustrato en producto en un corto tiempo de incubación, o para evitar que se genere una cantidad excesiva de producto que no pueda ser medida por la técnica fotométrica elegida, al no cumplir con la ley de Lambert-Beer. 11. Significa incubar, por un corto tiempo (1-2 min), los reactivos y la enzima a la temperatura de incubación del ensayo. 12. Antes de combinar las solución que contiene el sustrato con la solución de la enzima. 13. Para que todos los componentes del ensayo enzimático estén a la temperatura correcta de incubación antes de mezclar las soluciones de sustrato y enzima. 14. En la pre-incubación el sustrato y la enzima no se han mezclado. En la incubación, sustrato y enzima son parte de la misma solución. 15. Para lograr que se forme una cantidad adecuada de producto que pueda ser cuantificada fotométricamente. 16. Un sustrato cromogénico es aquel que se transforma en un producto coloreado; por lo tanto, su absorbancia puede ser medida una vez que el tiempo de incubación ha concluido, sin necesidad de una o más reacciones químicas adicionales. 17. VMAX o velocidad máxima de una reacción enzimática, es el mayor valor de velocidad que se alcanzará cuando la enzima actúa a concentraciones saturantes de sustrato. KM o constante de Michaelis de una enzima, equivale a una concentración no saturante de sustrato en la que la enzima alcanza un 50% de su velocidad máxima. 18. Para medir la cantidad de producto formado en la reacción química sin catalizador y poder determinar la cantidad neta de producto formado exclusivamente por acción de la enzima. 19. Porque la actividad específica de una enzima indica la cantidad de producto formado en un minuto por la acción de un mg de proteínas totales (que incluye a la enzima). 20. Porque este tipo de gráfico facilita y es más preciso en determinar los valores de VMAX y KM de una enzima, mediante el uso de los valores numéricos de los interceptos en los ejes “Y” y “–X”, respectivamente.
  • 47. ÍNDICE ALFABÉTICO Absorbancia Absorción de la luz Actividad enzimática Actividad específica Aplicación Cualitativa Aplicación Cuantitativa Blanco Colorimétrico Blanco enzima Coeficiente de extinción Concentración desconocida Concentraciones saturantes Constantes cinéticas Cubeta Curva de Calibración Detector Ecuación de Lambert-Beer Ensayos enzimáticos Enzima Diluída Espectro Espectograma de Absorción Espectros de absorción Espectro de Absorbancia Estabilidad Estado electrónico basal Estado electrónico excitado Factor de Calibración Factor de dilución Fotómetro Fuente de luz policromática
  • 48. Gráfico de Lineweaver-Burk Gráfico de los Inversos Recíprocos Incoloras Inversamente proporcional Monocromador Muestra problema Porcentaje de Transmitancia Pre-incubación Proporcional Radiación monocromática Radiación policromática Radiaciones ionizantes Relación lineal Técnica fotométrica Técnica fotométricas Tiempo de Incubación Transmitancia Tubo Control Tubo Ensayo Tubo fotométrico Unidad Enzimática Velocidad de la reacción
  • 49. Created with Writer2ePub by Luca Calcinai