2009 Convegno Malattie Rare Todros Restagno  [22 01]
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Tecnologie avanzate per la diagnosi prenatale

Tecnologie avanzate per la diagnosi prenatale
non invasiva di malattie genetiche e
cromosomiche e per la predittività delle complicanze nella gravidanza

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    2009 Convegno Malattie Rare Todros Restagno  [22 01] 2009 Convegno Malattie Rare Todros Restagno [22 01] Presentation Transcript

    • Contributi Regionali alla Ricerca Sanitaria Nazionale Programma strategico- Area tematica 4- Salute della donna-area materno-infantile anno 2007 Tecnologie avanzate per la diagnosi prenatale non invasiva di malattie genetiche e cromosomiche e per la predittività delle complicanze nella gravidanza Destinatario Istituzionale: Piemonte Tullia Todros Responsabile Scientifico del Progetto Capofila Gabriella Restagno Torino, 22 gennaio 2008
    • Unità operative del progetto strategico direttamente coinvolte dal Piemonte Prog. 1- Early markers predictive of pregnancy complications (UO1, coordinatore,UMF) and new technology for non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidies (UO2, S.S. Diagnosi e Consulenza Genetica) Prog. 2- Identification of inflammation markers as early indicators of pregnancy complications (Dipartimento Medicina Sperimentale, Università “La Sapienza”, Roma) Prog. 3- Advanced genomic technologies for non- invasive prenatal diagnosis of genetic diseases and monitoring of pregnancy complications (Unità di Genomica, Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano)
    • Progetti strategici 2007 accorpati a livello nazionale con capofila il Piemonte Development of a method for non invasive prenatal diagnosis of genetic disorders and its transfer into the national health system (Regione Sardegna) A new protocol for prenatal diagnosis (Regione Toscana) Analysis of the results from 30 years experience of prenatal diagnosis for genetic anomalies as a basis for the development and validation of innovative diagnostic protocol (Regione Liguria) Harmonization of prenatal diagnosis, genetic counselling and development of an original tool for recovery of foetal cells from the maternal blood based on a microelectronic chip tecnique (IRCCS S. Giovanni Rotondo) Development of guidelines for offering tests in pregnancies at risk: implementation of processes of evaluation of genetic tests (Regione Emilia-Romagna)
    • Prog 1 – UO1: Marcatori precoci di complicanze della gravidanza PREECLAMPSIA E IPOSVILUPPO FETALE La preeclampsia (PE) colpisce il 5-8% delle donne gravide e rappresenta una delle principali cause di mortalità e morbilità materna, di mortalità e morbilità perinatale e di esiti neurologici dovuti a fetal growth restriction (FGR) e/o parto pretermine. Non esistono ad oggi possibilità di prevenzione e terapia efficaci, se non l'espletamento del parto; ciò riflette il fatto che l'eziologia della PE non è nota e molti aspetti della sua patogenesi devono essere ancora chiariti.
    • INFIAMMAZIONE/INFEZIONE I patogeni più probabilmente implicati sono quelli coinvolti nelle patologie cardiovascolari, come l'Helicobacter pylori, associato a danno endoteliale e attivazione piastrinica. L'infezione da H.pylori è più frequente nelle donne affette da PE che nei controlli [Todros T et al. Expert Rev Obstet Gynecol 2007]. Ipotizziamo che anche altre infezioni possano avere un ruolo eziologico. Marker generico di infiammazione/infezione: EPCIDINA
    • OBIETTIVI UO1 (UMF) Verificare, mediante uno studio prospettico, se la rilevazione di infezione da Helicobacter pylori ed il dosaggio di epcidina nel corso del I trimestre di gravidanza possano essere utilizzati come test di screening per identificare un gruppo di gravide ad elevato rischio di sviluppare preeclampsia (PE) e/o restrizione di crescita fetale (FGR, Fetal Growth Restriction).
    • TEMPI DI SVILUPPO DEL PROGETTO 1 Gantt Diagram PROJECT 1 (Coordinator) months 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Recruitment of patients and data collection Collection, processing and storage of samples Optimization of quantitative immunoenzimatic tests Serological tests Collection of follow-up data activities Data analysis Recruitment of patients and data collection Collection and processing of blood samples Fetal DNA extraction from maternal plasma Optimization of methods Collection of follow-up data Quantification of paralogous sequence for fetal aneuploidy detection Data analysis UO1 UO2
    • UO2: Perché la DP non invasiva Le aneuploidie sono l'indicazione maggiore alla diagnosi prenatale invasiva. La DP invasiva ha un rischio di aborto di circa 1% ed è eseguibile solo in Centri di ecografia prenatale specializzati e collegati a laboratori specialistici di Genetica e Citogenetica. Recentemente approcci alternativi a tale diagnosi (come l’analisi del DNA fetale nel plasma materno) dimostrano che in un futuro prossimo potranno essere applicati, in casi selezionati, in luogo del prelievo di villi coriali o dell'amniocentesi. Soprattutto nelle situazioni in cui il rischio di aneuploidia è trascurabile, sarebbe un enorme vantaggio per la salute materno-fetale avere a disposizione tecniche di diagnosi non invasiva che abbiano elevata affidabilità.
    • Le tecnologie di routine di diagnosi citogenetica e sul DNA in DPN invasiva non sono attualmente trasferibili alla DPN non invasiva DPN invasiva Sequenza del DNA QF-PCR Cariotipo
    • Problematiche della DPN non invasiva Il DNA libero fetale nel plasma materno ha una concentrazione bassa (0,4%): è necessaria una ottimizzazione della separazione e concentrazione del DNA libero fetale Necessità di aumentare la concentrazione del DNA fetale (diminuire il background materno) in abbinamento a metodiche di rivelazione sensibili, ad elevata produttività e costi accessibili
    • La DPN non invasiva: stato dell’arte Lo YM et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. PNAS, 2008 Dec 23,105(51):20458-63 Quake SR et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood PNAS, 2008 Oct 21,105(42):16266-71 Holzgreve W et al. Isolation of serum nucleic acids for fetal DNA analysis: comparison of manual and automated extraction methods. Prenat Diagn. 2008 Dec;28(13):1227-31 Chitty LS et al. SAFE-The Special non- invasive Advanced in Fetal and Neonatal Evaluation network: aims and achievements. Prenat Diagn. 2008, Feb 28(2):83-8 Rouillac-Le Sciellour C. Noninvasive fetal RHD from maternal plasma. Use of a new developed free DNA fetal Kit RhD. Tranfus Clin Biol. 2007 Dec,14(6).572-77 Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta- thalassemia Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14
    • OBIETTIVI UO2 (S.S.Diagnosi e Consulenza Genetica) Valutare la fattibilità della diagnosi prenatale (DPN) non invasiva mediante l’analisi quantitativa di sequenze paraloghe di origine fetale nel plasma materno con metodiche di real-time PCR
    • UO2, Dati preliminari: Sensibilità di PSQ96 Dati preliminari di sensibiltà del metodo (UO2): diluizioni in serie di un allele mutato in eterozigosi (5-10 pg) in presenza di Dna wild- type (40 ng)/ il limite di detection è 5 pg (un genoma- equivalente corrisponde a 6,6 pg di DNA che è il contenuto di una cellula diploide Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta- thalassemia Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14
    • UO2, Dati preliminari: aumento della sensibilità con PNA Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14
    • Geni paraloghi del cromosoma 21 21 22 15 5 8 6 11 Processed 18 9 7 Genomic 14 Duplication X 10 2 20 1 19 12 13
    • Quantificazione di geni paraloghi Test gene gtgactattgtttatttttaaTgggtatttcaga ||||||||||||||||||||| |||||||||||| Gene paralogo gtgactattgtttatttttaaCgggtatttcaga TC TC T C RATIO 1:1 RATIO 3:2 RATIO 1:2 NORMALE TRISOMIA DELEZIONE di UN CROMOSOMA = e.g. cromosoma 21
    • Risultati preliminari Trisomy Chromosome allele: A Control Chromosome allele: T A/T ratio (%) 49.6/50.4 A/T ratio (%) 60.4/39.6 = TRISOMY Courtesy S. Deutsch
    • Grazie per l’attenzione e grazie per l’entusiasmo nell’avvio del Progetto a: Dario Roccatello, CMID Simona Cardaropoli, UMF Luca Sbaiz, SS Diagnosi e Consulenza Genetica, OIRM- S.Anna Guglielmo Bracco, Dipartimento di Diagnostica, OIRM- S.Anna Elsa Viora e collaboratori, Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale, OIRM-S.Anna Samuel Deutsch, Università di Losanna, Svizzera Laura Cremonesi, Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor