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U. T 3 Microscopio Optico. Preparaciones
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U. T 3 Microscopio Optico. Preparaciones

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  • 1. U. T 3 Técnicas de microscopía. Microscopio óptico: descripción y manejo. Fundamento. Otros tipos de microscopios. Preparaciones microscópicas y observaciones diversas.
  • 2. 2 MICROSCOPIOS
    • 2.1 Tipos de microscopios
    • Hay dos grandes tipos, según su funcionamiento básico.
        • Ópticos
        • Electrónicos
  • 3.
    • 2.2 Microscopios ópticos
    • Podemos diferenciar
      • Microscopio de campo claro.
      • De campo oscuro.
      • De contraste de fases
      • De luz ultravioleta.
      • De fluorescencia.
  • 4. DESCRIPCIÓN Y USO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
  • 5.
    • 3.1 Cabezal y oculares
    • El ocular es un cilindro que contiene un sistema de lentes.
    • El ocular o los oculares (según su número) van montados sobre un cabezal, que suele ser giratorio.
  • 6.
    • Los hay de los tipos siguientes:
    • Cabezal monocular: un solo ocular.
    • Cabezal binocular: dos oculares para los dos ojos de un mismo observador. Es el tipo más frecuente.
    • Cabezal triocular: consta de un cabezal binocular similar al anterior y un tubo vertical para fotografía y vídeo.
    • Cabezal doble: está formado por dos parejas de oculares para permitir la observación simultánea del mismo campo por parte de dos observadores.
  • 7.
    • Uso del cabezal binocular:
    • El observador debe acercar sus ojos a los dos oculares, manteniendo ambos abiertos.
    • Se desaconseja el empleo de pintura de pestañas cuando vaya a utilizarse el microscopio, pues los oculares pueden mancharse.
    • Los ojos deben acercarse lo suficiente como para que el campo circular iluminado observado llene casi por completo el campo de visión del observador.
    • Si el observador utiliza gafas correctoras de miopía o hipermetropía, debe quitárselas.
    • El observador debe ajustar la separación de los dos oculares a su distancia interpupilar. Ello se consigue cuando los dos campos claros inicialmente observados se funden en uno solo.
  • 8.
    • Uno o los dos oculares están provistos de un anillo de corrección o compensación de dioptrías. Se debe usar después de haber conseguido el enfoque.
    • Los oculares más frecuentemente usados son de 10 aumentos. A veces se encuentran otros de 16 u otro número de aumentos.
  • 9.
    • 3.2 Platina, aros de enfoque y tornillos de movimiento.
    • Debajo del revólver de objetivos existe una platina que permite:
    • a) Fijar la preparación en una posición horizontal.
    • b) Desplazarla con precisión durante su observación.
    • c) Realizar el enfoque usando distintos objetivos y grosores de portaobjetos y extensión.
  • 10.
    • La fijación de un portaobjetos a la platina se realiza abriendo la pinza con ayuda de su tirador, poniendo en contacto una esquina del portaobjetos con el marco fijo situado sobre la platina y cerrando con suavidad la pinza de modo que el portaobjetos quede fijado.
    • La extensión de la muestra a observar siempre estará en la cara superior del portaobjetos
  • 11.
    • Para centrar la preparación, podemos guiarnos por el círculo iluminado que se forma en el portaobjetos.
    • Esto lo logramos usando los tornillos de movimiento de la preparación, que suelen situarse en posición vertical debajo de la platina y a su derecha.
    • Uno de los tornillos permite mover la preparación de izquierda a derecha y el otro de delante hacia atrás. Suele haber dos escalas milimetradas fijadas a partes fijas y móviles de la platina que permiten conocer las coordenadas de la posición de una determinada zona de interés de la preparación.
  • 12.
    • La platina se sube y se baja (y con ella la preparación) utilizando los aros o anillos de enfoque.
    • Son dos, dispuestos de modo concéntrico. Su situación en el microscopio es en la parte más alejada del observador, cerca de la base, junto a la platina.
    • Cada aro es doble: hay uno en la parte derecha y otro en la parte izquierda del cuerpo del microscopio. Cada aro es solidario a su correspondiente del lado opuesto, de modo que gira con él.
    • Esto se ha hecho así para permitir el enfoque con ambas manos.
  • 13.
    • El aro de mayor diámetro se conoce como aro de enfoque grueso o grosero, y un pequeño ángulo de giro desplaza la platina mucho más que un giro igual del aro de menor diámetro.
    • Este último se conoce como aro de enfoque fino y el mismo ángulo de giro produce un desplazamiento vertical de la platina mucho menor. El procedimiento de enfoque se verá más adelante
  • 14.
    • 3.3 Revolver y objetivos
    • El revólver es una base donde van fijados los diferentes objetivos a utilizar.
    • Es giratorio, lo que permite cambiar de objetivo en uso.
    • Para ello nunca debe empujarse a los objetivos, sino que el giro del revólver se logrará accionándolo en su rueda dentada.
    • La posición correcta de cada objetivo se hará notar por un pequeño "clic" que normalmente no se oye sino que se siente al tacto.
  • 15.
    • Cada uno de los pequeños cilindros unidos al revólver es un objetivo.
    • Cada objetivo contiene un sistema de lentes. Hay varios objetivos, cada uno de ellos con distinto poder de aumento.
    • Los más frecuentes son: 4 o 5, 10, 40 y 100 aumentos.
    • El aumento total del microscopio se calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento del objetivo. De este modo, con un ocular de 10 aumentos podemos conseguir: 40 o 50, 100, 400 y 1.000 aumentos, respectivamente.
  • 16.
    • Objetivo de 4 o 5 aumentos: se emplea para observar objetos grandes (parásitos, etc.) o para localizar una zona de la preparación
    • Objetivo de 10 aumentos: usos similares al anterior y observación de micelio de hongos.
    • Objetivo de 40 aumentos: observación de células eucariotas. En general, observación de objetos de 5 a 20 μ m de diámetro.
    • Objetivo de 100 aumentos: observación de bacterias. En general se usa para la observación de objetos de 0'2 μ m a unas pocas μ m. Este objetivo es de inmersión en aceite ( "OIL" o "ACEITE“)
  • 17.
    • El objetivo de 100 requiere operar con un cuidado exquisito, pues su distancia de trabajo (distancia entre la lente y el objeto para que éste se vea nítido en el campo de trabajo) es de sólo una fracción de milímetro.
    • Para trabajar con él se deposita una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y después el extremo libre del objetivo se pone en contacto con el aceite de inmersión.
  • 18.
    • 3.4 Procedimiento de enfoque
    • Enfocar la preparación consiste en situarla a la distancia del objetivo que permite su observación nítida.
    • Esta distancia se conoce como distancia de trabajo.
    • Es tanto menor cuanto mayor es el poder amplificador del objetivo, de modo que llega a ser de menos de 1 mm para los objetivos de 40 y de 100 aumentos.
    • Esto hace que sea preciso actuar de modo cuidadoso y sistemático para evitar contactos de la lente del extremo del objetivo con la preparación, pues esto podría dañar el objetivo.
  • 19.
    • En primer lugar la platina debe bajarse hasta una distancia prudencial. Esto se logra accionando el aro de enfoque grueso.
    • A continuación debe colocarse el portaobjetos en la platina como se describió antes. Después se centrará la preparación.
    • Entonces, observando la preparación a simple vista, se acercará la preparación al objetivo girando el aro de enfoque grueso en sentido contrario al anterior. Se acercará todo lo que el instrumento permita, pero sin dejar que la preparación contacte con el objetivo.
  • 20.
    • Debe recordarse el sentido de giro usado para elevar la platina.
    • Entonces, observando a través de los oculares, se girará lentamente el tornillo de enfoque grueso en sentido contrario al anterior, de modo que la platina baje.
    • Esto continuará haciéndose hasta que se visualice la preparación más o menos enfocada. El enfoque se hará más preciso con ayuda del aro de enfoque fino.
    • Entonces, si es necesario, se accionarán los anillos de compensación de dioptrías de los oculares hasta optimizar la visión.
  • 21.
    • Para cambiar de objetivo, en primer lugar se hará bajar la platina hasta una distancia prudencial.
    • A continuación, se hará girar el revólver hasta situar en la posición de uso el objetivo deseado y se repetirá el procedimiento anterior.
    • En caso de querer usar el objetivo de inmersión en aceite, se depositará una gota de aceite en la zona que más interese de la preparación.
  • 22.
    • 3.5 Uso del diafragma y el condensador
    • Debajo de la platina y por encima de la fuente de luz se encuentran el diafragma y el condensador.
    • El condensador es una lente que concentra el haz de luz haciéndolo converger en la zona centrada del portaobjetos. De este modo aumenta la intensidad de la iluminación . Esto es necesario cuando se trabaja a gran aumento.
  • 23.
    • El diafragma es una membrana de apertura variable similar a los conocidos diafragmas de las cámaras fotográficas.
    • Se utiliza principalmente para observaciones en fresco (sin colorantes): como la mayoría de los microorganismos tienen índices de refracción similares a los del medio acuoso en el que están suspendidos, resultan difícilmente visibles a menos que ellos o la técnica sufran alguna modificación.
    • La disminución de la apertura del diafragma puede permitir la visualización de parte de protozoos, hongos y otras entidades microscópicas. Esto se debe a que la luz incidirá sobre los bordes del objeto formando un ángulo más agudo, aumentando así el contraste .
  • 24. ¿Por qué es importante el contraste?.
    • Parte de la luz que llega a un objeto es absorbida por el mismo y parte es transmitida, es decir, atraviesa el objeto. La imagen que se ve en un microscopio es creada por la luz transmitida.
    • Por tanto, si un objeto y el medio inmediato que lo rodea transmiten la misma cantidad de luz, la imagen del objeto se mezcla con el fondo..
    • Además, si todas las partes de un mismo objeto transmiten también la misma cantidad de luz, la imagen es uniforme y carece de detalles.
  • 25.
    • A esto se refiere el término contraste, a las diferencias en la intensidad de la luz entre el objeto y el medio o entre el interior mismo del objeto.
    • Las variaciones en la intensidad de la luz permiten apreciar que una zona de la imagen es diferente de otra zona próxima o del fondo del campo.
    • Por tanto, el contraste es necesario para distinguir un objeto de su fondo y también para poder percibir los detalles dentro del mismo.
  • 26.
    • La mayoría de los microorganismos carecen de color y, por tanto, transmiten todas las longitudes de onda de la luz visible casi de igual manera.
    • Una célula en un medio acuoso es como una bolsa de plástico transparente llena de agua en medio de una piscina, prácticamente invisible por falta de contraste.
    • Por ello, el contraste supone el principal problema a la hora de observar microorganismos y para obtener una imagen útil de la mayoría de ellos hay que aumentar el contraste de forma artificial.
  • 27.
    • En observaciones en fresco lo hacemos con el diafragma.
    • Una forma es teñir los especímenes. En el caso de los microorganismos se utilizan compuestos químicos, denominados colorantes, que tiñen las células o parte de ellas.
    • También se puede aumentar el contraste utilizando microscopios especiales.
  • 28.
    • 3.6 LIMITACIONES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO.
    • ¿Porqué sólo se trabaja con un máximo de 1.000 aumentos en los microscopios ópticos?
    • La limitación básica no es una cuestión de aumentos, sino de poder de resolución, que es la capacidad de distinción entre dos puntos adyacentes como distintos y separados.
    • Por cuestiones relacionadas con la longitud de onda de la luz visible en las que no vamos a entrar, la luz visible no permite distinguir nítidamente objetos menores de 0'2 μ m de diámetro.
    • Con algunas modificaciones pueden construirse microscopios ópticos de 2.000 o 3.000 aumentos.
    • Sin embargo, los microscopios ópticos de más de 2.000 o 3.000 aumentos proporcionarán imágenes más grandes pero más borrosas y esto no tiene ninguna utilidad.
  • 29.
    • Resolución
    • Se refiere a que dos puntos adyacentes de una imagen puedan percibirse separados uno del otro o, por el contrario, se perciban como uno solo.
    • Naturalmente, cuanta más resolución tenga una imagen más detalles se podrán observar y, por el contrario, una imagen con poca resolución se verá borrosa y un mayor aumento sólo hará que sea más grande, pero igual de borrosa.
    • La resolución es una propiedad que depende del sistema de lentes del microscopio, al contrario que el contraste, que es una propiedad del objeto que se está estudiando.
    • Se define como poder de resolución de un microscopio a “la menor distancia entre dos puntos adyacentes que pueden ser percibidos por separado uno del otro”.
  • 30.
    • Lo que interesa es que este poder de resolución nos dé una cifra lo más pequeña posible ya que cuanto más cercanos estén los puntos que pueden ser distinguidos entre sí, más detalles podrán ser observados y, por tanto, serán visibles objetos más pequeños.
    • El poder de resolución depende de tres factores.
  • 31.
    • 1. La longitud de onda de la luz empleada en la iluminación del espécimen.
    • Cuanto menor sea, mayor poder de resolución se consigue.
    • Por tanto, la luz azul proporciona mayor poder de resolución que la luz roja.
  • 32.
    • 2. El tamaño de la primera lente de aumento, llamada lente objetivo.
    • Las lentes de mayor tamaño tienen mayor poder de resolución debido a que las lentes grandes permiten que las atraviese un cono de luz mayor.
    • Se puede incrementar, por tanto, el poder de resolución aumentando el tamaño de la lente objetivo, pero, en la práctica, el tamaño de esta lente en un microscopio siempre está limitado.
  • 33.
    • 3. El índice de refracción del material que se encuentre entre la lente objetivo y el espécimen.
    • Un material con alto índice de refracción disminuye la velocidad de la luz, lo cual incrementa la resolución.
    • También influye el hecho de que la luz atraviese dos medios de distinto índice de refracción porque en la frontera de ambos medios la luz se refracta, se desvía, perdiéndose una parte que no entrará en la lente objetivo.
  • 34.
    • El material que hay normalmente entre el objetivo y la preparación es el aire que posee un índice de refracción de aproximadamente 1,0, menor que el del vidrio del que está hecha la lente.
  • 35.
    • Para aumentar el poder de resolución aumentando el índice de refracción del medio y, al mismo tiempo, evitando que la luz atraviese dos medios de distinto índice, los microscopios incorporan unas lentes objetivo llamadas “de inmersión” que se utilizan sumergidas en un aceite, es decir, poniendo un aceite especial entre la preparación y el objetivo.
  • 36.
    • Este aceite de inmersión posee un índice de refracción de 1,5 semejante al de la lente objetivo por lo que se aumentara considerablemente la resolución y no se pierde luz por reflexión fuera de la superficie de la lente objetivo. Podemos verlo en http://www.olympusmicro.com/primer/java/microscopy/immersion/index.html
  • 37. 4 OTROS TIPOS DE MICROSCÓPIOS
    • DE CAMPO OSCURO
    • En este tipo de microscopio tratamos de aumentar el contraste.
    • Con el microscopio de campo oscuro se observa un campo de fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente iluminados.
  • 38.
    • Esto se logra al equipar el microscopio con un condensador especial que dirige la luz desde la fuente luminosa siguiendo una trayectoria de manera que los rayos de luz no entren en el objetivo.
  • 39.
    • Así, si la muestra es del todo transparente y homogénea (agua pura, orina centrifugada, etc.), la luz dirigida a través del condensador no entra por el objetivo y todo el campo aparece oscuro.
    • Si, por el contrario, el medio transparente contiene objetos de diferente índice de refracción, habrá una dispersión de la luz por reflexión y refracción.
    • .
  • 40.
    • Esta luz entra por el objetivo y brillará sobre el campo microscópico oscuro
  • 41.  
  • 42.  
  • 43.
    • La microscopía de campo oscuro se emplea especialmente en el examen de microorganismos sin teñir suspendidos en líquidos (preparaciones "húmedas" y en gota pendiente).
  • 44. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE.
    • El objetivo también es aumentar el contraste
    • Se basa en el hecho de que las ondas de luz sufren un desfase, son retardadas, al atravesar una muestra con índice de refracción distinto al del medio que la rodea
  • 45.
    • Este desfase aumentaría el contraste de la muestra si se pudiera observar, pero no es lo suficientemente grande como para que lo perciba el ojo humano con un microscopio normal.
    • El microscopio de contraste de fases incorpora unos objetivos y un condensador especiales que amplifican el desfase de las ondas y las convierte en diferentes intensidades de luz que ya son visibles a través de los oculares.
  • 46.
    • De esta manera, proporciona una imagen clara y detallada de células vivas sin teñir sobre un campo más oscuro que en el microscopio normal.
    • La mayor ventaja que ofrece este tipo de microscopio consiste en poder estudiar el movimiento y las estructuras celulares internas, que mediante esta técnica no son distorsionadas por la fijación y la tinción.
  • 47.  
  • 48. MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA
    • El microscopio de luz UV permite un mayor poder de resolución (y por tanto mayores amplificaciones) que el microscopio de luz visible.
    • Esto se debe a que la luz UV (180 a 360 nm) tiene una longitud de onda más corta que la luz visible (360 a 700 nm).
    • Su poder de resolución es aproximadamente el doble que el de la luz visible.
  • 49.
    • Sin embargo, la principal ventaja que ofrece es el de poder observar la localización en el interior de sustancias que absorben luz UV. Esto se logra incluso con células vivas.
    • Como las radiaciones UV no son visibles, se visualizan mediante una emulsión fotográfica (la velan) o mediante una pantalla de televisión tras ser captadas por un fototubo.
  • 50. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.
    • Algunas sustancias químicas absorben la radiación electromagnética y ree­miten parte de esta energía en forma de radiación visible.
    • A estas sustancias se les denomina fluorescentes y al fenómeno, fluorescencia.
    • Un material que aparece con un color cuando se ilumina con luz visible puede, si se ilumina con radiación UV, observarse de un color totalmente diferente.
  • 51.
    • Hay colorantes fluorescentes que son absorbidos por determinados microorganismos y no por otros.
    • De este modo, la utilización de preparaciones teñidas con colorantes fluorescentes y observadas con luz UV es muy útil para detectar bacterias en medios en los que se encuentran en baja concentración, etc.
    • Tienen especial interés los reactivos inmunológicos que se preparan uniendo un anticuerpo a un colorante fluorescente.
  • 52.
    • Estos reactivos se conocen como conjugados colorante fluorescente‑anticuerpo.
    • Permiten la identificación altamente específica de determinados microorganismos.
    • Esta técnica se conoce como inmuno­fluorescencia.
  • 53.  
  • 54. 5. LUPA BINOCULAR
    • Se utiliza para estudiar microorganismos para los que no se nece­sita un gran aumento: determinados hongos miceliformes y ciertos parásitos, principalmente.
    • La lupa binocular suele trabajar entre 5 y unos 100 aumen­tos. Presenta la ventaja de poder utilizar preparaciones frescas secas: la muestra se sitúa sobre un portaobjetos y se observa sin más.
    • Otra de sus ventajas es la de ofrecer una visión tridimen­sional de la muestra estudiada, en contraste con la visión plana (bidimensional) del microscopio
  • 55. 6 PREPARACIONES MICROSCOPICAS. TIPOS.
    • Para realizar observaciones de los microorganismos presentes en una muestra es necesario manipular previamente dicha muestra.
    • Esta manipulación permite obtener una preparación microscópica, que es el material que finalmente se colocará en la pletina del microscopio.
    • Esta preparación constará obligatoriamente de un portaobjetos (ya sea convencional o de uso específico), una porción de la muestra (que en muchos casos habrá sido modificada) y podrá o no incluir un cubreobjetos y otros materiales.
    • Las preparaciones microscópicas se obtienen de modos diversos que dependen de la naturaleza de la muestra y de los parámetros que queremos observar.
  • 56.
    • Hay distintos criterios que pueden utilizarse para clasifi­car las diferentes preparaciones microscópicas existentes. El criterio que vamos a seguir aquí consiste en establecer tres grupos:
    • Preparaciones para examen en fresco sin modificar.
    • Preparaciones para examen en fresco ligeramente modifica­das.
    • Preparaciones fijadas y teñidas.
  • 57.
    • La muestra a partir de la cual se obtiene debe ser una muestra directa fresca o un cultivo reciente, pues la utilización de muestras y cultivos envejecidos y no conservados adecuadamente puede hacer que las características observadas no correspondan a la realidad.
  • 58. 7 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO.
    • Entendemos por preparaciones en fresco sin modificar o simplemente preparaciones en fresco aquellas en las que la muestra se examina directamente, sin modificar o, como mucho, se diluye o concentra.
  • 59.
    • Presentan las ventajas siguientes:
    • Algunos elementos que queremos observar (microorganismos, células humanas, cristales, etc.) se observan suficientemente bien en fresco, ya sea utilizando el microscopio de campo claro o el de contraste de fases.
    • Permiten observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en ocasiones tiene interés analítico.
    • Algunas son preparaciones que se elaboran de forma rápida, simple y económica.
    • Observación de determinados fenómenos microscópicos, tales como división celular (células animales, levaduras, etc.) o formación de esporas.
  • 60.
    • Sus inconvenientes son estos:
    • No tienen validez universal: muchos microorganismos no son observables de este modo.
    • Hay características interesantes de los microorganismos que no son observables de este modo.
  • 61.
    • 7.1 Montaje húmedo o técnica de la cámara húmeda.
    • Consiste en verter una gota del líquido que contiene los microorganismos en el centro de un portaobjetos y cubrirlo después con un cubreobjetos, sin apretar demasiado para no adelgazar excesivamente la lámina de líquido incluida entre porta y cubre.
    • La evaporación acorta la vida de esta preparación.
    • Puede disminuirse la velocidad de evaporación sellando con vaselina o una sustancia similar el espacio que hay entre portaobjetos y cubreobjetos.
  • 62.
    • Muestras sólida, semilíquida o líquida demasiado espesa para su observación puede también examinarse de este modo diluyéndola previamente con agua que puede contener alguna sal.
    • La utilización de agua con sales se hace para que la presión osmótica del medio no sea demasiado baja
    • En muestras clínicas y también con otros tipos de muestras suele utilizarse como diluyente NaCl 0'9 %, que es isotónico con el plasma humano.
  • 63.
    • La observación suele hacerse con el objetivo de 40 aumentos.
    • No debe utilizarse el objetivo de inmersión, pues al desplazar la preparación el cubreobjetos permanece adherido al objetivo y esto crea turbulencias en el líquido de la preparación.
  • 64.
    • 7.2 Técnica de la gota pendiente.
    • Para la realización de la técnica de observación mediante el método de la gota pendiente, se utilizan unos portas especiales con una o dos excavaciones que permiten colocar un cubreobjetos invertido del que pende una pequeña gota de la suspensión bacteriana que vamos a observar.
    • Al tener un hueco, el volumen de líquido que mantiene el porta es mayor de manera que la preparación tienen un mayor tiempo de vida.
  • 65. 8 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO LIGERAMENTE MODIFICADAS
    • Nos referimos a preparaciones en fresco en las que a la muestra se le ha agregado una sustancia que facilita o mejora la observación de los microorganismos.
    • Son principalmente montajes húmedos tratados con un solo colorante o reactivo. Suelen usarse colorantes, aunque no siempre es así.
  • 66.
    • 8.1 Tinción vital.
    • La tinción vital, también llamada tinción o coloración supravital, es un procedimiento intermedio entre el examen en fresco sin modificación y las técnicas de fijación seguida de tinción.
    • Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales o de movilidad de los microorganismos que no es posible observar en fresco ni tras realizar modificaciones físicas y químicas profundas, como sucede con la fijación seguida de tinción.
    • Se prepara del mismo modo que un montaje húmedo, pero antes de cubrir la gota de muestra con el cubreobjetos se agrega una gota de un colorante que no mate los microorganismos, se mezcla con el asa y se cubre con el cubreobjetos. Los microorganismos que nos interesa observar absorberán el colorante más que el medio y que los otros elementos formes (si el colorante está bien elegido).
    • Al observarlos en campo claro absorberán más la luz y aparecerán coloreados más intensamente que otros elementos formes y que el medio que los rodea.
  • 67.
    • Los colorantes usados suelen ser los mismos que se utilizan para las tinciones simples (se verán más adelante) aunque muy diluídos (diluciones de 1/10.000).
    • Esto se hace porque los colorantes son tóxicos para las células. La superior dilución disminuye su toxicidad y esto permite observar microorganismos teñidos y vivos.
    • No hay que olvidar, sin embargo, que la superior dilución del colorante no anulará su toxicidad; tan sólo retrasará la muerte de los microorganismos.
  • 68.
    • 8. 2 Preparación con KOH al 10 %.
    • El empleo de KOH al 10 % en agua permite distinguir los elementos estructurales de los hongos miceliformes en muestras frescas.
    • El álcali digiere parcialmente las proteínas presentes (tanto del hongo como de las células infectadas y del medio) pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
    • La preparación se realiza colocando una pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos. Se agrega una gota de KOH 10 %. Se cubre con un cubreobjetos y se presiona ligeramente el portaobjetos, con el cubreobjetos hacia abajo, sobre papel de filtro para eliminar el exceso de líquido. La preparación puede observarse después de esperar varios (3‑10) minutos a temperatura ambiente.
    • No es conveniente calentar para acelerar la proteólisis, pues puede deteriorarse la muestra.
  • 69. 9 PREPARACIONES FIJADAS Y TEÑIDAS.
    • Para observar las características morfológicas de las bacterias y también de otras células las preparaciones fijadas y teñidas son las que se emplean con mayor frecuencia. Las ventajas de este procedimiento son:
    • Las células son más fácilmente visibles después de teñidas.
    • Pueden diferenciarse especies bacterianas diferentes mediante procedimientos de tinción diferencial.
  • 70.
    • 9.1 Consideraciones al proceso de tinción
    • En la tinción es imprescindible utilizar colorantes de alta calidad. La presencia de impurezas puede hacer que varíen las características del colorante y con ello las características de la tinción.
    • También es relativamente frecuente que aparezcan partículas sólidas que se depositan sobre la extensión y son confundidas con gérmenes u otros elementos formes. Tanto a los colores anormales como a los elementos formes observados que no proceden de la muestra se les llama artefactos.
    • Su concentración debe ser la adecuada. En algunos procedimientos es necesario calentar y en otros añadir reactivos adicionales, como el lugol en la tinción de Gram.
    • Controlar el tiempo de tinción es fundamental. En general oscila entre 30 segundos y 10 minutos. Si nos pasamos la muestra se tiñe en exceso, y si el tiempo es insuficiente, no conseguiremos suficiente contraste
  • 71.
    • 9.2 Tinción simple
    • Los pasos esenciales son:
    • Obtener una extensión de la muestra: A esta extensión también se le llama frote, frotis o película. Debe ser suficientemente delgada y los más homogénea posible.
    • Fijar la extensión
    • Tinción: Que puede ser por inmersión o por vertido.
    • Lavado
    • Secado
  • 72.
    • 9.3 Tinción diferencial
    • Se llama así a los procedimientos de tinción que ponen de manifiesto diferencias entre distintas células, o bien entre las distintas partes de una célula.
    • Estas diferencias pueden observarse gracias no sólo a diferencias de forma sino también de color. Habitualmente implican el uso de más de un colorante en etapas sucesivas.
  • 73.
    • Tinción de Gram.
    • Esta coloración, ideada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos:
    • Grampositivas: aquellas que toman el colorante básico (cristal violeta, violeta de genciana o violeta de metilo) resistiendo a la decoloración en las condiciones que más adelante se describen y por tanto se observan de color violeta intenso.
    • Gramnegativas: aquellas que son decoloradas por alcohol o alcohol/acetona, observándose del color de un colorante de contraste, que puede ser safranina O (las bacterias se observan de color rojo amarillento), fuchsina o fuchsina fenicada diluída 1/10 (las bacterias se observan de color rosado).
  • 74.
    • Protocolo de tinción diferencial:
    • Una extensión secada y fijada se cubre con la primera disolución colorante, por ejemplo violeta de genciana. El tiempo de tinción elegido oscila entre 20 y 90 segundos.
    • Lavar con agua con chorro débil.
    • Cubrir con lugol. Esperar 1 minuto.En otros laboratorios el tiempo de reacción con lugol oscila entre el doble y la mitad del tiempo de reacción con el primer colorante violeta. El lugol contiene el ión complejo I 3 ‑ que penetra en la célula bacteriana.
    • El ión complejo se descompone y el I 2 liberado reacciona con el violeta de genciana o el colorante similar que se esté usando para dar lugar a un complejo colorante-yodo más oscuro.
    • Lavar con agua.
  • 75.
    • Decolorar aplicando un chorro fino de etanol/acetona 3/1 (v/v) hasta que no se observe arrastre de colorante.
    • La decoloración es el paso crítico. Un disolvente orgánico arrastra el colorante que no ha sido absorbido por bacterias Grampositivas: las bacterias Grampositivas permanecen de color violeta oscuro y las Gramnegativas, así como los demás restos de muestra, desprenden el colorante violeta y se muestran incoloros.
    • Lavar con agua.
    • Aplicación de un colorante de contraste.
    • Las bacterias Gramnegativas, al haber sido decoloradas están en este momento transparentes. Es necesario teñirlas con un colorante que no cree confusión. Normalmente se utiliza o bien safranina O o fuchsina fenicada. Las bacterias Gramnegativas se tiñen de rojo amarillento (safranina O) o de rosado (fuchsina). Las Grampositivas también se unen al colorante de contraste, pero como están teñidas de un color violeta oscuro, el colorante de contraste no altera su aspecto.

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