El documento presenta un protocolo de doctorado que evalúa la respuesta inmune en ratones Balb/c al administrar conjugados proteicos constituidos por antígenos recombinantes del virus del dengue y partículas tipo virus. Los objetivos son obtener y evaluar proteínas recombinantes contenidas en el dominio III del antígeno E de los virus del dengue tipo 2 y 4 conjugadas químicamente a adyuvantes particulados, para determinar su capacidad para inducir inmunidad específica.

1. Centro de Investigación y Asistencia en
Tecnología y diseño
del Estado de Jalisco
“Obtención de péptidos recombinantes del antígeno E del virus del dengue
conjugables a PTVs y su evaluación inmunogénica en ratones Balb/c”
PROTOCOLO DE DOCTORADO
PRESENTA :M. en C. Paola G. Delgado Guzmán. Posgrado Interinstitucional en
Ciencia y Tecnología.
Director de tesis:
Dr. Abel Gutiérrez Ortega
Co-Director de tesis:
Dra. Ana Laura Márquez Aguirre.
Financiamiento: Fomix –Nayarit clave: -2008-CO2-
92049

2. objetivos
Metodología
Hipótesis
Antecedentes
Planteamiento del
problema
Introducción
Entregables

4. • Son numerosos los estudios que hablan sobre las características y capacidades
inmunogenicas del DIII del VD identificándose como una región prometedora
para el desarrollo de vacunas basadas en subunidades recombinantes debido a
que contiene epitopes para anticuerpos neutralizantes. A pesar de la cantidad de
información , En la actualidad no existe una vacuna disponible contra el VD. La
obtención de una vacuna está limitada por: La existencia de cuatro serotipos, el
fenómeno de la ADA, la ausencia de un modelo animal que reproduzca
adecuadamente la enfermedad, y el poco conocimiento que se tiene patogenia
de la misma.
• Los principales retos para el desarrollo de un prototipo vacunal son:
(1) Inducir inmunidad protectora de larga duración
(2) No sensibilizar al individuo frente a una infección secundaria por un virus
heterólogo
(Lidice ,2010 )

6. Antecedentes
Agente etiológico.
El virus del dengue es un
arbovirus ,perteneciente al
género Flavivirus (y familia
Flaviviridae.
(Kuhn,2009)

7. Proteína E
• Componente más abundante de la envoltura
del virión y en ella residen las propiedades
biológicas más importantes del virus.
(Mota ,2005).

8. Adyuvantes
 vacunas tradicionales basadas en organismos vivos
vacúnales atenuados.
- Proporcionan una entrega eficaz a CPA .
-Componentes que estimulan el sistema inmunitario innato.
 vacunas recientes se basan en componentes altamente
purificados de subunidad de patógenos, carecen de la
mayoría de las características originales.
Por que ?
 tales como componentes
- inmunoestimulantes,
- la capacidad de replicarse y producir niveles altos de
antígenos.
Por lo tanto, generalmente son poco inmunogénicas y la
necesidad de adyuvantes para mejorar una respuesta
inmunogenica
(Pashine, 2010)

9. Elementos clave para el desarrollo
de prototipos vacunales
• Antigenos
Sistemas de entrega
B
• Adyuvantes/ potenciadores inmunogenos
diferencia entre adyuvantes y potenciadores inmunogenos?
(Guillen and cols , 2010)

10. Tipo de adyuvante Descripción Ejemplo de
Vacuna
Experimental
Geles Fosfato/hidroxido de aluminio Difteria/ tétanos
Fosfato de calcio
Microbianos Dipeptido Muranil MDP
Exotoxinas y endotoxinas
bacterianas
Partículas Biodegradables Toxinas contra el cólera y
Microesferas de pólimeros E.coli
Liposomas
PTVs
Emulsiones y surfactantes Emulsiones microfluidicas
Saponinas
Sintéticos Derivados de MDP Vacunas sintéticas,
Copolimeros no iónicos, polifosfaceno administradas vía parental y
vía mucosa
Citoquinas Interleucinas IL2, IL12
Factor estimulador de colonias
granulocitos macrófagos
Genéticos Genes codificantes para moléculas
coestimuladoras de ADN
Genes de citoquinas añadidos a plásmidos
de ADN
(New generations vaccines, 2008)

11. Plataformas para presentación de
antígenos
COO-
Fusiones Traduccionales NH4 Manipulación del DNA
Acoplar químicamente
CONJUGACIÓN QUÍMICA
partículas - antígenos
Lys
Lys • Lisina
• Cisteína
Sistema de Lys
expresión Lys
PTV Antígeno

12. Presentación
antígenos Ag TI
conjugadas a Ptvs
Epitopes B
especificidad
adyuvante
activación
Antígeno
LB
B
CPA
procesamiento
Presentación
antígenos CPA
convencional
IL-1
LT IL-6
CPA IL-12
TNF-a
Ag TD
CPA Epitopes T
isotipo
memoria

14. La eficacia de una vacuna contra el virus del dengue
depende de la intensidad del estímulo permita obtener un
alto nivel de anticuerpos neutralizantes, consiguiendo
proteger durante largos períodos de tiempo a las personas
vacunadas y no represente un riesgo para la salud, ya sea
por la producción de viremia o por la inducción de
anticuerpos no neutralizantes que potencien infecciones
subsecuentes por virus heterólogos. En la actualidad se
dispone de diversos enfoques metodológicos para producir
vacunas contra VD. Sin embargo, la eficacia de una vacuna
depende en gran medida de la inmunobiología de la
infección vírica en cuestión y de la tecnología disponible
para el tipo de antígeno seleccionado. Por lo tanto, en este
trabajo se pretende evaluar la estimulación de la respuesta
inmune, en modelo animal, al administrar conjugados
proteicos constituidos por antígenos recombinantes del
virus del dengue y partículas tipo virus.

15. Los péptidos recombinantes del dominio III del antígeno E del
virus dengue producido en E.coli y conjugado químicamente a
partículas tipo virus, inducen inmunidad específica.

17. Objetivos
General
• Obtener y evaluar las proteínas
recombinantes que contienen el dominio III
del antígeno E del virus de dengue tipo 2 y 4
conjugadas químicamente a adyuvantes
particulados en ratones Balb/c

18. Objetivos particulares
1. Expresar y purificar péptidos del dominio III del gen E de
los virus dengue tipo 2 y 4.
2. Determinar el grado de disponibilidad de cisteínas
incorporadas a los péptidos recombinantes.
3. Conjugar los péptidos recombinantes a un adyuvante
proteico particulado.
4. Determinar el título de anticuerpos anti-IgG totales en
ratones inmunizados con los péptidos recombinantes y
los conjugados.
5. Determinar el título de anticuerpos anti-IgG del DIII en
ratones inmunizados con los péptidos recombinantes y
los conjugados.

20. CTA CAG CTC AAA GGA ATG TCA TAC TCT…
CTA CAG CTC AAA GGA
ATG TCA TAC TCT…
CYS
LYS

21. Construcción de
plásmidos Expresión de
*Diseño de iniciadores antígenos E ( subtipos
*Clonación de gen E a plásmido de 2-4)
expresión en E. coli basado en la
RNA polimerasa T7.
Análisis de expresión Purificación de péptidos
Movilización de plásmido de
( antígeno E 2 y4 Cys
expresión a Escherichia coli cepa amino terminal y
BL21 Star antígeno E 2 y4 Cys
Cinéticas de expresión (0, 3 y 5 h)
carboxi-terminal)
cromatografia de afinidad FPLC
Disponibilidad de
cisteínas (conjugación Conjugación química
química a Maleimide- a antígenos dengue.
PEG2-Biotin)

22. Ratones Balb/c
(hembras, de 5 -6
semanas de edad)
N=60
Inmunización I.m
Control no inmunizado 50 µg/ ml(Simmons,
2001)
N=12
Péptido recombinante
Péptido recombinante Péptido recombinante
Ptv´s DIII conjugado a Ptv´s
DIII DIII conjugado a Ptv´s
N=12 mas adyuvante de freud
N=12 N=12
N=12
Sangrados a 0 ,15,20
días para obtención de
sueros
ELISA Para deteccion de anti-dengue
IgG totales y anti-dengue DIII específicos IgG 1 y
IgG 2a

23. • Péptidos recombinantes provenientes del antígeno E
del virus del dengue susceptibles a conjugación
química.
• Producción de inmunidad especifica (títulos altos de
Ac) contra la partícula inmunogénica generada (PTV-
Ag) cuantificada en ratones.
• Dos publicaciones en revista de impacto científico y
un trabajo de tesis .

24. GRACIAS