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1. “UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO
RODRIGUEZ DE MENDOZA”
ESPECTROSCOPIA, ESPECTROSCOPIA
INFRARROJA Y RAMAN, ESPECTROSCOPIA
DE FLORESCENCIA INTRÍNSECA,
EXTRÍNSECA Y TRANSFERENCIA.
DOCENTE: BLG. SANTOS EVARISTO INOÑAN CHOZO.
CURSO: ANALISIS INATRUMENTAL.
ALUMNAS: REBECA NOEMÍ ALVARADO GARCÍA.
MARYORI STEISSY VALDERRAMA RUÍZ.
ALEX ROCA DETEN.
INGENIERIA AMBIENTAL VII CICLO

2. ESPECTROSCOPIA
Es una técnica de análisis que se basa en la absorción de
radiación por parte de las moléculas.
Es el estudio de la interacción entre la radiación
electromagnética y la materia, con absorción o emisión de
energía radiante.
OBJETIVO
Es obtener las distribuciones espectrales de energía: el flujo
de energía recibido de los objetos celestes respecto a la
longitud de onda.

3. APLICACIONES
La química orgánica emplea la espectroscopia de resonancia
magnética para determinar la estructura de compuestos
orgánicos.
Permite la determinación de ángulos, longitudes de enlace,
conformaciones y frecuencias de vibración en moléculas.
En cinética se emplean métodos espectroscópicos con el
objetivo de conocer la variación de un reactivo o producto en
el tiempo.

4. EQUIPO
ESPECTROMETRO
Es un instrumento
óptico que se usa
para medir las
propiedades de la
luz sobre una
porción específica
del espectro
electromagnético.
Fue inventado por Gustav Robert Georg Kirchhoff y
por Robert Wilhelm Bunsen.

5. UTILIDAD
Se usa para producir líneas espectrales y
medir sus longitudes de onda e intensidades.
ESPECTRÓMETRO ÓPTICO
Es un instrumento que sirve
para medir las propiedades de
la luz en una determinada
porción del espectro
electromagnético.
ESPECTRÓGRAFOS
Es un instrumento que
transforma una forma de
onda de dominio temporal
entrante en un espectro de
frecuencia, o generalmente
en una secuencia de tales
espectros.

6. INSTRUMENTACION
FUENTE DE RADIACIÓN
Debe ser estable en su emisión de intensidad en las diferentes
longitudes de onda
MONOCROMADOR
Separa las
diferentes
longitudes de
onda y están
diseñados en
base a los
fenómenos
ópticos de
refracción y
difracción de la
luz.

7. LAS CELDAS O RECIPIENTES DE MUESTRA
Pueden tener diferente geometría pero deberán ser de material
transparente a la radiación que se emplea (IR, Vis, UV, etc.). No
deberán tener defectos ópticos y siempre se deberán poner en la
misma posición para compensar por las irregularidades de la
celda.
El solvente también deberá ser transparente a la radiación que se
emplea.

8. AMPLIFICADOR
Tiene como función el amplificar la señal eléctrica que se
genera en el transductor. consiste esencialmente de
componentes electrónicos que producen una intensidad de
corriente mayor a la que reciben para que pueda ser
procesada en el sistema de lectura.

9. ESQUEMA GENERAL DE LA INSTRUMENTACIÓN EN
ESPECTROSCOPÍA

10. ¿QUÉ ES LA ESPECTROSCOPIA INFRARROJA [IR]?
Se fundamenta en la absorción de la radiación IR por
las moléculas de vibración.
Se pueden distinguir dos categorías básicas de
vibraciones:
Tensión Flexión
Son cambios en
la distancia
interatómica a lo
largo del eje del
enlace entre dos
átomos.
Están originadas
por cambios en el
ángulo que forman
dos enlaces.

11. ESPECTROSCOPIA
INFRARROJA
Trata sobre la
parte infrarroja del e
spectro
electromagnético.
Que puede usarse para
identificar un compuesto e
investigar la composición de
una muestra.
Según el tipo de la radiación
que se analiza se divide en:
Espectroscopia
del Infrarrojo
cercano
Espectroscopia
del Infrarrojo
medio
Espectroscopia
del Infrarrojo
lejano

12. USO DE LA
ESPECTROSCOPIA
INFRARROJA
Se utiliza ampliamente tanto en
la industria como en la
investigación científica, porque
es una técnica rápida y fiable
para medidas, control de calidad
y análisis dinámicos.

13. ESPECTROSCOPIA RAMAN
Proporciona información detallada de la
molécula.
Se basa en el análisis de la
luz dispersada por el
material.
EFECTO RAMAN
Se produce cuando la luz incide sobre
una molécula e interactúa con la nube de
electrones de los átomos de esa
molécula.
Es un tipo de espectroscopia
vibracional.
Registra las vibraciones de los enlaces
covalentes en la molécula

14. VARIACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA RAMAN
• ESPECTROMETRÍA RAMAN ESPONTÁNEA: Utilizada para estudiar
la dependencia a la temperatura de los espectros Raman de las moléculas.
• ESPECTROMETRÍA RAMAN COMPENSADA ESPACIALMENTE:
Se obtiene de regiones compensadas lateralmente fuera del punto láser de
excitación, lo que disminuye significativamente las aportaciones de la capa
superficial.
• ESPECTROMETRÍA RAMAN DE PINZAS ÓPTICAS: Se utiliza para
estudiar partículas individuales, e incluso procesos bioquímicos en células
individuales atrapadas por pinzas ópticas.
• ESPECTROMETRÍA RAMAN DE RESONANCIA: Es útil para el
estudio de moléculas grandes, como los polipéptidos, que pueden mostrar
cientos de bandas en los espectros Raman "convencionales".

15. El triptófano es un aminoácido natural cuya cadena lateral contiene un grupo
indol sustituido en posición C3:
Estructura del Triptófano. Presenta un comportamiento foto físico complejo,
que aunque limita en muchos casos su utilización como sonda fluorescente en
distintos sistemas biológicos, siempre representa un buen punto de partida en
la caracterización de las proteínas nativas no marcadas.
FLUORESCENCIA INTRÍNSECA DEL TRIPTÓFANO

16.  El máximo de emisión del triptófano en medios acuosos está en
torno a 350 mm y presenta una fuerte dependencia con la
polaridad del medio y su micro entorno, por lo que su espectro
de emisión nos informa sobre la localización de este residuo en
la proteína. La presencia de múltiples residuos de triptófano en
una proteína complica la interpretación de los resultados ya que
no siempre es fácil separar las contribuciones de cada uno de
ellos al espectro de emisión.
 Otra característica importante de la emisión del triptófano es su
dependencia con la temperatura cuando se encuentra en
disolventes polares.

17. La proteína RepA se empleó fusionada en su extremo N-terminal a
un péptido His 6 toda vez que incrementa su solubilidad y no
altera su función in vivo. Con el fin de abreviar, en lo sucesivo nos
referiremos a His-RepA-WT como RepA-WT.
Caracterización de la proteína HIS-REPA-WT: fluorescencia intrínseca y
estudios de interacción con las secuencias del OPERADOR (IR)

18. Espectro de absorción
Para la realización de las medidas de fluorescencia de la proteína RepA-WT y
sus mutantes siempre se centrifugó previamente dicha proteína a 10000 rpm
durante 10min para la eliminación de posibles agregados. La concentración de la
proteína se calculó por su espectro de absorción tomando la medida de
absorbancia a 280nm sabiendo que Є280=17210 -1cm-1.
Espectro de absorción de
la proteína RepA-WT a la
concentración de 6 μM en
tampón 0.5M sulfato
amónico, 50mM acetato
amónico pH 6.0, 10mM β-
mercaptoetanol, 0.1mm
EDTA, 10% glicerol. La
medida fue realizada a
temperatura ambiente. El
paso óptico fue de 1cm.

19. PROTEÍNAS EXTRÍNSECAS DEL PSII.
La composición de las proteínas extrínsecas en el lado del lumen del PSII no se
conserva entre los diferentes organismos oxi-fotosintéticos (plantas, algas y
cianobacterias), aunque en su conjunto estas subunidades están funcionalmente
relacionadas.
Las tres proteínas tienen un comportamiento inusual, ya que no sólo existen
unidas a la membrana del tilacoide sino que también existen en el lumen en un
estado no ensamblado, en el cual tienen un tiempo de vida largo y son
competentes para un nuevo ensamblaje en condiciones de fotoinhibición se
despegan de la membrana, siendo resistentes a la degradación proteolítica cuando
están solubles en el lumen.

21. PsbO.
Esta proteína en plantas verdes tiene una masa molecular teórica de 26.5 kDa
aunque por experimentos de electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes se le asigna una masa molecular aparente de 33
kDa, por lo que también se le conoce con los nombres de 33 kDa, OEE1 u
OEC33.
La función que tradicionalmente se ha asignado a PsbO es la de estabilizar el
complejo de iones manganeso y, por ello, se la conoce también como MSP
(“Manganese stabilizing protein”). La resolución del PSII a 3.5 Å ha permitido
concluir que esta estabilización es indirecta, ya que realmente la proteína PsbO
estabiliza la conformación del esqueleto polipeptídico del lazo AB y del
extremo C-terminal de la proteína D1, que es la subunidad que proporciona
mayor número de ligandos al OEC.

22. PsbP
Esta proteína tiene una masa molecular de 20 kDa aunque estudios
experimentales le asignan una masa molecular aparente de 23 kDa. Por
ello, a esta proteína también se la conoce como 23 kDa, OEE2 u
OEC23. Es necesaria la presencia de la proteína PsbO para su unión;
sin embargo, aún no se conoce si está unida directamente a PsbO o si
ésta es sólo necesaria para crear el sitio de unión adecuado para PsbP,
pues puede reternerse en la membrana cuando la proteína PsbO se
elimina por un tratamiento suave con Tris o con urea.

23. PsbQ
Su masa molecular teórica es de 17 kDa, que coincide con la estimada
experimentalmente. Se refiere también a esta subunidad como 17 kDa
(también 16 ó 18 kDa), OEE3 o OEC17 (o OEC16, OEC18). Su
unión al PSII es de alguna manera diferente en plantas superiores y
algas verdes ya que se ha comprobado que PsbQ de Chlamydomonas
reinhardtii se une directamente al PSII, de manera independiente a las
otras subunidades extrínsecas. En plantas superiores es necesaria la
presencia de PsbP para la unión de esta proteína al PSII pero no se ha
podido concluir si PsbQ se une directamente a PsbP o si se une a
alguna subunidad intrínseca de PSII que ha sufrido algún cambio
conformacional por influencia de PsbP.

24. TRANSFERENCIA DE LA ENERGÍA DE EXCITACIÓN SIN RADIACIÓN
El estado excitado inicial puede ser un estado excitado singlet mayor o un nivel
vibracional del estado excitado singlet más bajo. Ya que la conversión interna ocurre
hacia el nivel vibracional más bajo del estado S1 en aproximadamente 10-13 a 10-11
s, cualquier proceso competidor que vaya a ocurrir a partir de este estado debe tener
una constante de velocidad de al menos 1011 l/mol-s. En el nivel vibracional más
bajo del estado excitado singlet una molécula tiene un tiempo de vida aproximado de
10-8 s, por lo que la transferencia de energía puede ocurrir por mecanismos
“colisionales” o no.
APAGAMIENTO COLISIONAL (COLLISIONAL QUENCHING).
El apagamiento colisional es un proceso bimolecular dependiente del “contacto”
entre la molécula excitada y el apagador (quencher). Es un proceso de difusión
controlada que requiere que el tiempo de vida del estado excitado sea mayor de 10-9
s. El mecanismo puede describirse como sigue:
F + hv _ F*
F* _ F + hv’
F* + Q _ F + Q

25. La molécula fluorescente F absorbe un fotón para dar F*, el nivel de equilibrio
del estado singlet excitado más bajo. F* puede emitir un fotón, hv’, y regresar al
estado basal (fluorescencia), o puede interactuar con la molécula apagadora Q,
perdiendo la energía de excitación y regresar a S0 sin emisión. Este mecanismo
simple es descrito por la ley de Stern- Volmer:
Fo/F = 1 + K[Q] = 1 + kq_S[Q]
En esta ecuación Fo es la intensidad de la fluorescencia en ausencia del apagador,
F es la intensidad de la fluorescencia a una concentración [Q] del apagador. K es
la constante de apagamiento de Stern-Volmer, kq es la constante de apagamiento
bimolecular y _S es el tiempo de vida del apagador.
Básicamente hay dos mecanismos por los cuales la pérdida “colisional” de la
energía de excitación puede ocurrir: intensificación del cruzamiento intersistemas
por el apagador, o transferencia de electrones. Una gran variedad de moléculas
pueden actuar como apagadores colisionales, que incluyen oxígeno, halógenos,
aminas y moléculas deficientes de electrones como arcrilamida. El mecanismo de
apagamiento varía con el par fluoróforo-apagador.

26. TRANSFERENCIA NO COLISIONAL.
Otro proceso importante que ocurre en el estado excitado es la
transferencia de energía por resonancia (RET). La transferencia de
energía que ocurre a través de distancias más grandes que la distancia
de colisión molecular es llamada transferencia de energía no colisional.
El proceso ocurre cuando el espectro de emisión de un fluoróforo se
sobrelapa con el espectro de absorción de un aceptor. El aceptor no
necesariamente es fluorescente. RET no involucra la emisión de luz por
el donador, esto es, no es el resultado de la emisión del donador siendo
absorbida por el aceptor. No hay un fotón intermediario en RET. El
donador y el aceptor están acoplados por una interacción dipolo-dipolo.
Por esta razón el término RET es preferido al término de transferencia
de energía por resonancia fluorescente (FRET), que también es muy
común. El proceso se resume como:

27. D + hv _ D*
D* + A _ D + A*
A* _ A + hv
donde la molécula donadora D, absorbe radiación y va al estado excitado D*. D* y
A, el aceptor, interactúan y la energía de excitación es transferida a A. Esta
molécula en su estado excitado, A*, puede emitir su propia fluorescencia
característica. El efecto neto es
que la energía de excitación es transferida de D a A. Si D y A tienen un nivel de
energía común, la energía será transferida de ida y vuelta entre ellos hasta que uno
la emita. Pero si el nivel vibracional más bajo del estado excitado de A se ubica por
debajo que el estado de equilibrio del donador, una vez que la energía se le ha
transferido, ocurre una conversión interna rápidamente a su nivel vibracional más
bajo.
El grado de transferencia de energía está determinado por la distancia entre D y A,
y el grado de sobrelapamiento espectral.

28. Procesos de Transferencia de energía resonante (FRET)
Interacción dependiente de la sexta distancia que se produce en el estado excitado y
en la cual la emisión de un fluoróforo está acoplada a la excitación de otro. La
energía de excitación puede ser transferida por medio de un mecanismo no
radiativo de acoplamiento dipolo-dipolo a un fluoróforo vecino. Se produce la
promoción de un electrón del aceptor a un estado singlete de mayor energía
mientras el electrón excitado del donador retorna al estado fundamental. Los
métodos FRET se utilizan para determinar distancias intra e intermoleculares de
proteínas y en general complejos macromoleculares en el intervalo de 10- 100Ǻ.
Aunque las distancias son menos precisas que las determinadas por cristalografía
de rayos X o NMR, la técnica de FRET es útil para caracterizar cambios
conformacionales en macromoléculas en disolución y en condiciones muy cercanas
a las fisiológicas. La eficiencia de transferencia de energía viene definida por:
E=1-Fda/Fd
donde Fday Fd son las intensidades de fluorescencia del donador en presencia del
aceptor y del donador sólo respectivamente.

29. La relación entre la eficiencia de transferencia y la distancia entre el
donador y el
aceptor (R) viene dada por la ecuación:
E= R06/(R06+R6)
La hidratación de una proteína suele tomar valores entre 0.2 y 0.4 gramos
de agua por gramo de proteína No es el número de Avogadro
efecto de la transferencia de energía en la anisotropía de
fluorescencia
La transferencia de energía entre fluoróforos con momentos dipolares
orientados formando un determinado ángulo produce un desplazamiento
angular adicional del momento de transición de emisión, que da lugar a
una disminución de la anisotropía de fluorescencia.

30. ¡¡¡¡¡GRACIAS!!!!!