1. PROFESORADO EN BIOLOGÍA PARA LA
EDUCACIÓN SECUNDARIA
INSTITUTO SUPERIOR DE FORMACIÓN PROFESIONAL “LA
MERCED” N° 8.155
MATERIA:
PROFESORA: DANIELA BARRAZA
AÑO: 2013

2. UNIDAD III
2- Amplificación del ADN, reacción en cadena de la polimerasa.
3- Aplicaciones prácticas de la Ingeniería Genética:
obtención de productos de mamíferos y de vacunas
mediante organismos genéticamente modificados,
ingeniería genética de plantas agrícolas, ingeniería
genética en animales y en genética humana.
1- Enzimas de restricción, clonación molecular, plásmidos
como vectores de clonación, el bacteriófago lambda como
vector de clonación.
.

3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Se denominan también endonucleasas de restricción, y
tienen como función reconocer ciertas secuencias
específicas en el ADN y cortarlo.
 Las enzimas de restricción mas utilizadas por la
ingeniería genética son las del tipo II.
 Estas enzimas se encargan de cortar o escindir los
enlaces fosfodiester que unen a los nucleótidos en cada
hebra de ADN.

5. CARACTERISTICAS DEL CORTE
 Cortan secuencias palindrómicas.

6.  Sistema restricción- metilación
Es un mecanismo de defensa que utiliza la célula para
proteger su propio ADN de la acción de las enzimas de
restricción.
Las enzimas de restricción y las de metilación reconocen la
misma secuencia en el ADN.
La metilación de las bases impide la unión de la enzima de
restricción, con lo que el ADN propio no es hidrolizado.
CARACTERISTICAS DEL CORTE

8. CARACTERISTICAS DEL CORTE
 Pueden dejar extremos romos o cohesivos.

11. CARACTERISTICAS DEL CORTE
 Las enzimas que
reconocen secuencias no
palindrómicas, realizan el
corte cerca de la secuencia
pero no dentro de ella.

12. ANÁLISIS DEL ADN MEDIANTE ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
1- Las enzimas de restricción fragmentan la molécula de
ADN a nivel de secuencias específicas.
2- Separación de los fragmentos de ADN generados por la
enzima de restricción, mediante una técnica denominada
ELECTROFORESIS.

13. ELECTROFORESIS
 Procedimiento por el cual, moléculas cargadas migran en un campo
eléctrico, su velocidad de migración estará determinada por la carga y el
tamaño de la molécula.
 En electroforesis en gel, las moléculas se separan en un gel que puede ser de
agarosa o poliacrilamida.
 El gel es una malla compleja de fibrillas , el tamaño del poro que se forma
es controlado por el experimentador, permitiéndole controlar la separación de
determinadas moléculas.

14. ELECTROFORESIS
MIGRACIÓN
Los ácidos nucléicos están cargados negativamente.
Una vez que se aplique corriente eléctrica, la velocidad de
migración con la que se desplace el ADN dependerá de la
forma y del tamaño de la molécula.
Moléculas pequeñas o compactas migran más rápido que
las de mayor tamaño.

15. ELECTROFORESIS
REVELADO
Se realiza una vez finalizada la corrida electroforetica.
Se tiñe el gel con un compuesto que se une al ADN.
Si se utiliza Bromuro de etidio, las bandas de ADN
fluorescen bajo la luz ultravioleta.
 La Electroforesis puede utilizarse para la separación de fragmentos de ADN,
para Mapeo de genes o Hibridación.

17. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
 Se desnaturaliza el ADN, para formar moléculas hibridas con otras
moléculas (ADN monocatenario o ARN), que posean secuencias
complementarias o casi complementarias (SONDAS).
 La Hibridación es útil para encontrar secuencias similares en elementos
genéticos diferentes o localizar un gen específico en una muestra compleja.
 Southern desarrollo una técnica para hibridar con sondas, fragmentos de
ADN que han sido separados por electroforesis en gel.

18. SOUTHERN
Los fragmentos de ADN del gel se trasfieren a una membrana y
se desnaturalizan.
La membrana se expone luego a una sonda marcada para
permitir que se formen híbridos, si la sonda llegase a ser
complementaria a cualquiera de los fragmentos.
Los sitios de hibridación pueden detectarse revelando el
marcaje que se ha unido a la membrana.
Las sondas pueden marcarse con radioactividad o con
agentes que producen compuestos coloreados e incluso
emiten luz.

20.  SOUTHERN BLOT: ADN en gel y sonda de ADN o
ARN.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
 NORTHERN BLOT: ARN en gel y sonda de ADN o
ARN.
 WESTERN BLOT: proteína en el gel y sonda
anticuerpo.

21. CLONACIÓN MOLECULAR
 Tiene como finalidad aislar grandes cantidades de genes
específicos o fragmentos cromosómicos en forma pura.
 La estrategia básica de la clonación molecular consiste en
trasladar el gen o región deseada desde un genoma grande y
complejo a otro pequeño y sencillo.

23. LOS PLÁMIDOS COMO VECTORES DE
CLONACIÓN
 Son vectores naturales por que llevan otros genes que confieren
propiedades importantes a sus hospedadores.
PROPIEDADES
Tamaño, mucho menor que el de un cromosoma.
Origen de replicación independiente de la replicación
del cromosoma.
Numero múltiple de copias.
Poseen marcadores de selección.

24. PBR322

25. USO DE PBR322 COMO VECTOR DE CLONACIÓN

26. EL BACTERIÓFAGO LAMBDA COMO VECTOR DE
CLONACIÓN
 Se conoce bien su genética.
 Puede retener mas ADN que la mayoría de los plásmidos.
 El ADN puede ser empaquetado eficientemente in vitro dentro de
partículas del fago.
 La infección por el fago es mas eficiente que la transformación.

27. CLONACIÓN CON LAMBDA
1- Aislamiento del ADN del vector a partir de partículas de fago y digestión con una
enzima de restricción apropiada.
2- Ligación de los fragmentos de lambda con fragmento de ADN foraneo usando
ADN ligasa (el ligando debe tener el tamaño adecuado para poder ser
empaquetado).
3- Empaquetamiento del ADN, añadiendo extractos de fago que contengan las
proteínas de la cabeza y de la cola, y permitan la formación de partículas de fago
viables.
4- Infección de E. coli y aislamiento de clones de fago, recogiendo las placas de
lisis generadas por una cepa.
5- Detección del ADN clonado en el fago recombinante, mediante hibridación de
ácidos nucléicos u observación de propiedades genéticas.

31. CÓSMIDOS
 Son vectores plasmídicos que contienen ADN foraneo y el
sitio cos (extremos cohesivos) procedente del genoma
Lambda.
 A diferencia de los plásmidos puede clonar grandes
fragmentos de ADN.
 Las partículas víricas son mucho mas estables que los
plásmidos.

33. AMPLIFICACIÓN DEL ADN (PCR)
 Puede multiplicar moléculas de ADN hasta miles de
millones de veces en un tubo de ensayo.
 Utiliza la ADN polimerasa para copiar moléculas de ADN.
 Es necesario disponer de oligonucleótidos cortos (primers o
iniciadores) complementarios de secuencias presentes en el
gen o genes de interés.

34. ETAPAS DE LA PCR
1- En un sintetizador de nucleótidos se fabrican los dos oligonucleótidos iniciadores
que flanquean el ADN diana y se añaden en gran exceso al ADN diana
desnaturalizado por calor.
2- Cuando se ah enfriado la mezcla, el exceso de iniciadores relativos al ADN diana
asegura que la mayor parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no
entre sí.

35. ETAPAS DE LA PCR
3- La ADN polimerasa alarga los iniciadores usando las bandas diana como moldes.
4- Después de un periodo de incubación adecuado, se calienta de nuevo la mezcla
para separar las cadenas. Luego se enfría la mezcla para permitir que los iniciadores
se hibriden con las regiones complementarias del ADN recién sintetizado y se
repite todo el proceso.

37. APLICACIONES DE LA PCR
 Para amplificar y clonar ADN de fuentes tales como los
restos humanos, muestras de animales o plantas ya
extinguidos.
 Amplificar y analizar ADN sin necesidad de hacer crecer
microorganismos, alcanzando un importante valor en el
diagnóstico microbiológico.
 Herramienta forense.