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XVI CONGRESSO NACIONAL DE
           CRIMINALÍSTICA

  IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE MONÓXIDO DE
CARBONO EM SANGUE, UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM
   FASE GASOSA COM DETECTOR DE CONDUTIVIDADE
                    TÉRMICA.
                                     Cristóvão Macedo Dantas
                                       Arnaldo Santos Gomes
                                         Jorge Luis dos Santos
                                e-mail cdantas@ptecnica.ba.gov.br



                           Florianópolis, SC - Outubro de 2001
SANGUE
Líquido vital responsável pelo transporte dos gases e
  nutrientes para as células dentre outras funções.
                                      Composição do Sangue
                                    Sangue volume médio ≅ 5L
                                    Porção Celular ≅ 45% do Volume
                                           Plasma ≅ 55% do Volume


                                                     Hemácias
                                    Porção Celular   Glóbulos Brancos
                                        45%          Plaquetas


                                               Água : em 1L = 945,0g
                                    Plasma     Componentes Orgânicos
Oxiemoglobina   Carboxiemoglobina    55%       Inorgânicos
                                               Lípidas
  Hemoglobina total média = 13g/dL ≅ 13%
Quando completamente saturada 1g de Hemoglobina (Hb)
contém cerca de 1,34mL de Oxigênio (O2). A
Carboxiemoglobina (HbCO) é formada pela combinação da
Hb com o Monóxido de Carbono (CO) que possui afinidade
210 vezes maior com o CO do que com o O2. Isso significa que
valores de 50% de HbCO é atingido quando concentrações de
CO no ar aspirado é apenas 1:200 a 1:250 daquela do O2, ou
seja, aproximadamente 1000ppm por hora. A dissociação da
HbCO é 10.000 vezes mais lenta que a da Oxiemoglobina
(HbO2), e com isso podemos dizer que é um composto
altamente estável. Concentrações de 2,5% de HbCO no
sangue por 4 a 5 horas pode ocasionar intoxicação crônica; de
9,6% a 16% ligeira cefaléia e vertigens; intoxicação subaguda
com intensa cefaléia com valores de 36%; séria intoxicação
podendo ocorrer morte lenta ou seqüelas neurológicas com
51,5%; e valores acima de 60% de HbCO ocorre morte
rápida.
1/210=4.47E-3 4.47E-3x20%=0,09524%=952,38ppm
Em Laboratório Químico existem
três tipos de Técnicas Analíticas:
Titulométricas, Espectrofotométricas e
          Cromatográficas
 *Análise de Monóxido de Carbono:
 Técnica utilizada - Espectrofotométrica
 Técnica Proposta - Cromatográfica
Condições Cromatográficas
                  Detector de Condutividade Térmica
                                (TCD)
                 Válvula de Injeção para Gás (6 vias)

                  Coluna de Peneira Molecular (2m)

                 Coluna de Referência (Tubo oco 2m)

                      Volume LOOP (0,2236mL)

                         Gás de arraste (H2)
Cromatógrafo   Fluxo (coluna de referência) 34,8mL/min

(SHIMADZU)       Fluxo (coluna analítica) 35,0mL/min

                    Corrente do filamento (75mA)
  CG-14A       Coluna–100oC ;Inj.–100oC ; TCD-100oC


               Método Padronização Externa
Gás Padrão (CO-10% e N
                     2   balanço)
Cromatograma do Gás Padrão
Devido às técnicas para análise de CO em sangue serem
complexas na sua realização e demandar bastante tempo,
surgiu a idéia de desenvolver uma metodologia utilizando
cromatografia de gás com detector de condutividade
térmica, haja vista a disponibilidade deste equipamento no
Laboratório de Polícia Técnica do Estado da Bahia.
Essa metodologia faz uso de ácido sulfúrico e aquecimento
como agentes dissociadores de CO da molécula de
Carboxiemoglobina; presença que é constatada através de
liberação do gás do reator para um kitassato com funil de
Buchner e papel de filtro embebido em Cloreto de Paládio.
A existência do monóxido de carbono é evidenciada pela
formação de Paládio metálico por redução com o CO
porventura presente.
Tal reação (dissociação de HbCO) ocorre em reator de
vidro de volume fixo e hermeticamente fechado, provido
de indicadores de pressão e temperatura. Com o auxílio
da Cromatografia Gasosa, obtém-se a fração molar do
monóxido de carbono (CO) liberado pelo sangue
analisado. Supondo-se comportamento de gás ideal e
utilizando as variáveis termodinâmicas (volume, pressão e
 temperatura), chega-se a quantidade em mols e volume
de CO fixado no sangue. Como 1,35mL de CO se fixa em
1g de Hemoglobina a qual previamente fora determinada
através de técnica colorimétrica, calcula-se assim
percentual de carboxihemoglobina presente na amostra
questionada. Valores acima de 50% são letais.
Nas análises forenses o sangue a ser examinado é
oriundo de cadáveres, portanto, com certo grau de
hemólise, o que promove a liberação dos gases fixados
na estrutura hemoglobínica. O valor de CO encontrado
no método em questão está relacionado àquele fixado na
estrutura ainda íntegra de Hb. Portanto, ao
determinarmos o teor da Hb total (não hemolisada) no
sangue do cadáver, poderemos estimar o teor de HbCO
possivelmente presente no sangue quando ainda “in
vivo”, realizando extrapolação levando em consideração
valores médios da Hb total em uma população normal.
 O resultado extrapolado encontrado poderá fornecer
subsídio suficiente para auferir e/ou descartar uma
intoxicação por CO.
A metodologia aqui apresentada possui vantagens como
rapidez e praticidade analítica.
REATOR COM
  SISTEMA DE
AQUECIMENTO
Reator de Vidro

                                 Bureta

 Termômetro


Indicador de
  pressão
                                       Válvula
                                     Micrométrica
REATOR
Cromatograma de caso Positivo
Cromatograma de caso Positivo
DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA
Volume do Reator (mL) =114,4
Temperatura de Reação ( oC )=101,3
Pressão Atmosférica (ATM)=1
Pressão Manométrica (ATM)=0,5
                                            VARIÁVEIS DO
Porcentagem CO (Cromatog.)=3,109
                                            EXPERIMENTO
Hemoglobina Total(%)=6,03
Volume de Sangue (mL)=13
Volume de H2SO4 (mL)=10

_________XXXXX_____XXXXXXX_________XXXXXXX________XXXXXXX________XXXX

                     (CALCULO DO PERCENTUAL DE HbCO)
Vol. Reator Corrigido (L)=0,0884
Pressão absoluta (ATM)=1,5         Temp. Do Reator ( oK )=374,3
Temp. Alveolar ( oK )=310          Pressão Alveolar (ATM )=1,12
Pco=Xco.Ptotal                     n = (Pco.Vol Reator Corrigido) / (0,082.Temp.
Corrig.)
Pco =0,046635                      no Moles de CO=0,000134
Vol. CO na CNTP(mL) =3,0087

Volume de CO fora da CNTP (mL) =3,0504               (%   COHb = 37,47)
Massa de Hb Fixada c/ CO=2,2696
Memória de Cálculo
                       Variáveis do Experimento
1-Volume do reator (mL) = 11,4         6- Volume de Sangue (mL) =
13,0
2-Temperatura do Reator (OC) = 101,3   7-Volume de H2SO4 (mL) = 10,0
3-Pressão Atmosférica (ATM) = 1
4-Pressão Manométrica (ATM) = 0,5
5-Percentagem de CO p/ Cromatografia (%) = 3.109
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Volume do Reator (L) = (111,4-13+10)/1000 =0,0884
Pressão do Reator (ATM) = 1+0,5=1,5
Temperatura do Reator (OK) = (101,3+273)=374,3
Temperatura Alveolar (OK) = (37+273) =310
Pressão Alveolar (ATM)= 1,12
Hemoglobina Total (%) = 6,03
(Continuação)
Pco=Xco.Ptotal = (3,109x1,5)/100 = 4,6635E-2

No de moles de CO = (4,6635x0,0884)/0,082x374,3) = 1,34E-4
Vol de CO na CNTP (mL)
1mol    -- 22,4L

1,34E-4 --   X     X=(22,4X1,34E-4)/1000 = 3,0087mL
Vol de CO fora da CNTP (mL) =(Vol. CO na CNTP x Temp. Alveolar) / (273xPressão Alveolar)

Vol de CO fora da CNTP (mL) = (3,0087 x 310) /(273x1,12) = 3,0504mL

Massa de Hb Fixado
1,35mL de CO --- fixa 1g de Hb
   3,0504mL      -- X = 3,0504/1,35= 2,2596g de Hb
 6,03 -- 100

2,2596 -- Xg = (2,2596x100) / 6,03 = 37,47%
Extrapolando P/ valores normais de Hb:

37,47 – 6,03
  X    -- 13,0    X= (37,47x13,0) / 6,03 = 80,78%

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Identificação de Carboxi-Hemoglobina em sangue humano, por Cromatografia Gasosa usando TCD

  • 1. XVI CONGRESSO NACIONAL DE CRIMINALÍSTICA IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE MONÓXIDO DE CARBONO EM SANGUE, UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA. Cristóvão Macedo Dantas Arnaldo Santos Gomes Jorge Luis dos Santos e-mail cdantas@ptecnica.ba.gov.br Florianópolis, SC - Outubro de 2001
  • 2. SANGUE Líquido vital responsável pelo transporte dos gases e nutrientes para as células dentre outras funções. Composição do Sangue Sangue volume médio ≅ 5L Porção Celular ≅ 45% do Volume Plasma ≅ 55% do Volume Hemácias Porção Celular Glóbulos Brancos 45% Plaquetas Água : em 1L = 945,0g Plasma Componentes Orgânicos Oxiemoglobina Carboxiemoglobina 55% Inorgânicos Lípidas Hemoglobina total média = 13g/dL ≅ 13%
  • 3. Quando completamente saturada 1g de Hemoglobina (Hb) contém cerca de 1,34mL de Oxigênio (O2). A Carboxiemoglobina (HbCO) é formada pela combinação da Hb com o Monóxido de Carbono (CO) que possui afinidade 210 vezes maior com o CO do que com o O2. Isso significa que valores de 50% de HbCO é atingido quando concentrações de CO no ar aspirado é apenas 1:200 a 1:250 daquela do O2, ou seja, aproximadamente 1000ppm por hora. A dissociação da HbCO é 10.000 vezes mais lenta que a da Oxiemoglobina (HbO2), e com isso podemos dizer que é um composto altamente estável. Concentrações de 2,5% de HbCO no sangue por 4 a 5 horas pode ocasionar intoxicação crônica; de 9,6% a 16% ligeira cefaléia e vertigens; intoxicação subaguda com intensa cefaléia com valores de 36%; séria intoxicação podendo ocorrer morte lenta ou seqüelas neurológicas com 51,5%; e valores acima de 60% de HbCO ocorre morte rápida.
  • 5. Em Laboratório Químico existem três tipos de Técnicas Analíticas: Titulométricas, Espectrofotométricas e Cromatográficas *Análise de Monóxido de Carbono: Técnica utilizada - Espectrofotométrica Técnica Proposta - Cromatográfica
  • 6. Condições Cromatográficas Detector de Condutividade Térmica (TCD) Válvula de Injeção para Gás (6 vias) Coluna de Peneira Molecular (2m) Coluna de Referência (Tubo oco 2m) Volume LOOP (0,2236mL) Gás de arraste (H2) Cromatógrafo Fluxo (coluna de referência) 34,8mL/min (SHIMADZU) Fluxo (coluna analítica) 35,0mL/min Corrente do filamento (75mA) CG-14A Coluna–100oC ;Inj.–100oC ; TCD-100oC Método Padronização Externa
  • 7. Gás Padrão (CO-10% e N 2 balanço)
  • 9. Devido às técnicas para análise de CO em sangue serem complexas na sua realização e demandar bastante tempo, surgiu a idéia de desenvolver uma metodologia utilizando cromatografia de gás com detector de condutividade térmica, haja vista a disponibilidade deste equipamento no Laboratório de Polícia Técnica do Estado da Bahia. Essa metodologia faz uso de ácido sulfúrico e aquecimento como agentes dissociadores de CO da molécula de Carboxiemoglobina; presença que é constatada através de liberação do gás do reator para um kitassato com funil de Buchner e papel de filtro embebido em Cloreto de Paládio. A existência do monóxido de carbono é evidenciada pela formação de Paládio metálico por redução com o CO porventura presente.
  • 10. Tal reação (dissociação de HbCO) ocorre em reator de vidro de volume fixo e hermeticamente fechado, provido de indicadores de pressão e temperatura. Com o auxílio da Cromatografia Gasosa, obtém-se a fração molar do monóxido de carbono (CO) liberado pelo sangue analisado. Supondo-se comportamento de gás ideal e utilizando as variáveis termodinâmicas (volume, pressão e temperatura), chega-se a quantidade em mols e volume de CO fixado no sangue. Como 1,35mL de CO se fixa em 1g de Hemoglobina a qual previamente fora determinada através de técnica colorimétrica, calcula-se assim percentual de carboxihemoglobina presente na amostra questionada. Valores acima de 50% são letais.
  • 11. Nas análises forenses o sangue a ser examinado é oriundo de cadáveres, portanto, com certo grau de hemólise, o que promove a liberação dos gases fixados na estrutura hemoglobínica. O valor de CO encontrado no método em questão está relacionado àquele fixado na estrutura ainda íntegra de Hb. Portanto, ao determinarmos o teor da Hb total (não hemolisada) no sangue do cadáver, poderemos estimar o teor de HbCO possivelmente presente no sangue quando ainda “in vivo”, realizando extrapolação levando em consideração valores médios da Hb total em uma população normal. O resultado extrapolado encontrado poderá fornecer subsídio suficiente para auferir e/ou descartar uma intoxicação por CO. A metodologia aqui apresentada possui vantagens como rapidez e praticidade analítica.
  • 12. REATOR COM SISTEMA DE AQUECIMENTO
  • 13. Reator de Vidro Bureta Termômetro Indicador de pressão Válvula Micrométrica
  • 17. DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA Volume do Reator (mL) =114,4 Temperatura de Reação ( oC )=101,3 Pressão Atmosférica (ATM)=1 Pressão Manométrica (ATM)=0,5 VARIÁVEIS DO Porcentagem CO (Cromatog.)=3,109 EXPERIMENTO Hemoglobina Total(%)=6,03 Volume de Sangue (mL)=13 Volume de H2SO4 (mL)=10 _________XXXXX_____XXXXXXX_________XXXXXXX________XXXXXXX________XXXX (CALCULO DO PERCENTUAL DE HbCO) Vol. Reator Corrigido (L)=0,0884 Pressão absoluta (ATM)=1,5 Temp. Do Reator ( oK )=374,3 Temp. Alveolar ( oK )=310 Pressão Alveolar (ATM )=1,12 Pco=Xco.Ptotal n = (Pco.Vol Reator Corrigido) / (0,082.Temp. Corrig.) Pco =0,046635 no Moles de CO=0,000134 Vol. CO na CNTP(mL) =3,0087 Volume de CO fora da CNTP (mL) =3,0504 (% COHb = 37,47) Massa de Hb Fixada c/ CO=2,2696
  • 18. Memória de Cálculo Variáveis do Experimento 1-Volume do reator (mL) = 11,4 6- Volume de Sangue (mL) = 13,0 2-Temperatura do Reator (OC) = 101,3 7-Volume de H2SO4 (mL) = 10,0 3-Pressão Atmosférica (ATM) = 1 4-Pressão Manométrica (ATM) = 0,5 5-Percentagem de CO p/ Cromatografia (%) = 3.109 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Volume do Reator (L) = (111,4-13+10)/1000 =0,0884 Pressão do Reator (ATM) = 1+0,5=1,5 Temperatura do Reator (OK) = (101,3+273)=374,3 Temperatura Alveolar (OK) = (37+273) =310 Pressão Alveolar (ATM)= 1,12 Hemoglobina Total (%) = 6,03
  • 19. (Continuação) Pco=Xco.Ptotal = (3,109x1,5)/100 = 4,6635E-2 No de moles de CO = (4,6635x0,0884)/0,082x374,3) = 1,34E-4 Vol de CO na CNTP (mL) 1mol -- 22,4L 1,34E-4 -- X X=(22,4X1,34E-4)/1000 = 3,0087mL Vol de CO fora da CNTP (mL) =(Vol. CO na CNTP x Temp. Alveolar) / (273xPressão Alveolar) Vol de CO fora da CNTP (mL) = (3,0087 x 310) /(273x1,12) = 3,0504mL Massa de Hb Fixado 1,35mL de CO --- fixa 1g de Hb 3,0504mL -- X = 3,0504/1,35= 2,2596g de Hb 6,03 -- 100 2,2596 -- Xg = (2,2596x100) / 6,03 = 37,47% Extrapolando P/ valores normais de Hb: 37,47 – 6,03 X -- 13,0 X= (37,47x13,0) / 6,03 = 80,78%