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Silvia Puc Salvador Microoganismos
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Silvia Puc Salvador Microoganismos

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  • 1. 1 MICRORGANISMOS EXTREMÓFILOS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO PARA USO INDUSTRIAL Sílvia Santos1, Eduardo de Aquino Ximenes1 1 Universidade Católica do Salvador – UCSal – Laboratório de Estudos em Meio Ambiente – LEMA - Av. Prof. Pinto de Aguiar 2589, Pituaçu – CEP 41740-090 – Salvador - BA – Brasil - E-mail: lemassilvia@yahoo.com.br Resumo Os microrganismos extremófilos são aqueles capazes de se adaptarem a condições físico-químicas extremas, modificando suas estruturas protéicas, processos metabólicos e outros. Tais características justificam a sua aplicação biotecnológica, pois permitem seu uso em processos operacionais realizados em uma variedade de condições, como extremos de pH, temperatura, pressão, altas concentrações de sais e metais pesados. O microrganismo utilizado neste trabalho foi um fungo (isolado J), isolado de uma fonte hidrotérmica de Jorro-Tucano, BA. Este fungo foi selecionado e cultivado em meio sólido, contendo glicose como única fonte de carbono (MYG). O isolado J cresceu em uma ampla faixa de temperatura (20ºC a 45ºC), tendo como temperatura ótima 40ºC. Ao nível de pH, o crescimento se deu em uma faixa de 4,0 a 12, tendo como pHs ótimos 4,0 e 8,0. Este fungo foi também testado quanto à capacidade de degradar diferentes substratos em meio sólido, como celulose, caseína, margarina, ácido palmítico e N-hexadecano, contendo tais substratos individualmente como a única fonte carbono. Em pH 8,0 e temperatura de 40ºC, somente o substrato N-hexadecano foi degradado. Após a modificação do meio de cultura usado, o fungo foi capaz de degradar os substratos celulose, caseína, margarina e ácido palmítico à temperatura de 40ºC e pHs 4 e 8, caracterizando o potencial para seu uso ou de seus produtos em processos biotecnológicos. Palavras-chaves: Microrganismo extremófilos; enzimas hidrolíticas; protease; celulase; lípase; INTRODUÇÃO A diversidade biológica ao nível das espécies inclui toda a gama de organismos na terra, desde as bactérias e protistas até reinos multicelulares de plantas, animais e fungos, sendo estes últimos, juntamente com as bactérias, considerados os decompositores mais importantes devido ao seu papel de degradar a matéria orgânica (PRIMACK e RODRIGUES, 2001). A microbiota de um determinado ambiente realiza muitas transformações bioquímicas essenciais para o funcionamento normal do ecossistema. Os resíduos regularmente depositados no solo são utilizados pela microbiota e transformados em novas substâncias. Os microrganismos constituem uma ligação entre os constituintes inanimados do solo e os seres vivos. Desse modo, as atividades fúngicas e bacteriológicas são amplamente responsáveis pela fertilidade do solo (PELCZAR et al., 1981). Por serem os fungos organismos que contribuem para uma grande variedade de aplicações a favor do progresso do homem (RUEGGER, 2001), percebe-se a necessidade de enriquecer tais aplicabilidades, buscando-se, por exemplo, através de pesquisas e estudos, descobrir microrganismos que superem as suas condições normais de vida, desenvolvendo-se em condições extremas e que tenham potencial biotecnológico para uso em várias indústrias (LUDLOW e CLARK, 1991), incluindo a de alimentos, bebidas, têxtil, polpa e papel, assim como na agricultura (BHAT, 2000), contribuindo para o avanço da sociedade moderna. Adicionalmente, a busca de microrganismos degradadores de compostos originados por atividade industrial, como derivados do petróleo, potenciais poluentes do meio ambiente, consiste em outra possibilidade de aplicação importante de tais microrganismos em benefício dos seres humanos.
  • 2. 2 Considerando-se que no Estado da Bahia existem áreas naturais, impactadas ou não, apresentando sinais de condições extremas para o desenvolvimento de microrganismos e sabendo-se do potencialidade destes para a produção de enzimas hidróliticas com potencial de uso em vários processos biotecnológicos, inclusive com possibilidade de aplicação dentro do próprio Estado, seja ao nível de indústria ou mesmo em processos de biorremediação, torna-se importante o isolamento e avaliação de microrganismos produtores de tais enzimas. Microrganismos Os microrganismos participam de todas as funções vitais observadas em formas de vida superiores, mais complexas (KONEMAN et al., 2001). Eles ainda possuem a capacidade enzimática de degradar uma grande variedade de compostos químicos que ocorrem na natureza, contribuindo para que haja equilíbrio para os ciclos biológicos e ecológicos. Taxonomicamente, os organismos agrupados no Reino Fungi são, em geral, espécies saprófitas, que se adaptam, para crescimento, a uma nova variedade de condições ambientais com exigências nutricionais mínimas (CASALI et al., 2001). Os produtos sintéticos são utilizados como fonte de carbono e energia pelos microrganismos, ocasionando a decomposição de compostos liberando seus constituintes inorgânicos, ou ainda, em compostos orgânicos (SILVA et al., 2000). Além de serem responsáveis por importantes transformações metabólicas, pela fixação biológica de nitrogênio atmosférico, pela degradação de resíduos vegetais e outros produtos, inclusive tóxicos. Os microrganismos são também mananciais de fármacos, corantes, enzimas e ácidos orgânicos, entre outros, e podem ser usados no controle biológico de doenças e pragas. A importância dos microrganismos para a ecologia e biotecnologia é inquestionável (MELO e AZEVEDO, 1998). Microrganismos Aeróbios Os microrganismos aeróbios desenvolvem reações metabólicas complexas, usando o oxigênio no processo de degradação dos nutrientes (LOPES, 1997). Eles produzem enzimas hidrolíticas individuais e, entre os fungos, o mais bem estudado é o Trichoderma reesei, um fungo mesofílico e filamentoso, assim como os seus derivados mutantes (XIMENES et al., 1994). As enzimas produzidas por estes, quando combinadas, atuam efetivamente para hidrolisar celulose, a principal fonte de carbono da Terra (LJUNGDAHL et al., 1999). Levando-se em consideração o potencial para uso biotecnológico das enzimas hidróliticas produzidas por microrganismos, vem crescendo a procura por cepas que produzam as mesmas. Entre os fungos produtores de tais enzimas mais estudados, tem as espécies de Trichoderma, Humicola, Aspergillus e Acrophialophora (XIMENES et al., 1994). Microrganismos Anaeróbios São organismos com poder metabólico simples, sensíveis ao oxigênio, diferindo, no caso dos fungos, aeróbios, por conterem hidrogenossoma, uma organela envolvida na geração de energia. Vários destes microrganismos, além de produzirem enzimas individuais, produzem também um complexo protéico de alta massa molecular, chamado celulossoma. Os fungos anaeróbios representam um novo grupo de organismos, tendo sido o primeiro isolado em 1975, do trato alimentar de um herbívoro (ORPIN, 1975). Estes fungos são excelentes produtores de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas com atividades comparáveis ou superiores àquelas produzidas por microrganismos aeróbios. Como exemplo, pode ser citado o fungo Orpinomyces sp cepa PC-2, que produz uma variedade de enzimas hidrolíticas. Estas enzimas incluem celulases, - glucanases, -glucosidases, xilanases, acetilxilana esterases e esterases fenólicas, todas importantes para a degradação completa da parede celular de planta (MOUNTFORT, 1987; XIMENES, 1999). É importante ressaltar aqui que o microrganismo anaeróbio que tem sido mais estudado é a bactéria Clostridium thermocellum (FELIX and LJUNGDAHL, 1993; DING et al., 1999).
  • 3. 3 Fungos Aeróbios Os fungos são conhecidos popularmente como bolores, mofos, leveduras e cogumelos. Diferenciam-se dos demais seres vivos por apresentarem formas diversas de estilos de vida, singularmente. Constituem grupos de organismos heterotróficos e quimiorganotróficos destituídos de clorofila, com paredes celulares definidas; são imóveis, não possuem caule, raízes ou folhas e não desenvolvem sistema vascular complexo. Armazenam glicogênio como principal fonte de energia e exibem nutrição por absorção (RUEGGER, 2001). Por não possuírem clorofila, requerem uma fonte externa de carbono, obtendo esta como saprófitas, mediante a decomposição de matéria orgânica morta, ou como parasitas de plantas e animais vivos. Eles são eucariontes, possuem uma parede celular composta principalmente por quitina (n-acetil-D-glicosamina), unidas por ligações glicosídicas, β-1-4, mananas (polímeros de manose) e algumas vezes celulose (KONEMAN et al., 2001). As formas isoladas de células de fungos são conhecidas como leveduras. Sua reprodução ocorre por meio de esporos de maneira sexual ou assexual, derivando ou não do micélio vegetativo ou da superfície de corpos especiais de frutificação aérea (KONEMAN et al., 2001). Os fungos, no geral, possuem sistema de recombinação que permite reunir características encontradas nos diferentes indivíduos, em um único individuo (AZEVEDO, 1998). A morfologia, a disposição e o modo de produção dos esporos servem como critério importante para as identificações dos gêneros e espécies (KONEMAN et al., 2001). Microrganismos extremófilos O termo “extremófilos” foi usado pela primeira vez por Mac Elroy, em 1974, para designar organismos que proliferem em ambientes extremos (SANTOS et al., 2003). A biotecnologia pode considerar em breve um número muito grande de microrganismos que crescem em condições extremas de temperatura, pressão, pH, altos níveis de radiação, elevada concentração de sal, entre outros como a ausência de oxigênio. Esses organismos e seus componentes são de extremo interesse à biotecnologia devido à possibilidade de uso destes em processos ocorrendo em condições mais variadas, quando comparado aos microrganismos não extremófilos (LUDLOW e CLARK, 1991). Além disto, o estudo destes pode oferecer informações valiosas no que diz respeito à origem da Vida na Terra e das suas estratégias adaptativas ao ambiente onde esta prosperou. A extremofilia não constitui uma característica filogenética, embora dados disponíveis segundo Woese e outros, 1990, permitem classificá-los na árvore filogenética ao Domínio Archaea. Como exemplo, temos os halófilos (arqueis da família Halobacteriaceae ou bactéria da família Haloanaerobiales) que acumulam em geral íons inorgânicos (K+, Na+, Cl-) em concentrações elevadas para contrabalançar a pressão osmótica externa e manter a integridade celular. No que diz respeito aos termófilos e hipertermófilos, a descoberta mais surpreendente foi a de organismos hipertermófilos por Karl O. Stetter, que obrigou a extensão para cerca de 115 °C do limite superior da gama de temperatura em que as células vivas proliferam eficientemente. Esta característica implica na estabilização de todos os componentes celulares de modo que a sua funcionalidade seja mantida em condições de temperatura que seriam danosas para a maioria das biomoléculas dos organismos mesófilos. O surpreendente é que as proteínas dos hipertermófilos são constituídas pelos mesmos 20 aminoácidos presentes em todas as outras, como nos termófilos, mesófilos e psicrófilos, e que não revelam diferenças aos diversos graus de termoestabilidade. Embora estas proteínas apresentem elevada estabilidade térmica, muitas enzimas intracelulares in vitro apresentam baixa estabilidade à temperatura ótima de crescimento dos organismos (GOMES et. al 2001). Foram observados, através de isolamento e caracterização, que vários compostos orgânicos de baixa massa molecular (monosilglicerato, fosfato de di-mio-inositol, fosfato de diglicerol), encontrados apenas em microrganismos termófilos ou hipertermófilos, acumulam-se intracelularmente em resposta à elevação da concentração salina e/ou de temperatura do meio de cultura em hipertermófilos, halófilos ou halotolerantes. É possível que tais compostos sejam usados como estratégia para manter a integridade das estruturas celulares.
  • 4. 4 Em relação ao metabolismo de carboidratos, o sistema de transporte para a maltose em Thermococcus litoralis é semelhante ao de Escherichia coli, porém, a afinidade para o substrato é notável, tendo sua ordem de grandeza três casas superiores no organismo hipertermófilo, sendo este o sistema de transporte conhecido com afinidade mais elevada (SANTOS et al., 2003). No início da década de 90, descobriu-se a existência de hipertermófilos aeróbios com temperatura ótima de crescimento de 100ºC, fato este que derruba a exclusividade de hipertermófilos extremos anaeróbios. Concorda-se que há diminuição da solubilidade de oxigênio em água com a elevação da temperatura, porém é importante que seja considerada também a questão do aumento do coeficiente de difusão com a temperatura. Organismos acidófilos e alcalófilos preferem ambientes com pH extremos até cerca de 1 e 11,5, e não proliferam em pH próximo a neutralidade. Suas proteínas e outros componentes intracelulares não necessitam de estratégias para adaptações (SANTOS et al., 2003). No entanto, em estudos realizados em 61 isolados, dos quais 13 foram de espécies importantes de fungos toxigênicos, sendo quatro espécies de Aspergillus e Fusarium, e cinco de Penicillium, estes cresceram em uma faixa de pH que foi de 2,0 a 11,0 e em temperatura de 25, 30 e 37°C (WHEELER et al., 1991), levantando questionamentos sobre a não proliferação próxima a neutralidade. Microrganismos resistentes a radiações têm a capacidade de adaptar-se a ambientes com doses elevadas de radiações gama e ultravioleta, principalmente as bactérias do gênero Deinococcus e Rubrobacter (FERREIRA et al., 1999). Estes organismos apresentam mecanismos reparadores de DNA extremamente eficientes, os quais lhes permitem viver em condições de secura extrema ou agressão oxidativa que induzem a fragmentação de DNA, letal para maioria dos microrganismos. Descobertas recentes confirmam que arqueões hipertermófilos possuem a capacidade incomum para reparar danos causados ao DNA por radiações ionizantes; portanto é possível que a reparação de DNA eficiente esteja relacionada com características de adaptações comuns de diversos tipos de agressão ambiental (SANTOS et al., 2003). O trabalho de Ito (1998) com microrganismos extremófilos possibilitou a utilização destes em indústria de detergentes. Estes detergentes contém uma ou mais enzimas, como protease, amilase, celulase e lipase, que também podem ser produzidas industrialmente em larga escala. Celulose É a mais abundante fonte de carboidratos de origem vegetal e sua estrutura é a de um polímero não ramificado de resíduos de D-glicose unidos por ligações do tipo β-1,4 (LEHNINGER, 2006; SMITH, 1993). A configuração beta permite a formação de cadeias retas e longas, e o átomo de oxigênio do anel estabelece uma ponte de hidrogênio com o grupamento 3-OH da outra celulose (STRYER, 1992). A degradação da celulose ocorre através da ação combinatória de três grupos de enzimas: exoglucanases (EC. 3.2.1.9.1, 1,4--D-glucana-celobiohidrolase), endocelulases (EC. 3.2.1.4, endocellulase) e -glucosidases (EC. 3.2.1.2.1), onde as endocelulases atacam ligações glicosídicas internas das cadeias de celulose, portanto produzindo extremidades na cadeia polimérica e oligossacarídeos solúveis. Celobiohidrolases clivam resíduos de celobiose das extremidades das cadeias de celulose. A -glucosidase catalisa a hidrólise de celobiose a qual é inibitória à ação das exo e endocelulases. Estudos têm demonstrado que a atividade relativa de cada enzima atuando de maneira isolada é menor em comparação com a ação destas em conjunto (sinergismo) (XIMENES et al., 1996). Enzimas As enzimas microbianas têm grande importância na ciclagem de nutrientes, realizando uma variedade de reações de fixação, oxidação, redução e hidrólise na conversão da matéria orgânica necessária para a manutenção de equilíbrio num ecossistema (RUEGGER, 2001). Depois dos antibióticos, as enzimas são os produtos microbianos mais explorados na indústria biotecnológica, sendo utilizada em indústrias alimentícias, de detergentes (biológicos), têxtil e
  • 5. 5 farmacêutica, biologia molecular, aplicações médicas e na química bio-orgânica (MANFIO e LEMOS, 2003). Como muitos processos industriais ocorrem em altas temperaturas, há necessidade de desenvolvimento de biocatalizadores termoestáveis (SANTOS et al., 2003), assim como também se levar em conta o substrato, pois enzimas com mesmo perfil de atuação sob determinado substrato podem apresentar funcionamento ótimo em pH, temperatura e concentração iônica diferentes, o que requer a seleção de enzimas adequadas às condições nas quais serão utilizadas (MANFIO e LEMOS, 2003). As vantagens de se utilizar enzimas ou células hipertermófilas em processos de alta temperatura podem compreender vários fatores, como a esterilização dos reatores, o aumento da solubilidade de reagentes e produtos, ou a diminuição de viscosidade do meio, acelerando a difusão das espécies dissolvidas e aumentando a velocidade de reação (SANTOS et al., 2003). Neste intuito o objetivo deste trabalho é isolar microrganismos extremófilos de regiões que apresentem condições físico-químicas extremas para crescimento, principalmente extremos de pH, visando o estudo de suas propriedades fisiológicas em condições ideais para cultivo e capacidade de crescimento em diferentes fontes de carbono com potencial Biotecnológico para uso industrial. MATERIAIS E MÉTODOS Coleta da amostra A amostra foi coletada em diferentes pontos de uma fonte hidrotérmica de Caldas do Jorro-Tucano- BA, a fim de se encontrar microrganismos extremófilos em termos de pH. Amostra 1 Com auxílio de uma seringa de 15 ml e agulha 13x7 mm colheu-se 3ml de água à temperatura de 48ºC, em um local onde a água é usada para banho, sendo a amostra colhida, em torneira de banho, introduzida em seguida em um recipiente apropriado para cultivo de anaeróbios. Amostra 2 Repetiu-se o procedimento anterior com uma nova seringa, coletando-se dessa vez água de um ponto mediano próximo ao maquinário, torneira do meio; neste ponto a água é coletada em garrafões, sendo utilizada para beber e encontrada na temperatura de 48ºC. Esta amostra também foi introduzida em um recipiente apropriado para anaeróbios. Amostra 3 Amostra retirada de uma cascata, situada do lado oposto aos tubos utilizados para banho onde se coletou a amostra 1. Esta amostra teve a presença de sedimentos originários da raspagem da parede onde a água desce em forma de cascata, à temperatura 48ºC, e foi armazenada em frasco coletor. Acredita-se ser microrganismo aeróbios. Amostra 4 Coletada no mesmo ponto da amostra 2, com raspagem interna do tubo o qual aparentemente não apresentou nenhum tipo de sedimentos. Amostra armazenada em frasco coletor por esperar microrganismo aeróbios. A conservação das amostras procedeu-se sob vedação e em refrigerador a 4°C, com exceção das amostras dos anaeróbios que foram mantidas à temperatura ambiente. Preparo do meio de cultura Meio sólido (Chaves, 1982) Placas de Petri contendo meio sólido (CHAVES, 1982), com diferentes fontes de carbono (celulose, caseína, margarina, ácido palmítico e N-hexadecano), a uma concentração final de 0,5%, foram preparadas e autoclavadas a 121ºC, por 20 min. Meio de Chaves com seus componentes (KH2PO4 7,00 g/L; K2HPO4 2,00 g/L; MgSO4.7H2O 0,10 g/L; (NH4)2SO4 1,00 g/L; Extrato de levedura 0,60 g/L; Agar 20,00 g/L). O pH foi ajustado para 6,5. Alíquotas de 40 l das amostras coletadas (3 e 4; tabela 1) foram plaqueadas e cultivadas à 50°C por 2 dias. As placas foram feitas em duplicatas. Preparo de meio MYG Placas de Petri contendo meio MYG (Extrato de malte 5,00 g/L; Extrato de levedura 2,50 g/L; Glicose 10,00 g/L; Agar 20,00 g/L) foram preparadas após serem autoclavadas a 121ºC por 20min e
  • 6. 6 o pH foi ajustado para 8,0. As amostras inoculadas neste meio foram incubadas à temperatura de 50°C. Este meio foi escolhido para a caracterização fisiológica do isolado J, após seu completo isolamento, em termos de verificação da temperatura e pH ideais para o cultivo deste. RESULTADOS Crescimento em diferentes meios de cultura Cerca de 48h após a inoculação das amostras 3 e 4 em meio sólido de Chaves (1982) , não foi observado nenhum crescimento de microrganismos, com exceção das placas contendo N- hexadecano como única fonte de carbono (fig. 1). Figura 1: Degradação do N-hexadecano pelo Isolado J em meio Chaves (1982) Quando as mesmas amostras foram inoculadas em meio MYG, pH 8,0, à temperatura de 50°C, 48h depois verificou-se o crescimento de microrganismos, com o aparente predomínio total de uma única espécie, posteriormente denominada de isolado J. Observou-se ainda que este microrganismo cresceu melhor a uma temperatura menor, em torno de 40°C. Procedeu-se então novos cultivos para assegurar o isolamento completo deste microrganismo, que através de análise visual de sua morfologia, verificou-se ser um fungo. O meio MYG passou a ser adotado como o meio de cultivo adequado para os experimentos posteriores envolvendo este isolado. Caracterização fisiológica : Temperatura e pH ideais para crescimento Uma caracterização inicial, à temperatura de 40°C, nos pHs 8,0, 9,0 e 10,0 foi feita. Houve crescimento nos 3 diferentes pH testados (Figuras 2, 3 e 4). Figura 2. Isolado J cultivado Figura 3. Isolado J cultivado Figura 4. Isolado J cultivado em em pH 8,0 em pH 9,0. pH 10,0 Considerando-se o diâmetro das colônias formadas, não houve uma diferença significativa em termos de crescimento nestes pH. A mensuração do diâmetro da colônia formado em pH 8,0; 9,0 e 10,0 respectivamente no período de 24 h (0,82; 0,75; 0,82 cm), 48 h (2,52; 2,22; 2,32 cm) e 72 h (4,35; 3,95; 3,82 cm). O experimento foi realizado com diferentes repetições. Posteriormente um estudo mais amplo foi realizado, onde trabalhou-se em uma faixa de pH maior no intuito de se verificar a capacidade deste fungo de crescer em diferentes valores de pH, assim como qual (ou
  • 7. 7 quais) seria(m) o(s) pH ideal (ais) para tal crescimento. Mensuração do diâmetro da colônia (cm) formado após 72 h de incubação a 40°C, sendo realizado com diferentes repetições, tendo uma média (4,75; 4,30; 4,60; 4,70; 4,15; 3,95; 3,75; 2,55 cm) para cada pH (4,0; 5,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0) respectivamente. Na faixa de pH de 4,0 a 11,0, observa-se que não há uma grande diferença em termos de crescimento, sendo este um pouco mais acentuado em pH 4,0 e 8,0. Em pH 12,0, já há um declínio considerável em termos de capacidade de crescimento. O isolado J foi cultivado em diferentes temperaturas (20, 30, 40, 45, 50 e 60°C), para a verificação da temperatura ideal de crescimento. Observou-se que a temperatura ideal é de 40°C, conforme havia sido considerado inicialmente; contudo, conforme média de diâmetro (1,45, 3,90 e 1,00 cm) obtidos em temperaturas (20, 30 e 45°C) respectivamente, o fungo é capaz de crescer relativamente bem em temperaturas um pouco acima de 40°C, assim como bem abaixo desta temperatura. Não houve sinal de crescimento a 50 e 60°C. Potencial para degradação de diferentes substratos : crescimento em diferentes fontes de carbono. Quando cultivado em meio de Chaves (1982), em pH 4,0 e 8,0, à temperatura de 40°C, o isolado J não foi capaz de degradar os diferentes substratos testados. Quando o experimento foi conduzido nas mesmas condições, porém usando-se meio sólido MYG modificado (a glicose foi substituída pelos substratos Ácido palmítico, Caseína, Margarina e Celulose), observou-se o crescimento deste microrganismo em todos os substratos, em pH 4,0 a média do diâmetro da colônia (4,90; 3,65; 3,40; 3,80 cm) e em pH 8,0 ( 5,65; 3,70; 5,00; 2,60 cm), ambos pH com médias respectivamente relacionados ao substrato. Tabela 1. Degradação dos substratos pelo Isolado J em diferentes pH. Substrato pH 4,0 pH 8,0 Ácido palmítico Caseína _____________ Margarina
  • 8. 8 Celulose Isolamento de microrganismos anaeróbios. Após a incubação das amostras 1 e 2 à temperatura ambiente e em condições de anaerobiose, observou-se o crescimento de microrganismos nas condições testadas. Experimentos posteriores serão realizados para o completo isolamento dos mesmos, assim como se efetuará a caracterização fisiológica destes. DISCUSSÃO Microrganismos têm sido mostrados serem importantes fontes de produtos usados na indústria, como as enzimas hidrolíticas (XIMENES, 1999). Em particular, estudos neste sentido têm sido realizados recentemente com microrganismos extremófilos, uma vez que sendo estes capazes de viverem em condições físico-químicas extremas, há uma grande possibilidade de que tal capacidade esteja associada à produção de enzimas adaptadas a tais condições. Isto abre uma maior variedade de possibilidade de aplicações destes microrganismos e de seus produtos (LUDLOW and CLARK, 1991; SCHIRALDI e DE ROSA, 2002). Em geral, os microrganismos que crescem em condições extremas são associados ao domínio Archaea, contudo existem relatos recentes na literatura de microrganismos produzindo, por exemplo, enzimas que atuam em pH extremos e que não fazem parte de tal domínio (ITO, 1997; 1998; WHEELEr et al., 1991), o que pelos resultados iniciais obtidos neste trabalho parece ser o caso também do isolado J. Esse se mostrou capaz de crescer em diferentes pH, variando de extremos ácidos a alcalinos o que não tem sido verificado com freqüência na literatura científica para fungos. Esta é uma característica importante quando se considera a possibilidade de seu uso, ou de seus produtos em indústrias, uma vez que aumenta o espectro de aplicações em diferentes processos. A temperatura ideal de cultivo para este microrganismo, 40°C, está na faixa encontrada para vários fungos que já vêm sendo apontados como candidatos em potencial como fonte para a produção de enzimas hidrolíticas (XIMENES et al., 1994). A capacidade do isolado J de crescer relativamente bem em temperaturas diferentes da encontrada como ideal, é uma característica adicional que indica o potencial do mesmo para uso industrial. Este isolado hidrolisou diferentes substratos nos pH testados, indicando que o mesmo é capaz de produzir enzimas hidrolíticas como proteases (degradação da caseína), celulases (degradação da celulose), lípases (degradação de ácido palmítico, margarina e provavelmente N-hexadecano). Isto indica que este isolado pode ser provavelmente aproveitado de forma eficiente em termos de uso industrial, assim como em processos de biorremediação. Seu Processo de Identificação está em andamento na Universidade Estadual de Londrina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Azevedo, João Lúcio. Genética de Microrganismos. Goiânia: Editora da UFG, 1998. 490p. 2. Bhat, M.K. 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnology advances. 355- 383.
  • 9. 9 3. Casali, A. K., Staats, C. C., Schrank, A. e Vainstein, M.H. Cryptococcus neoformans. Aspectos moleculares e epidemiológicos. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento-nº20. 34-37, maio/junho 2001. 4. Chaves, V. H. Características Fisiológicas de um fungo termófilos isolado de compostagem e propriedade de seu complexo. Tese de Mestrado. Universidade Federal de Viçosa. 1982. 5. Ding, S. Y., E. A. Bayer, D. Steiner, Y. Shoham and R. Lamed. A novel cellulosomal scaffoldin from Acetivibio cellulolyticus that contains a family 9 glycosyl hidrolase. J. Bacteriol, 1999. 6720- 6729. 6. Ferreira A. C., Nobre M. F., Moore E., Rainey F. A., Battista J. R., da Costa M. S. 1999. Caracterization and radiation resistance of new isolates of Rubobacter Xylanophilus. Extremophiles. 3:325-238. 7. Felix, C. R. and Ljungdahl, L. G. the cellulosome: The exocellular organelle in clostridium. Annu. Rev. Microbiol, 1993. 791-819. 8. Filho, E. X. F. Hemicellulases and biotechnology. Research signpost. Trivarium, India, 1998. 9. Filho, E.X.F. The xylan- degrading enzyme system. Brazilian J. Med> Biol> Res. 27, 1994. 1093- 1109. 10. Gomes, Claudio, Lemos, Rita e Teixeira Miguel. A vida em ambiente inóspitos. Instituto de Tecnologia Química e Biológica. Universidade Nova de Lisboa, 2001. Disponível em: <http//www.itqb.unl.pt/~extremofilos/page2.htm. Acesso: 20/04/2003. 11. Highley, Terry L. and Dashek, William V. Biotechnology in the study of Brown and White-Rot Decay. In. Florest Products Biotechnology. Great Britain. Editora Taulor & Francis Ltd, 1998. 15- 36p. 12. Ito, Susumu, Kobayashi, T., Ara, K., Ozaki, K., Kawai, S., Hatada, Y. Ae detergent enzymes from alkaliphiles: enzymatic Properties, genetics, and structures. Extremophiles, 1998. 185-190p. 13. Ito, Susumu. Alkaline cellulases from alkaliphilic Bacillus: Enzimatic properties, genetics, and application to detergents. Extremophiles, 1997. 61-66p. 14. Koneman, Elmer W.; Allen, Stephen D. e Janda et al. Diagnóstico Microbiológico. Rio de Janeiro: Editora Médica e Científica Ltda, 2001. 1465p. 15. Leninger, A. l. Principios de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 247-252p. 16. Ljungdahl, L. G., D. L. Blum, H. Z. Chen, Y. He, I. Kataeva, X. –L. Li, E. A. Ximenes. 1999. The cellulase/hemicellulose system of the anaerobic fungus Orpinomyces andaspect of futher cellulasereserach. In: Genetics, Biochemistry and Ecology of cellulose degradation, Ohmyia, K., K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Sarita, andT. Kimiura (eds), Mie Bioforum 98, Uni Plubishers Co., Ltda, Tokyo, Japan, pp 495-506. 17. Lopes, S. B. Carvalho. Bio. São Paulo: Editora Saraiva, 1997, V.1, 26-45p. 18. LUDLOW J. M.; Clark, D.S. Engineering considerations for the application of extremophiles in biotechnology. Critical Reviews in Biotechnology, 10 (4): 321-45, 1991. 19. Manfio, G. Paulo e Lemos, M. de Farias. Microrganismos e Aplicações Industriais: Biodiversidade: Perspectivas e oportunidades Tecnológicas. Disponível em <htpp://www.bdt.fat.org.br/ publicações/padct/bio/cap9/4/Gilson.html>: Acesso em 12.02.2003. 20. Melo, I. S. e Azevedo, J. L.. Ecologia Microbiana. Jaguariúna, SP: Embrapa – CNPMA, 1998. 488p. 21. Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Biochem. 31: 426-428. 22. Mountfort, Douglas O. The rumen anaerobic fungi. FEMS Microbiology Reviews, New Zealand, 1987. 401-408p.
  • 10. 10 23. ORPIN, C.G. Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen. Microbiol., v. 91, p. 249-262, 1975. 24. Pelczar, M.; Reid., Chan, E. C. S. Microbiologia. São Paulo: McGraw-Hill do Brasil, 25. 1981, V.1, 556p. 26. Primack, Richard b. e Rodrigues Efraim. Biologia da Conservação. Londrina: Editora Midiograf, 2001. 328p. 27. Ruergger, Marcelo José Silveira. Atividade enzimática e produção de ácido γ -Linolênico por fungos filamentosos isolados do solo, da estação ecológica de Juréia – Itatins, SP. São Paulo, 2001. Tese. Doutorado – Universidade Paulista – Instituto de Biociências do campus de Rio Claro. 28. Santos H., Lamosa, P. e Costa, M. S. da. Extremófilos: Microrganismos à prova de agressões ambientais extremas. Boletim de Biotecnologia. Disponível em <http://dequim.ist.utl.pt/bbio/69/pdf/extremofilos.pdf .Acesso em 14/04/2003. 29. SCHIRALDI C., DE ROSA, M. The production of biocatalysts and biomolecules from extremophiles. Trends in Biotechnology, 20 (12): 515-521, 2002. 30. SIGOILLOT, c. Lomascolo A., et al. Lignocellulolytic and hemicellulolytic system of Pycnoporus cinnabarinus: isolation and characterization of a cellobiose dehydrogenase and a new xylanase. Enzime and Microbial Technology, France, 7 agosto 2002. 876-883 pp. 31. Silva, Célia Maria M.S., Roque, M.R. de A. e Melo, Itamar Soares de. Microbiologia Ambiental: Manual de Laboratório. Jaguariúna, SP: Embrapa Meio Ambiente, 2000. 98p. 32. Smith, C. J. Carbohydrate Chemistry (The Cell Wall). In: Plant Biochemistry and Molecular Biology, P.J. Lea and R.C. Leggoad (Eds). New York, 1993. 103p. 33. Stryer, L. Bioquímica. Rio de Janeiro: Editora Guanabara koogan S.A., 1992. 282-283p. 34. Teixeira, M. L. & Soares, A. R. Avaliação da qualidade de celulose de diferentes procedências de Eucalyptus Grandis hill ex maiden. O Papel, 1992. 40-44. 35. Wheeler K. A., Hurdman B.F. and Pitt, J.I. Influence of pH on the growth of some toxigenic species of Aspergillus, Penicillium and Fusarium. Int. J. Food Microbiol. 12 (2-3): 141-149, 1991. 36. West, C.A., Elzanowski, A., L-S, Y. & Barker, W.C. (1989). Homologues o catalytic domains of Cellulomonas glucanases found in fungal and bacillus glycosidases. FEMS microbiology Letters. 59: 167-172. 37. Woese C. R., kandler O., Wheelis M. L. 1990. Towards a naturalsystem of organisms. Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci USA 87:4576-4579. 38. Ximenes, E. A. Cloning and sequencing of cDNAs encoling one β-glucosidase, three cellulases and one mannanase of the fungus Opinomyces sp. Strain PC-2, and over-expression of the β-glucosidase and Mannasa in Saccharomyces cerevisidae. Brasilia-DF 1999. 29-33p. Tese Doutorado: Universidade de Brasília. 39. Ximenes, E. A., Ulhoa, C. J., and Felix, C. R. 1994. Production of Cellulases by Aspergillus fumigatus. Fresenius and characterization of One β-Glucosidase. Current Microbiology 32: 119-123. 40. Ximenes, F. de A. Caracterização de uma xilanase produzida pelo fungo Acrophialophora naininana e sua possível aplicação na indústria de celulose e papel. Brasília, 2000. 45p. monografia. Universidade de Brasília. Faculdade de Tecnologia. 41. Ximenes, E. A., Felix, C. R., Ulhoa, C. J.Prodution of cellulases by Aspergillus fumigatus and characterization of One β – glucosidase Microbiology. New York, 1996.