Identificação de Carboxi-Hemoglobina em sangue humano, por Cromatografia Gasosa usando TCD
1. XVI CONGRESSO NACIONAL DE
CRIMINALÍSTICA
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE MONÓXIDO DE
CARBONO EM SANGUE, UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM
FASE GASOSA COM DETECTOR DE CONDUTIVIDADE
TÉRMICA.
Cristóvão Macedo Dantas
Arnaldo Santos Gomes
Jorge Luis dos Santos
e-mail cdantas@ptecnica.ba.gov.br
Florianópolis, SC - Outubro de 2001
2. SANGUE
Líquido vital responsável pelo transporte dos gases e
nutrientes para as células dentre outras funções.
Composição do Sangue
Sangue volume médio ≅ 5L
Porção Celular ≅ 45% do Volume
Plasma ≅ 55% do Volume
Hemácias
Porção Celular Glóbulos Brancos
45% Plaquetas
Água : em 1L = 945,0g
Plasma Componentes Orgânicos
Oxiemoglobina Carboxiemoglobina 55% Inorgânicos
Lípidas
Hemoglobina total média = 13g/dL ≅ 13%
3. Quando completamente saturada 1g de Hemoglobina (Hb)
contém cerca de 1,34mL de Oxigênio (O2). A
Carboxiemoglobina (HbCO) é formada pela combinação da
Hb com o Monóxido de Carbono (CO) que possui afinidade
210 vezes maior com o CO do que com o O2. Isso significa que
valores de 50% de HbCO é atingido quando concentrações de
CO no ar aspirado é apenas 1:200 a 1:250 daquela do O2, ou
seja, aproximadamente 1000ppm por hora. A dissociação da
HbCO é 10.000 vezes mais lenta que a da Oxiemoglobina
(HbO2), e com isso podemos dizer que é um composto
altamente estável. Concentrações de 2,5% de HbCO no
sangue por 4 a 5 horas pode ocasionar intoxicação crônica; de
9,6% a 16% ligeira cefaléia e vertigens; intoxicação subaguda
com intensa cefaléia com valores de 36%; séria intoxicação
podendo ocorrer morte lenta ou seqüelas neurológicas com
51,5%; e valores acima de 60% de HbCO ocorre morte
rápida.
5. Em Laboratório Químico existem
três tipos de Técnicas Analíticas:
Titulométricas, Espectrofotométricas e
Cromatográficas
*Análise de Monóxido de Carbono:
Técnica utilizada - Espectrofotométrica
Técnica Proposta - Cromatográfica
6. Condições Cromatográficas
Detector de Condutividade Térmica
(TCD)
Válvula de Injeção para Gás (6 vias)
Coluna de Peneira Molecular (2m)
Coluna de Referência (Tubo oco 2m)
Volume LOOP (0,2236mL)
Gás de arraste (H2)
Cromatógrafo Fluxo (coluna de referência) 34,8mL/min
(SHIMADZU) Fluxo (coluna analítica) 35,0mL/min
Corrente do filamento (75mA)
CG-14A Coluna–100oC ;Inj.–100oC ; TCD-100oC
Método Padronização Externa
9. Devido às técnicas para análise de CO em sangue serem
complexas na sua realização e demandar bastante tempo,
surgiu a idéia de desenvolver uma metodologia utilizando
cromatografia de gás com detector de condutividade
térmica, haja vista a disponibilidade deste equipamento no
Laboratório de Polícia Técnica do Estado da Bahia.
Essa metodologia faz uso de ácido sulfúrico e aquecimento
como agentes dissociadores de CO da molécula de
Carboxiemoglobina; presença que é constatada através de
liberação do gás do reator para um kitassato com funil de
Buchner e papel de filtro embebido em Cloreto de Paládio.
A existência do monóxido de carbono é evidenciada pela
formação de Paládio metálico por redução com o CO
porventura presente.
10. Tal reação (dissociação de HbCO) ocorre em reator de
vidro de volume fixo e hermeticamente fechado, provido
de indicadores de pressão e temperatura. Com o auxílio
da Cromatografia Gasosa, obtém-se a fração molar do
monóxido de carbono (CO) liberado pelo sangue
analisado. Supondo-se comportamento de gás ideal e
utilizando as variáveis termodinâmicas (volume, pressão e
temperatura), chega-se a quantidade em mols e volume
de CO fixado no sangue. Como 1,35mL de CO se fixa em
1g de Hemoglobina a qual previamente fora determinada
através de técnica colorimétrica, calcula-se assim
percentual de carboxihemoglobina presente na amostra
questionada. Valores acima de 50% são letais.
11. Nas análises forenses o sangue a ser examinado é
oriundo de cadáveres, portanto, com certo grau de
hemólise, o que promove a liberação dos gases fixados
na estrutura hemoglobínica. O valor de CO encontrado
no método em questão está relacionado àquele fixado na
estrutura ainda íntegra de Hb. Portanto, ao
determinarmos o teor da Hb total (não hemolisada) no
sangue do cadáver, poderemos estimar o teor de HbCO
possivelmente presente no sangue quando ainda “in
vivo”, realizando extrapolação levando em consideração
valores médios da Hb total em uma população normal.
O resultado extrapolado encontrado poderá fornecer
subsídio suficiente para auferir e/ou descartar uma
intoxicação por CO.
A metodologia aqui apresentada possui vantagens como
rapidez e praticidade analítica.
17. DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA
Volume do Reator (mL) =114,4
Temperatura de Reação ( oC )=101,3
Pressão Atmosférica (ATM)=1
Pressão Manométrica (ATM)=0,5
VARIÁVEIS DO
Porcentagem CO (Cromatog.)=3,109
EXPERIMENTO
Hemoglobina Total(%)=6,03
Volume de Sangue (mL)=13
Volume de H2SO4 (mL)=10
_________XXXXX_____XXXXXXX_________XXXXXXX________XXXXXXX________XXXX
(CALCULO DO PERCENTUAL DE HbCO)
Vol. Reator Corrigido (L)=0,0884
Pressão absoluta (ATM)=1,5 Temp. Do Reator ( oK )=374,3
Temp. Alveolar ( oK )=310 Pressão Alveolar (ATM )=1,12
Pco=Xco.Ptotal n = (Pco.Vol Reator Corrigido) / (0,082.Temp.
Corrig.)
Pco =0,046635 no Moles de CO=0,000134
Vol. CO na CNTP(mL) =3,0087
Volume de CO fora da CNTP (mL) =3,0504 (% COHb = 37,47)
Massa de Hb Fixada c/ CO=2,2696
18. Memória de Cálculo
Variáveis do Experimento
1-Volume do reator (mL) = 11,4 6- Volume de Sangue (mL) =
13,0
2-Temperatura do Reator (OC) = 101,3 7-Volume de H2SO4 (mL) = 10,0
3-Pressão Atmosférica (ATM) = 1
4-Pressão Manométrica (ATM) = 0,5
5-Percentagem de CO p/ Cromatografia (%) = 3.109
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Volume do Reator (L) = (111,4-13+10)/1000 =0,0884
Pressão do Reator (ATM) = 1+0,5=1,5
Temperatura do Reator (OK) = (101,3+273)=374,3
Temperatura Alveolar (OK) = (37+273) =310
Pressão Alveolar (ATM)= 1,12
Hemoglobina Total (%) = 6,03
19. (Continuação)
Pco=Xco.Ptotal = (3,109x1,5)/100 = 4,6635E-2
No de moles de CO = (4,6635x0,0884)/0,082x374,3) = 1,34E-4
Vol de CO na CNTP (mL)
1mol -- 22,4L
1,34E-4 -- X X=(22,4X1,34E-4)/1000 = 3,0087mL
Vol de CO fora da CNTP (mL) =(Vol. CO na CNTP x Temp. Alveolar) / (273xPressão Alveolar)
Vol de CO fora da CNTP (mL) = (3,0087 x 310) /(273x1,12) = 3,0504mL
Massa de Hb Fixado
1,35mL de CO --- fixa 1g de Hb
3,0504mL -- X = 3,0504/1,35= 2,2596g de Hb
6,03 -- 100
2,2596 -- Xg = (2,2596x100) / 6,03 = 37,47%
Extrapolando P/ valores normais de Hb:
37,47 – 6,03
X -- 13,0 X= (37,47x13,0) / 6,03 = 80,78%