Master Restagno 27 Giu 08

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Master Restagno 27 Giu 08

  1. 1. DIAGNOSI PRENATALE NELLE MALATTIE RARE: aspetti della diagnosi citogenetica e sul DNA Gabriella Restagno S.S. Diagnostica Molecolare e Test Genetici Integrati AO OIRM-S.Anna, Torino gabriella.restagno@oirmsantanna.piemonte.it Torino, 27 GIUGNO 2008
  2. 2. Questioni etiche Qualche esempio: Cardiopatie congenite Sindrome di Prader-Willi Forme atipiche di fibrosi cistica Le tecnologie impiegate per la diagnosi
  3. 3. Etica L’etica ed i princìpi etici si estendono a tutte le sfere dell’attività umana Si applica ai rapporti interpersonali, con il mondo animale e con l’ambiente Deve governare le interazioni non solo nella ricerca ma anche nella vita in genere e nella società Serve ad identificare i comportamenti buoni, desiderabili o accettabili, e a dare le ragioni per tali scelte comportamentali Include l’intero campo della scienza morale, e va aldilà dei princìpi morali e delle regole di condotta
  4. 4. Etica e genetica I genetisti hanno l’obbiettivo e la responsabilità di favorire la salute e il benessere dei pazienti, delle loro famiglie e della comunità in cui prestano servizio. Questo criterio di responsabilità professionale non richiede semplicemente di eseguire i test genetici e di utilizzare le nuove tecnologie ma di utilizzarle in modo non acritico. L’etica può influenzare il genetista a diversi livelli: 1. Etica personale 2. Etica professionale 3. Etica specifica della professione (protocolli scientifici e standard di organizzazione del laboratorio, e di avanzamento della professionalità)
  5. 5. Aspetti etici peculiari in genetica 1. L’etica del contatto indiretto con il paziente: il contatto con il paziente è generalmente mediato dal clinico. Ciò pone un problema sul principio di autonomia, ma anche su quelli di giustizia, beneficialità e non maleficenza. 2. Il lavoro di laboratorio presenta rischi fisici sia per i laboratoristi sia per il paziente: per es, lo scambio di campioni può portare ad una diagnosi scorretta e ad un trattamento inappropriato per il paziente. Inoltre c’è il rischio dell’uso scorretto delle informazioni derivanti dall’analisi (informazioni sensibili, discriminazione). 3. Conservazione dei campioni di DNA per controlli di qualità, sviluppi di nuove metodologie, ricerca: sorgente di informazioni aggiuntive successive sul paziente (e sui suoi familiari) cui il paziente può non avere dato il consenso
  6. 6. La diagnosi molecolare delle malattie genetiche Lo sviluppo della genetica molecolare ha portato all’individuazione di numerose mutazioni genetiche che sottendono a malattie spesso di notevole gravità e incurabili (ad es., la malattia di Huntington, il rene policistico dell’adulto autosomico dominante ecc..) Ciò permette di diagnosticare la malattia nel soggetto sintomatico, ma ha fatto sorgere rilevanti problemi etici. Diagnosi di malattie genetiche croniche nei soggetti asintomatici a rischio Identificazione di marcatori genetici di rischio di malattia Diagnosi prenatale di malattie genetiche croniche
  7. 7. Diagnosi prenatale di malattie genetiche croniche La diagnosi prenatale di malattie genetiche è oggi molto diffusa, in presenza di un rischio noto di trasmissione di particolari malattie non curabili e clinicamente gravi, quali la distrofia muscolare di Duchenne. È ovvio che questa indagine prelude alla possibilità di interruzione della gravidanza in caso di positività del test. La diagnosi genetica prenatale pone almeno due problemi etici: il primo è quello relativo alla sensibilità e al valore predittivo del test genetico il secondo quello relativo alla scelta di interruzione di gravidanza in caso di malattie genetiche scarsamente invalidanti o che si manifestano solo in età adulta o avanzata.
  8. 8. LE NUOVE TECNOLOGIE PONGONO NUOVI PROBLEMI ETICI •Pannelli per l’analisi rapida delle mutazioni più frequenti, determinate su basi epidemiologiche (kit anche fai da te) •Analisi contemporanea di un elevato numero di mutazioni note e non note, anche in geni diversi: (multiplex PCR) •Sequenziamento in tempo reale •Analisi con microarray e macroarry •WGA, CGH ecc…
  9. 9. Problemi etici in genetica: : interpretazione del significato delle mutazioni Database Anamnesi familiare Mutazioni “de novo” Espressione variabile (geni modificatori, eterogeneità allelica o di locus, fattori ambientali, pleiotropismo) Penetranza incompleta
  10. 10. Prevalenza delle cardiopatie congenite (CC) Sono la forma più comune di difetto alla nascita (1/145 nati vivi) Un quarto associato a dismorfismi (diagnosi di sindrome) Nel 11.9% associate anomalie cromosomiche, nel 7,4% mutazioni geniche Nelle CC isolate raramente la causa è monogenica; poiché la prevalenza nei familiari di pazienti con CC isolata è superiore a quella solo probabilistica (2%-16% contro 0,4%-0,8%) si ipotizza una componente genetica
  11. 11. CAUSE GENETICHE NOTE DI CC (20%) SINDROMI MENDELIANE SINDROMI CROMOSOMICHE EREDITA’ MENDELIANA-NON SINDROMICA NON MENDELIANE-NON SINDROMICHE
  12. 12. I principali stadi dello sviluppo cardiaco nel topo e l’espressione delle proteine nella morfogenesi (studi su topi “knockout”) Da Nemer M, 2008
  13. 13. I siti delle CC maggiori. Lo stesso fattore di trascrizione è correlato a difetti differenti, e lo stesso difetto può essere causato da più di un gene (eterogeneità allelica ed eterogeneità genetica) Da Nemer M, 2008
  14. 14. Tecnologie di diagnosi citogenetica e sul DNA DPN invasiva
  15. 15. Cariotipo “classico” Prepared from chromosome metaphase spreads Requires dividing cells Each chromosome has its unique staining pattern Results need to be read and interpreted by a certified cytogeneticist Resolution of technique is ~5 Mb
  16. 16. Test “rapidi” prenatali per le sindromi da aneuploidia QF-PCR FISH Array- CGH
  17. 17. QF-PCR Triploidy QF-PCR Trisomy 13
  18. 18. QF-PCR Trisomy 21 QF-PCR Trisomy 18
  19. 19. Casistica Centro Ecografia e Struttura di Genetica S.Anna Torino 2003- 2007 (6050 casi): - 4704 QF-PCR su LA - 1340 QF-PCR su CV Risultati patologici: 278/6050 (4,5%) 163 trisomie 21 (2,7%) 62 trisomie 18 (1,02%) 20 trisomie 13 (0,3%) 5 triploidie (0,08%) 15 Turner s. (0,25%) +21, +18 and +13 mosaicismi: 13 (0,21%)
  20. 20. METODICA FISH FISH (fluorescence in situ hybridization) Requires investigation of several dividing cells Microscopic visualization of fluorescent probes specifically binding to complementary regions of the chromosome Resolution 100 – 500 kb
  21. 21. FISH per Diagnosi di DiGeorge S.
  22. 22. SNPs per Diagnosi di DiGeorge S.
  23. 23. SNPs per Diagnosi di DiGeorge S.
  24. 24. aCGH permette il passaggio da dati soggettivi a dati quantitativi Today’s predominant technology Microscopic imaging of chromosomes aCGH provides a visual representation of data generated
  25. 25. La corretta diagnosi è fondamentale per il calcolo del rischio di ricorrenza Journal of American College of Cardiology, 2003, 42:923-29
  26. 26. Come sta cambiando la classificazione genetica della FC Da malattia “monogenica” a malattia complessa
  27. 27. Basi genetiche “semplici” e basi genetiche “complesse” Ereditarietà “semplice”, correlazione Genotipo-fenotipo Caratteri Complessi: interazione Geni + ambiente
  28. 28. Genotype-Phenotype Correlations Sweat gland: GOOD Genotype Pancreas: GOOD Lung: BAD Adapted from Welsh and Smith. Sci Am. 1995;273:52-59.
  29. 29. Mutazioni CFTR e conseguenze cliniche CBAVD, COPD, Normale pancreatite, PS CF PI etc. Scala di gravità Mutazioni tipiche Mutazioni atipiche
  30. 30. Effettori del fenotipo CFTR Genotipo CFTR Difetto di base Geni modificatori Sintomi Fattori ambientali
  31. 31. Effettori di CF tipica e atipica genotipo CFTR Geni modificatori CF tipica Fattori ambientali genotipo CFTR Geni modificatori CF atipica Fattori ambientali
  32. 32. Potenziali geni modificatori Inibitore delle Proteasi (PI): mutazioni Z e S Emocromatosi ereditaria (HFE): Cys282Tyr Transforming growth factor beta (TGFβ1) Mannose Binding Lectin-2 (MBL2)
  33. 33. Esempi di malattie oligogeniche Malattia OMIM 1° locus 2° locus Effetto Fibrosi 603855 CFTR CFM1 Soppressore Cistica Sordità 220290 GJB2 GJB6 Digenico congenita Retinite 180721 RDS ROM1 Digenico pigmentosa Cistinuria 600918 SLC7A9 SLC3A1 Digenico? tipoIII Ipercolester. 143890 LDRL 13q Soppressore familiare SMA 603011 SMN1 H4F5 Modifica gravità SLA 147450 SOD1 CNTF Modifica gravità Usher tipoI 276903 USH3 MyoVIIA Sinergico

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