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Calautti enzo applicazioni terapeutiche delle cellule staminali epiteliali-torino gennaio 2011-14° conve
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Calautti enzo applicazioni terapeutiche delle cellule staminali epiteliali-torino gennaio 2011-14° conve

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  • 1. 20/03/2011 Applicazioni terapeutiche dei cheratinociti staminali Applicazioni terapeutiche delle cellule a) rigenerazione dell’epidermide staminali epiteliali: stato dell’arte e epiteliali: prospettive future Enzo Calautti ecalautti@dti.telethon.it b) rigenerazione dell’epitelio corneale Centro Biotecnologie Molecolari Universita’ di Torino Torino, 22 gennaio 2011L’epidermide: L’epidermide e’ un tessuto autorinnovante composto da:•E’ l’epitelio stratificato della pelle •cheratinociti proliferanti, nello strato basale, separati da una lamina basale dal derma sottostante.•Ha la fondamentale funzione di barriera fisico-chimica del corpo umano fisico- •cheratinociti differenzianti negli strati suprabasali Desquamation Keratinocye desquamation Keratinocye differentiation I cheratinociti rappresentano circa il 90% delle cellule che compongono l’epidermide I fibroblasti sono il tipo cellulare predominante nel derma Keratinocyte Scambi di segnali tra epidermide e derma sono importanti proliferation (keratinocyte stem cells) per l’omeostasi del tessuto Il follicolo pilifero, di derivazione epiteliale, contiene cheratinociti staminali nella zona del “bulge”, capaci di rigenerare anche l’epidermide interfollicolare e le ghiandole sebacee in seguito a danni Stem Cell TA Progeny Self-renewal - Differentiation I cheratinociti staminali presenti nello strato basale dell’epidermide costituisco circa 1-5% delle cellule proliferanti e permettono l’autorinnovamento di questo tessuto le cui cellule vengono rinnovate ogni 4 settimane per tutta la vita dell’individuo I cheratinociti staminali hanno la capacita’ di dividersi in seguito a certi stimoli generando sia un pool di cellule uguali a se stesse (preservando il compartimento staminale) sia una progenie di cheratinociti indirizzati al differenziamento 1
  • 2. 20/03/2011 Epidermal stem cells properties Le proprieta’ delle cellule staminali- Poorly differentiated Cellule Transit Amplifying (TA)- High capacity for self renewal with an increased potential for error- Staminali proliferanti - Sono indifferenziate e free proliferation and cell division proliferanti- Long life span - Danno origine a cellule- Long cell cycle under homeostatic conditions (quiescence) figlie con destini- High telomerase activity differenti- Stem Cell division can be asymmetric or symmetric • Una mantiene la caratteristica- Molecular markers poorly defined (integrins α6, β1, p63 transcription Cellule destinate proliferanti staminale factor). Differences in SC markers between humans and rodents • L’altra differenzia perdendo la capacità Cellule Stem cell transient amplyfing cell post-mitotic cell terminally differentiated differenziate di proliferare. non-proliferanti cell Il microambiente (nicchia) regola la biologia Come sono nate le procedure cliniche basate delle cellule staminali sull’espansione di cheratinociti staminali in coltura? - Anni ’70: la prima coltura di cellule epiteliali, ottenute da teratoma murino, Sicuramente i fattori ambientali hanno peso nel determinare la su un supporto di cellule “feeder” che producono fattori di crescita tali da divisione asimmetrica; prevenire la senescenza cellulare e il differenziamento in coltura Il numero di cellule staminali e’ regolato in modo da favorire Anni ’70 (H. Green): cellule epiteliali, derivate l’omeostasi del tessuto (la progenie di una staminale non e’ da teratoma murino, potevano essere espanse sempre 1 stem e 1 TA cell). in coltura se coltivate su un supporto di fibroblasti murini embrionali immortalizzati e In casi particolari (danno tessutale) vi puo’ essere irradiati letalmente (feeder layer) amplificazione del numero delle cellule staminali Si ritiene infatti che l’ambiente in cui risiede una cellula staminale (nicchia staminale) giochi un ruolo chiave nel regolare l’autorinnovamento e il differenziamento di queste Da questa osservazione si e’ ipotizzato che anche cellule epiteliali umane normali come i cellule cheratinociti potessero crescere su feeder layer - 1977 (Rheinwald & Green): mezzi addizionati di EGF favoriscono la capacita’ replicativa a lungo termine dei cheratinociti umani in coltura Saggio funzionale di staminalita’: “Colony Forming Efficiency” Holoclones: large with smooth circular perimeter. Are the stem cells of virtually all human squamous epithelia and are required to restore massive epithelial defects. Meroclones: wrinked perimeter. They have intermediate proliferative and clonegenic potential; they give rise to and are a reservoir for paraclones. Paraclones: small and highly irregular perimeter. They have the properties of transient Concetto importante emerso da questi studi: amplyfing progenitor cells: grow rapidily at first, but their total lifetime is no more than 15 cell la capacita’ replicativa a lungo termine dei cheratinociti in generations, after which their growth is arrested (involucrin). coltura e’ direttamente proporzionale alla loro capacita’ di -Anni 80 (Barrandon and Green): Classificazione dei tipi di cloni generati da formare un numero elevato di colonie grandi e regolari singoli cheratinociti e aventi una diversa capacita replicativa in coltura. 2
  • 3. 20/03/2011 I chertatinociti staminali epidermici umani sono utilizzati in protocolli terapeutici di medicina rigenerativa Trattamento di pazienti con ustioni estese Trapianto autologo di epidermide coltivata in vitro Ustioni sul 45-50% della superfice corporea Escarectomia mediante Preparazione del sito di Escissione tangenziale innesto del tessuto Rigenerazione Keratinocytes grow in epidermica macroscopic colonies when seeded on completa e stabile a feeder layer ( lethally irradiated mouse fibroblasts) Transplantation, 1999, 68(6):868-879 L’uso di fibrina: L’uso di fibrina: • non altera le funzioni di staminalita’ • migliora la manipolazione del foglietto epiteliale • evita il trattamento enzimatico per il distacco del foglietto epiteliale - fibrina + fibrina L’aspetto critico per il successo di questa procedure e’ che nei foglietti epiteliali generati in vitro sia presente un numero adeguato di cellule staminali (holoclone forming cells) Un foglietto di epidermide umana coltivata in vitro e trapiantata in un topo immunodepresso, dopo 108 giorni, all’analisi istologica rivela: 1) la capacita di generare un epidermide umana, le cui cellule sono positive ad anticorpi involucrina uomo-specifici e uno spesso strato corneo, tipico del tesuto umano La deteminazione degli olocloni nella pratica clinica e’ ancora 2) caratteristiche di autorinnovamento conferitogli dalla presenza di cheratinociti staminali il miglior indicatore della presenza di keratinocyte stem cells nel foglietto trapiantato. Tali cellule sono state in grado di generare cheratinociti differenzianti e costituire cosi’ tutti gli strati dell’epidermide e di garantire un ricambio dei diversi strati cellulari ogni 30 giorni circa. La determinazione del numero di olocloni in una coltura e’ difficile e laboriosa.InvolucrinaUmana + Nella pratica clinica, abbiamo bisogno di saggi alternativi (spesso quando e’ necessario procedere tempestivamente).epidermide Un buon sostituto e’ la derminazione del numero di colonie abortive (paracloni) che e’ inversamente proporzionale al numero di olocloni (< di 10%) 3
  • 4. 20/03/2011 Epiteli stratificati della superficie oculare: Congiuntiva, Cornea e Limbus L C: Cornea L: Limbus CJ: CongiuntivaCornea:L’epitelio corneale e’ stratificato, non corneificato e trasparente. Human Corneal EpitheliumHa la funzione di barriera ma soprattutto grazie alla sua trasparenza permette ilPassaggio della luceE’ autorinnovante nonostante i cheratinociti che lo compongono siano gia “committed”al differenziamento cheratinociti rappresentano circa il 90% delle cellule che compongono l’epitelio corneale Ex vivo Corneal Cell Therapy Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro 1) Limbal biopsy 2) Limbal keratinocyte isolation Ad admission Afetr limbal culture Transplantation (It must contain stem cells) 3) Limbal keratinocyte in vitro expansion on a feeder layer 4) Cultured limbal epithelium on a fibrin After limbal culture+ gel Keratoplasty 5) GRAFTING 4
  • 5. 20/03/2011 Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro Dati clinici dimostrano che grafts che contengono < 3% di cellule che esprimono alti livelli di p63 hanno un alto rischio di insuccesso 1) Limbal biopsy2) Limbal keratinocyte SAGGI FUNZIONALI IN VITRO: isolation •Clonogenic assay LIMBUS CORNEA •Stem cell marker: p63+cells>3% Resting stem cells3) Limbal keratinocyte in vitro expansion on a feeder layer Ad admission Afetr limbal culture4) Cultured limbal epithelium on a fibrin Self-renewal Proliferation+migration Wound healing and terminal differentiation gel Proliferation potential Afetr limbal culture+ 5) GRAFTING Keratoplasty More than 75% of success rate in a study on 112 patients treated The rate of success directly correlates with the presence of p63-bright, with autologous limbal stem cells grafts containing >3% p63 bright cells holoclone-forming cells (stem cells) in the limbal grafts Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine Opacita’ corneale: Trapianto o non trapianto? Le sfide attuali nelle terapie rigenerative della cornea Trapianto di cornea: • e’ indicato nei casi in cui l’epitelio limbare sia integro e dunque in grado di colonizzare e rinnovare a lungo termine l’epitelio corneale E’ possibile mantenere ed espandere cellule staminali limbari •non e’ indicato nei casi di deficit limbari per trauma In pazienti in cui il pool di cellule staminali endogene è meccanico, chimico o reazioni immunologiche o seriamente compromesso? cause genetiche Possiamo trovare fonti alternative di cellule staminali per trattare I deficit completi bilaterali di cellule staminali limbari? •viene associato al trapianto di cellule limbari coltivate nel caso in cui lo stroma corneale sia molto compromesso : (rimozione del panno congiuntivale, trapianto di foglietto limbare coltivato, cheratoplastica (trapianto di cornea) 5
  • 6. 20/03/2011 Activated Akt and p63 are not found in the corneal epithelium, E’ possibile disegnare strategie per l’espansione ex vivo depleted for keratinocyte stem cells delle cellule staminali epiteliali? Limbus Cornea Possiamo manipolare farmacologicamente i segnali cellulari responsabili dell’autorinnovamento e differenziamento dei cheratinociti staminali limbari?Ricerca di target moleculari per l’espansione ex vivo di cellule staminali P63/p-Akt P63/p-Akt Terapia genica di malattie ereditarie mediante la correzione genetica cellule staminali Gene Therapy ex vivo Inserimento del gene terapeutico in cheratinociti staminali tramite vettori virali, seguita da amplificazione delle cellule Generazione di un epitelio geneticamente corrette su feeder layer geneticamente corretto Nell’epidermolisi bollosa, le funzioni adesive delle cellule epidermiche dello strato basale sono compromesse Epidermolisi bollosa 6
  • 7. 20/03/2011 Mavilio et al., Nature Medicine, 2006 Mavilio et al., Nature Medicine, 2006 Prospettive terapeutiche: Cellule staminali embrionali (ES cells) riprogrammazione totipotenti pluripotenti•Cellule staminali embrionali (spesso chiamate “pluripotenti”) capaci didifferenziare in tutti i tipi cellulari dell’organismo•Cellule staminali adulte o tessuto specifiche (difficili da identificare,isolare, e purificare. 7
  • 8. 20/03/2011 Le ES cells, in vitro (uomo e topo) e in vivo (topo) Le cellule adulte possono essere riprogrammate a possono differenziare in tutti i tipi cellulari maturi uno stato di pluripotenza analogo a quello delle cellule staminali embrionali (ES cells) Induced pluripotent stem cells (IPs cells) (cellule staminali pluripotenti indotte) Sono state generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) a partire da fibroblasti dermici umani (HDF) introducendo i retrovirus esprimenti i fattori trascrizionali OCT 3/4, SOX 2, c-Myc e KLF4Dopo 2 settimane compaiono colonie granulate(C) morfologicamente diverse alle cellule hES, ma dopoaltri 10 giorni si osservano colonie piatte(D) simili a quelle formate da cellule hES Cheratinociti umani del follicolo pilifero •Transdifferenziamento in senso limbo-corneale •Riprogrammazione a cellule iPS 8
  • 9. 20/03/2011 ambientale divisionale Ringraziamenti Fondazione Telethon Regione Piemonte Molecular Biotechnology Center Centro Regionale Trapianti del Piemonte Fondazione Banca degli occhi del Veneto Divisione cellulare asimmetrica In vivo, activated Akt is found in cells expressing high levels of p63, a putative stem cell marker of the limbal epitheliumAttualmente le applicazioni terapeutiche delle cellulestaminali (terapie cellulari e geniche) sono strettamenteregolamentate da norme di. Good Manufacturing Practice (GMP)Le terapie cellulari seguono le stesse regole dellaproduzione di un farmaco (sono regolamentate dall’agenzia AIFA in Italia) che approva le procedure B- DAMAGEterapeutiche.Devono essere eseguite in strutture dedicate approvatedall’AIFA come conformi alle GMP C- CORNEAL CONJUNCTIVALIZATION pAkt/p63 Limbal Epithelium-”Holoclones”: cloni di cheratinociti con la piu’elevata capacita’ replicativa e sonooriginati da cheratinociti staminali.Quando colture di cheratinociticontenenti olocloni vengono Nello stroma cornealetrapiantati sono capaci di rigenerareun epitelio autorinnovante per tutta l’organizzazione della vita collagene in fasci perpendicolari garantisce-Merocloni e Paracloni :danno origine a cloni di cheratinociti la trasparenza del tessutogia indirizzati al differenziamento e alla lucedunque incapaci di mantenere ilrinnovamento dell’epidermide Lo stroma corneale e’ avascolare Lo stroma corneale 9
  • 10. 20/03/2011Limbus: epitelio stratificato posto tra congiuntiva e cornea riconosciuto come la Le cellule pluripotenti sono in grado di differenziare innicchia staminale dell’epitelio corneale: cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrionaliI cheratinociti staminali sono interdispersi nello strato basale e proliferante L L Limbus Epithelium Bowman Layer Stroma Bowman Layer END Cheratinociti Limbari primari generano cloni di keratinociti staminali e differenzianti Ricostituzione del follicolo pilifero Oloclone: H1 Meroclone:M1 H1, H2: Olocloni, cloni di cheratinociti derivanti M1, M2: merocloni, cloni di cheratinociti derivanti da da una singola cellula staminale in coltura una singola cellula transient amplifying in coltura 10