 Daniela Marín Rivera
 Leidy Hincapie
 Medicine student
III Semester
Molecular Biology
INTRODUCTION
Ultraviolet B
Improvement
Induces autoreactivity,
and the cells promote
antibody production
DNMT1
Hipometilat...
CD4
Inflamation
Autoinmune disease
: autoantibodies
"loss of self-tolerance"
DNA
methylation
is an
epigenetic
process
directly to
prevent
binding of
transcription
factors.
indirectly
promoting
struct...
DNA have ("CpG islands"), which are recognized by the enzyme DNA
methyltransferase, which during DNA replication carbon 5 ...
Gen DNMT1
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manages to have action on the stem cell to
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• DNMT1-• Hipometilaci
on ihbibiting
the DNMT1
• CD4+ T cell its
someting to UVB
• LES
Autoin
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disease
Affecting
OF CD...
General objective
the objective of this study was to obtain the CD4 + and expose them
ultraviolet rays and watch dose occu...
MATERIALES Y METODOS
Sujetos
Aislamiento y cultivo
EDTA
20 ml
Ficoll hypaque Aislamiento usando
perlas magneticas
-Citometria : 95%
Rango entre 290-320 nm pico de 310 nm
Irradiada con PBS con
Mg2+/Ca2+
A distancia de 40cm Dosis de 20, 40 or 80 mJ/cm2. .
...
La metilación del ADN
global fue evaluada por
las células con tinción
anticuerpo monoclonal
específico contra 5-
methylcyt...
Amplificación del
RNA
Síntesis de su
cDNA
Con transcriptasa
inversa
Varios ciclos
de DNA
convencional
Determina
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Transcripción reversa se realizó utilizando el kit de rt-pcr
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Western
Blot
Proteínas
Separación
por
electroforesis
SDS- PAGE
Única
medida
con Kdal
las membranas fueron sondeadas
con dnmt1 anti igG de conejo anticuerpo o
conejo anti-glyceraldehyde-3-fosfato
deshidrogena...
Se hace para determinar la actividad catalítica de la
enzima DNMT1
RESULTADOS
Regulación a la baja de la expresión de RNAm de
DNMT1 contribuye a la hipometilación del ADN a
nivel global en ...
RESULTADOS
Líneas roja punteadas control con isotopo, Línea azul
control de pacientes sanos y línea amarilla pacientes
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RESULTADOS
UVB mejoro la hipometilación del ADN de manera
dependiente de la dosis en las células T CD4 en
pacientes con LE...
RESULTADOS
La metilación de las células T CD4 en pacientes con
LES fue sensible a la exposición de UVB de forma dosis
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UVB no afecta la expresión de DNMT1 y proteínas en
las células T CD4 en paciente con LES.
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RESULTADOS
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• Los niveles de expresión de DNMT1 no mostraron
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• Se encontró expresión de DNMT1 en las célula...
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DISCUSSION
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DISCUSSION
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Wang The data showed global DNA
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CONCLUSION
• DNMT1 expression level is significantly
positive in SLE patients.
• The down regulation of DNMT1 mRNA
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Seminario LES

  1. 1.  Daniela Marín Rivera  Leidy Hincapie  Medicine student III Semester Molecular Biology
  2. 2. INTRODUCTION Ultraviolet B Improvement Induces autoreactivity, and the cells promote antibody production DNMT1 Hipometilation
  3. 3. CD4
  4. 4. Inflamation Autoinmune disease : autoantibodies "loss of self-tolerance"
  5. 5. DNA methylation is an epigenetic process directly to prevent binding of transcription factors. indirectly promoting structure 'closed' chromatin. the enzyme DNMT1 is involved in the establishment and regulation of methylation of specific cytokines from fabric patterns
  6. 6. DNA have ("CpG islands"), which are recognized by the enzyme DNA methyltransferase, which during DNA replication carbon 5 methylated cytosine of the newly synthesized strand, thus maintaining the methylated state memory daughter DNA molecule
  7. 7. Gen DNMT1 In this study was important because it manages to have action on the stem cell to ensure in all sequences of dna methylation They were able to identify that inhibir this factor which is the more important during the metilation , to occurs a hypomethylation which leads to an improvement in patients with LES
  8. 8. • DNMT1-• Hipometilaci on ihbibiting the DNMT1 • CD4+ T cell its someting to UVB • LES Autoin mune disease Affecting OF CD4+ T CELLS The most important in metilation The hipometil ation enhances the LES
  9. 9. General objective the objective of this study was to obtain the CD4 + and expose them ultraviolet rays and watch dose occurs a change in DNA methylation and that causes about patients with this reduction brings them taking into account the time of exposure dose and the improvement in symptoms, and if to obtain the result you can be beneficial to the patient and be able to include as a white effective therapeutic.
  10. 10. MATERIALES Y METODOS
  11. 11. Sujetos
  12. 12. Aislamiento y cultivo EDTA 20 ml Ficoll hypaque Aislamiento usando perlas magneticas -Citometria : 95%
  13. 13. Rango entre 290-320 nm pico de 310 nm Irradiada con PBS con Mg2+/Ca2+ A distancia de 40cm Dosis de 20, 40 or 80 mJ/cm2. . se agregó el medio de cultivo de células t humanas y fueron cultivadas para dosificación de 24 h. Exposición UVB
  14. 14. La metilación del ADN global fue evaluada por las células con tinción anticuerpo monoclonal específico contra 5- methylcytidine Células CD4 fueron lavadas con (SAFT-bsa) Luego se fijo con paraformaldehido. seguido por tinción con cabra anti-ratón igG conjugado con fluoresceína Se neutralizaron y se incubaron con anti-5 - methylcytidine anticuerpo Análisis por citometría de flujo
  15. 15. Amplificación del RNA Síntesis de su cDNA Con transcriptasa inversa Varios ciclos de DNA convencional Determina expresión de genes, diferentes tejidos
  16. 16. Transcripción reversa se realizó utilizando el kit de rt-pcr primescript QRT-pcr fue realizada en sistema de tiempo real usando sybr premezcla ex taq amplificación se inició en el 95c durante 30 s como el primer paso seguido por 40 ciclos sucessivos de pcr: 95 c durante 5 s, a 60 8c para 20 s. Los primer de takara bio fueron: DNMT1 forward: 50-GCACCTCATTTGCCGAATACA-30; reverse: 5’-TCTCCTGCATCAGCCCAAATA-3’ b-actin forward: 5’-ACCCAGATCATGTTTGAGACC-3’ reverse: 5’-AGGGCATACCCCTCGTAGA-3’
  17. 17. Western Blot Proteínas Separación por electroforesis SDS- PAGE Única medida con Kdal
  18. 18. las membranas fueron sondeadas con dnmt1 anti igG de conejo anticuerpo o conejo anti-glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh) bandas de proteínas fueron detectadas utilizando el kit de brisa occidental densitométrica Análisis de la banda de la proteína se realizó utilizando software imagej
  19. 19. Se hace para determinar la actividad catalítica de la enzima DNMT1
  20. 20. RESULTADOS Regulación a la baja de la expresión de RNAm de DNMT1 contribuye a la hipometilación del ADN a nivel global en las células TCD4 de pacientes con LES. • Los resultados mostraron que el nivel de metilación del ADN en las células T DC4 en pacientes con LES fue significativamente menor que el del grupo control.
  21. 21. RESULTADOS Líneas roja punteadas control con isotopo, Línea azul control de pacientes sanos y línea amarilla pacientes con LES.
  22. 22. RESULTADOS UVB mejoro la hipometilación del ADN de manera dependiente de la dosis en las células T CD4 en pacientes con LES. • Exposición de las cell T CD4 a O, 20, 40,60 mJ/cm². • Diferencia en el nivel de metilación del ADN entre >20 mJ/cm² y 0 mJ/cm². • Nivel de metilación del ADN es < para las células tratadas con 40 y 80 mJ/cm².
  23. 23. RESULTADOS La metilación de las células T CD4 en pacientes con LES fue sensible a la exposición de UVB de forma dosis dependiente. • No diferencia significativa entre 20, 40, 80 mJ/cm². En los controles sanos . • Nivel de metilación del ADN se redujo en las células después de 40 y 80 mJ/cm². • A 20 mJ/cm². no alcanzo significación estadística.
  24. 24. RESULTADOS
  25. 25. RESULTADOS UVB no afecta la expresión de DNMT1 y proteínas en las células T CD4 en paciente con LES. • Se investigo el efecto de la exposición a UVB en la expresión de DNMT1 y proteínas. • Resultados  No hay cambios significativos = la expresión no se afecta con UVB.
  26. 26. RESULTADOS
  27. 27. RESULTADOS • Los niveles de expresión de DNMT1 no mostraron una diferencia. • Se encontró expresión de DNMT1 en las células T CD4 después de diferentes dosis de exposición a UVB.
  28. 28. DISCUSSION RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE Kastan Found that DNA methylation level was decreased after UVB exposure by studying in a phage DNA model. x Zhu We showed the level of global DNA methylation in CD4+ T cells from SLE patients was significantly lower than that from the control group, which indicated CD4+ T cells DNA hypomethylation was crucial for the development of SLE. x
  29. 29. DISCUSSION RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE Wang The data showed global DNA methylation level was significantly decreased in CD4+ T cells from SLE patients after 40 and 80 mJ/cm2 UVB exposure whereas no significant difference was found after 20 mJ/cm2 UVB exposure. x
  30. 30. DISCUSSION RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE Wang The data showed global DNA methylation level was significantly decreased in CD4+ T cells from SLE patients after 40 and 80 mJ/cm2 UVB exposure whereas no significant difference was found after 20 mJ/cm2 UVB exposure. x
  31. 31. CONCLUSION • DNMT1 expression level is significantly positive in SLE patients. • The down regulation of DNMT1 mRNA expression contributes to DNA hypomethylation. • This project is very important for new therapeutics targets. • UVB DNA hypomethylation improve but are dose dependent.
  32. 32. MAPA

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