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Kein Folientitel

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Kein Folientitel Presentation Transcript

  • 1. 1/1 MD0xxx.01 Miltenyi Biotec: 免疫磁珠分选技术及应用 德国美天旎生物技术有限公司 北方区技术支持 王卉
  • 2. MD0197.02 内容 • MACS 技术原理 • MACS 技术设备及分选策略 • 几种特殊的 MACS 分选 分选和分析 DC 细胞 分选各种 T 细胞 分选和分析细胞因子分泌细胞 分选造血干细胞 分选人类肿瘤细胞 分选和分析凋亡和死亡细胞 分选转染细胞 分子生物学和蛋白生化的分选
  • 3. MD0347.01 MACS 技术原理
    • MACS(Magnetic Activated Cell Sorting) :
    • = 免疫学 + 细胞生物学 + 磁力学
    • 基于抗体对抗原的特异性识别
    • 磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上,从而与细胞相连
    • 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的
  • 4. MD0651.01 MACS ® 磁性分选 MACS 微珠进行磁性标记 未标记的细胞 先行流出 洗脱阳性分选的细胞
  • 5. MD0197.02 分选前标本制备:过滤 MACS 预选滤器: 30  m
  • 6. MD0197.02 MACS 技术 设备与试剂 » MACS 微珠 » MACS 分选柱 » MACS 分选器 » 详细分选方案 *
  • 7. MACS 技术 设备与试剂
    • MACS 微珠:
    • MACS 微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒,可用于目的细胞的磁性标记。
    • 特性:
    • 50nm 大小
    • 对细胞没有毒性
    • 可生物降解
    • 不影响细胞特性
  • 8. MD0057.03 MACS 技术分选的 CD8 + T 细胞 微珠
  • 9. MACS 微珠 直标微珠 多选微珠 间标微珠
  • 10. MACS 技术 设备与试剂
    • MACS 分选柱: 》填充有不同规格的铁珠。
    • 》铁珠表面有亲水包被,不损伤细胞。
    • 》无菌包装。
    • 》 可用于分选多种细胞及亚细胞物质、
    • 细菌、病毒、 mRNA 和蛋白质。
    • 专利产品
    • 将磁场扩大 1000 - 10000 倍——高纯度,高回收率
  • 11. MD0061.02 在 MS 柱中产生的强大磁场
  • 12.
    • MACS 分选柱:
    MACS 技术 设备与试剂
  • 13.
    • MACS 分选器:从手动到自动,从实验室到临床
    MACS 技术 设备与试剂
  • 14.
    • MACS 分选器
    MACS 技术 设备与试剂
  • 15. autoMACS 分选仪
    • 9 种程序,一机完成所有细胞分选
    • 成本低,两个可重复使用的分选柱( 2 周内 100 次)
    • 快速( 3 - 10 分钟)
    • 重复性好
    • 全自动分选,仪器操作简单
    • 适用范围广: 从少量标本( 10 5 )到大量标本( 4X10 9 ),进样量 0.5ml-50ml
    • 8 种全血微珠,可以做常见细胞的全血分选,省去了费时的提取单个核细胞过程
  • 16. MACS 技术主要优势 • 小磁珠 : 50 nm (快速、不活化细胞、不沉淀) • 保留细胞功能(直接进行后续实验;无毒性;氧化 铁和多聚糖组成,可生物降解) • 与流式细胞仪兼容(不影响细胞光学特性、不影响荧 光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流 式分选时间) • 快速、简便、无菌 • 适用范围广(磁珠种类多、从少量到大量、适用于分 选各种细胞、亚细胞物质) MD0043.02
  • 17. MACS ® 细胞分选策略 • 阳性分选 • 去除分选 • 去除分选后再阳性分选 • 多重分选 MD0044.02
  • 18. MACS 细胞分选策略 1 、 阳性分选: • 根据特异性标志分选细胞 : 阳性分选是指目的细胞磁性标记 后,作为阳性的标记组分直接分选出来。   • 优点:     》高纯度,尤其是富集稀有的细胞 》高回收率 》操作简便、迅速 MD0044.02
  • 19. MD016102 阳性分选策略 MACS ® 微珠磁性标记 未标记细胞先行流出 将分选柱移出磁场,洗脱阳性分选细胞
  • 20. MACS 细胞分选策略 2 、 去除分选: • 去除分选是磁性标记非目的细胞,并将其从细胞混合物中去 除,即未磁性标记的细胞为目的细胞。   • 去除分选策略适用范围: 》 去除不需要的细胞 》 缺乏针对目的细胞的特异性抗体(如肿瘤细胞) 》不需要抗体和目的细胞结合 》 需进一步通过阳性选择分选细胞亚群 MD0044.02
  • 21. MD0160.02 去除分选 磁性标记 分选未磁性标记细胞
  • 22. MACS 细胞分选策略 3 、 去除分选后再阳性分选: • 即先去除非目的细胞,再进行阳性分选。   • 适用范围: 》 非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。 》 要分选非常稀有细胞,先去除非目的细胞再行阳性分选, 可获得高纯度的目的细胞。 MD0044.02
  • 23. 1. 去除非 CD4 + T 细胞。 用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标记非 CD4 + T 细胞 磁性分选去除标记细胞 先行流出为 CD4 + T 细胞 2. CD25 微珠直接磁性标记 CD25 + 细胞 阳性分选靶细胞 CD4 + CD25 + 调节性 T 滞留在分选柱上,离开磁场后洗脱下来 去除后再阳性分选 CD4 + CD25 + 双阳性细胞
  • 24. MD0652.01 多选微珠标记 MACS 分选 磁性颗粒的酶解离 终止解离反应 根据第二标志进行磁珠标记 MACS 分选 MACS 细胞分选策略 4 、 多选微珠:
  • 25. MACS 畅销机器与分选柱 • MiniMACS starting kit : 1 个分选架、 1 个 MiniMACS 分选器、 1 盒 MS 分选柱、 1 支价值 7500 元试剂 ( 15088 元):可做阳性分选、小量标本、间标去除分选、分子生物学分选 • Mini&MidiMACS starting kit : 1 个分选架、 1 个 MiniMACS 分选器、 1 个 MidiMACS 分选器、 1 盒 MS 分选柱、 1 盒 LS/LD 分选柱、 1 支价值 7500 元试剂 ( 27838 元):可做阳性分选和去除分选 • MS 分选柱: 1 盒 25 个, 2763 元 • LS 分选柱: 1 盒 25 个, 4356 元 • LD 分选柱: 1 盒 25 个, 5100 元 • uMACS 与 u 或者 M 分选柱 :分子生物学分选 • VarioMACS 分选仪 • autoMACS 自动分选仪 、 CliniMACS 分选仪 MD0044.02
  • 26. MACS 几种畅销磁珠与抗体 • 专利产品: CD133 、 CD303 、 CD304 • 特殊产品:人类 DC 系列: BDCA-1(CD1c) 、 BDCA-2(CD303) 、 BDCA-3(CD141) 、 BDCA-4(CD304) 小鼠 DC 系列: mPDCA 微珠与抗体 干细胞产品: CD133 、 CD271 微珠与抗体 细胞因子分泌细胞: CSA 分选与分析 TH2 细胞: CD294(CRTH) 微珠与抗体 分选人类肿瘤细胞:上皮肿瘤: CK 、 HEA 非血液肿瘤: CD45 去除 死亡细胞去除试剂盒 分选转染细胞 分选 HIV 病毒、 mRNA 、 cDNA • top ten : CD133 、 CD34 、人 CD4+CD25+ 、小鼠 CD4+CD25+ CD303/CD304 、人类 NK 、小鼠 CD11c 、 anti-PE 微珠 小鼠干细胞试剂盒(系别阴性+ CD117 )、 CD4/CD8 MD0044.02
  • 27. 主要竞争对手分析 Dynal :大磁珠 主要市场: CD4 、 CD8 等高频细胞, 优势:价格 劣势:回收率低(不能做低频细胞、弱表达细胞分选) 磁珠必需剪切(耗时——细胞状态不佳) 大磁珠(活化细胞) 我们的优势:纯度高、回收率高、细胞活性好 不活化细胞,不改变细胞功能 省时、省细胞 产品品种最多,有专利产品 有手动、自动、临床级产品 有强大的技术支持队伍 很好的声誉,市场占有率最高 MD0044.02
  • 28. 主要卖点 干细胞产品:人类: CD133 、 CD34 、 MSC 试剂盒( CD271 ) 小鼠:系别阴性试剂盒、 CD117 微珠 定向分化培养基 DC 产品: 人类: BDCA-1 、 BDCA-2/4 小鼠: CD11c NK 产品: 人类: NK 细胞阴选试剂盒、 CD3/CD56 T 细胞产品: CD4+CD25+ 调节性 T 细胞(人和小鼠) CSA 系列 CD4 、 CD8 微珠及阴选试剂盒 B 细胞产品: CD19 微珠及阴选试剂盒 肿瘤细胞分选:癌细胞富集试剂盒、 HEA 微珠、 CD45 阴选 单核细胞分选: CD14 微珠及阴选试剂盒 间标微珠 死细胞去除试剂盒 预选滤器、 FCR 阻断剂、 T 细胞活化与扩增试剂盒 流式细胞仪抗体(价廉、包装量大、优质) MD0044.02
  • 29. 识别 DC 和 DC 亚群 New Lineage - (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) HLA-DR + PDC CD11c - CD123 + BDCA-2 (CD303) + BDCA-4 (CD304) + CD123 low CD123 - CD11c + CD123 low/- MDC MDC1 MDC2 BDCA-1(CD1c) + BDCA-3(CD141) + + DC 亚群特异性标志 : B lood D endritic C ell A ntigens BDCA-2/4 + BDCA-1 + BDCA-3 +
  • 30. CD11c + DC CD8 + DC CD4 + DC CD11c + B220 + Gr-1 (Ly-6C/G) + DC CD11c + B220 - DC Conventional DC (“lymphoid“ DC) (“myeloid“ DC) CD11c CD8a CD11c CD4 PE FITC APC CD11c CD11c B220 Gr-1 Plasmacytoid DC (PDC) mPDCA-1 MACS ® 技术分选与分析小鼠 DC 细胞 New
  • 31. MACS ® 技术分选与分析大鼠 DC 细胞 New MD0044.02
    • Anti-DC(OX62) 微珠
    • 用于从大鼠外周血、淋巴和非淋巴组织中分选或者去除 OX62 + DC 。
    • 单克隆抗体 OX62 识别表达于大部分大鼠 DC 上的整合素 α E2 亚单位(分子量 150kDa )。
    • 两个主要的树突状细胞亚群: CD4/OX41 双阳性和 CD4/OX41 双阴性亚群。
    • 该抗原也表达于表皮 TCRα/β + 或 γ/δ + 的 T 细胞亚群和垂体前叶星状滤泡样( S100 + )细胞的一个亚群,但在朗格罕氏细胞和巨噬细胞上不表达。
  • 32. MACS ® 技术分选与分析功能性 T 细胞 MD0044.02
  • 33. MD0420.02 MACS ® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New 抗原特异性 再刺激 细胞因子 分泌阶段 捕获试剂 标记 荧光标记和 磁性分选 • • • • Catch Reagent Detection Antibody Anti-PE MicroBeads cytokine secreting cell secreted cytokine
  • 34. MD0420.02 MACS ® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New 分选前 刺激组 分选后 未刺激组 * 百分比均为占 CD4 + 细胞百分比
  • 35. MD0420.02 MACS ® 细胞因子分泌细胞分析 New 刺激组 未刺激组                                                                                                                                                                                                                                                                                                                使用 PE- CMVpp65/HLA/A2- tetramers 和 IFN-  Secretion Assay - Detection Kit (APC) or IL-2 Secretion Assay - Detection Kit (APC) 检测 HLA/A2 CMV + 患者 PBMC 。 * 百分比均为占 CD8 + 细胞百分比
  • 36.
    • 人类细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒
    • IFN-  分泌细胞
    • IL-2 分泌细胞
    • IL-4 分泌细胞
    • IL-10 分泌细胞
    • TNF-  分泌细胞
    MACS ® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New
    • 小鼠细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒
    • IFN-  分泌细胞
    • IL-2 分泌细胞
    • IL-4 分泌细胞
    • IL-5 分泌细胞
    • IL-10 分泌细胞
  • 37. 人类干细胞分选微珠与试剂盒 • CD34 微珠及多选微珠:用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞 • CD133 微珠 :用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞( MAPC ) • CD117 微珠:用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、骨髓间充质细胞 • CD45/GlyA 去除分选试剂盒:用于从骨髓中阴选分选 多能成体干细胞( MAPC ) • CD105 微珠:用于从骨髓中分选间充质细胞 • 抗成纤维细胞微珠:用于从骨髓中分选间充质细胞 多能成体干细胞( MAPC ) • MSC 分选工具( CD271 ) new :用于从骨髓中分选间充质细胞 MD0044.02
  • 38. MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR) new
    • 成分 :
    • 分选 :
    • CD271 (LNGFR)-APC
    • Anti-APC MicroBeads
    • FcR Blocking
    • 培养 :
    • NH Expansion Medium (2x500 mL)
    • CytoMix - CD271 (LNGFR)
    • 质量控制 :
    • NH AdipoDiff Medium (12x8 mL)
    • NH OsteoDiff Medium (12x5 mL)
    Introductory offer
  • 39. Ads in Blood (April & Mai) MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR) 人类 MSC 的标准化研究 CD271 又叫做低亲和力神经生长因子受体 (LNGFR), 是迄今为止发现的最佳 MSC 分选标志,可用于直接从人类骨髓中分选 MSC 。 分选后 CD271 (LNGFR)+ MSCs 是一群均一的 MSC 细胞群,而 CD271 阴性细胞成分中没有成纤维细胞克隆形成单位 (CFU-F) 活性。 与贴壁培养的 MSC 相比, CD271 分选的 MSC 增殖能力增强 10 - 1000 倍。 CD271 分选和扩增的 MSC 保留了多系分化潜能,具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞的可塑性。 cumulative population doubling (CPD)
  • 40. Ads in Blood (April & Mai) MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR) 人类 MSC 的标准化研究 Nadia Quirici 等, Experimental Hematology 30 (2002) 783–791
  • 41.
            • MACS 小鼠干细胞分选试剂盒:
            • Lineage Cell Depletion Kit: 去除成熟和分化的造血细胞,预富集造血干祖细胞。
            • CD117 MicroBeads :分选早期和晚期干祖细胞。
            • Anti-Sca-1 MicroBeads :分选造血干细胞和早期造血祖细胞。
            • CD117+Sca-1+lin– 细胞也有非造血分化潜能,如分化为肌细胞、内皮细胞、肝细胞、神经系统细胞。
            • CD45/Ter119 微珠去除分选骨髓细胞,可以得到 MAPCs, 也有体外分化为多种细胞的潜能。
    小鼠骨髓造血干细胞 (HSC) 定义为 Sca-1 + 、 CD117 + (c-kit) 、 Thy-1 low 和 lin - 细胞 .
  • 42. MACS ® 技术分选人类肿瘤细胞 New MD0044.02
      • 上皮肿瘤细胞 根据表面抗原进行分选与分析: Anti-HEA (EpCAM) MicroBeads
      • Anti-ErbB-2 (HER-2/neu) MicroBeads
      • 根据细胞内细胞角蛋白分选与分析: cytokeratin
      • 黑色素瘤细胞分选: Anti- melanoma MicroBeads
      • 其它非造血系统肿瘤细胞 : CD45 MicroBeads 去除白细胞
      • 骨髓瘤细胞: CD138 MicroBeads
      • 霍奇金氏淋巴瘤 /RS 细胞: CD30 MicroBeads
  • 43. MACS ® 技术分选凋亡细胞 New MD0044.02 刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死 PS 暴露 PS 暴露细胞被 AnnexinV 微珠磁性标记 磁性标记细胞滞留在分选柱上 PS 暴露细胞被洗脱下来
  • 44. MACS ® 技术分选转染细胞 New MD0044.02 应用于功能基因、信号转导研究、药物筛选和标记技术。 MACSelect4 转染细胞分选试剂盒使用 pMACS4.1 和自己的质粒 转染细胞 用 MACSelect4 微珠标记转染细胞 MACS 分选转染细胞 分选后细胞可用于培养或者分析
  • 45. MACS ® 技术分选转染细胞 New MD0044.02 优点: 省时:只需 2-3 小时 (建立一个稳定的细胞系需数周)   纯度高, 背景低   不影响转染细胞功能和活力   分选的细胞可直接用于培养或功能检测 可用于:原代细胞 & 细胞系 贴壁 & 悬浮细胞 稳定 & 短暂转染
  • 46. MACS ® 分子生物学和蛋白生化的分选 • 表位蛋白分选: µMACS 抗 His-, HA-, c-myc-, GFP- , GST- 蛋白分选 . • 生物素化分子及其靶位分选: µMACS 链霉亲和素微珠 • µMACS 免疫沉淀: µMACS 蛋白 A 、蛋白 G 微珠 • mRNA 分选: 从细胞、组织、外周血、 总 RNA 中分选 mRNA 一步法 cDNA 合成 new MD0044.02
  • 47. MACS ® 分子生物学和蛋白生化的分选 优点: • 分选柱上固定: 高纯度利于灵敏的后续实验 作用 温和,可获得理想的分子复合物 分选柱上分子修饰,可以减少细胞损失 • MACS 微珠: 敏感,可用于极少量的目的分子 快速:分选 mRNA 仅需 15 分钟 免疫沉淀只需 1-2 小时 一步法 cDNA 合成仅需 90 分钟 MD0044.02
  • 48. Miltenyi Biotec GmbH (headquarter)