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  • 1.  
  • 2. PCR Polymerase Chain Reaction
    • Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.
    • El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
    • Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.
  • 3. Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa
    • Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.
    • Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.
    • Utilizo el PCR para amplificación del gen de  -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
  • 4. Termociclador Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo. Es el aparato que ciclifica las temperaturas necesarias para que se lleve a cabo la replicación del ADN requerido, por lo tanto, es programable .
  • 5.
    • 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
    • -Típicamente se usa una temperatura de 95 ˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-
    El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:
  • 6.
    • 2. Apareamiento o “anneling”:
    • Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.
  • 7.
      • 3. Polimerización o Extensión.
      • Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde
      • Se efectúa a 70 ˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario)
    Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
  • 8.  
  • 9. En el PCR hay una amplificación exponencial
  • 10. Reactivos necesarios para PCR:
    • Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
    • MgCl2 : Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-
    • dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
    • -La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.
    • -Generalmente, se usa una concentración de 200  M de cada uno.
  • 11. Reactivos necesarios para PCR:
    • Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1  M-
    • DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
    • El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.
    • Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.
  • 12.
    • En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli , pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.
    • Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “ Thermus aquaticus ” conocida como Taq pol
    Polimerasa
  • 13. Análisis de la Muestra
    • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.
    • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
  • 14. Análisis de la Muestra
    • En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas
    • Hibridación, Southern Blot
  • 15. Ventajas del “PCR”
    • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
    • El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
    • Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
    • Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.
  • 16. Desventajas del “PCR”
    • Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
    • Se necesitan “ primers ” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
    • La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
    • Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)
  • 17.