Grupo de Investigación en
Inmunología y Biología
Molecular
Universidad del Atlántico
2008

Caracterización del haplotipo en la secuencia
de la región control (D-Loop) del ADN
mitocondrial en el manatí Trichechus manatus
Carlos Alberto Beltrán Sánchez
Mileydis María Vargas Rodríguez
Director: PhD (C) Lourdes Varela
Grupo de Investigación en Inmunología y Biología
Molecular

CARACTERIZACIÓN DEL HAPLOTIPO EN LA SECUENCIA DE LA REGIÓN CONTROL (D-LOOP) DEL ADN MITOCONDRIAL EN EL MANATÍ TRICHECHUS
MANATUS
Introducción
• El manatí ha sido explotado durante
muchos años por diversas poblaciones
humanas.
• Trichechus manatus, forma parte de la lista
de especies amenazadas de la convención
CITES y el libro rojo de la UICN.
• La conservación de los manatíes es necesaria debido a su
importancia ecológica.

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MANATUS
• Estudios moleculares anteriores sugieren que Colombia puede
ser el lugar de origen del Manatí Caribeño (T. manatus)
• El estudio del ADNmt es importante para reconocer zonas
variables dentro del genoma de las especies.
• La región control se ha empleado
como punto de referencia para
investigar estructura genética
de poblaciones entre diferentes
especies.

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MANATUS
ADN mitocondrial
• Material genético circular de doble cadena
• El estudio del ADN mitocondrial de una especie, permite detectar
polimorfismos: distintos tipos de ADNmt que se presentan en una misma
especie y que corresponden a distintos linajes (haplotipos).
• La región control del ADNmt se destaca por su elevada tasa de mutación, y
por esto es utilizado como marcador molecular.

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MANATUS
Trichechus manatus
• Se distribuye en aguas costeras, ríos, estuarios y lagunas desde el
norte de Florida hasta el noreste de la costa de Brasil. (Mou &
Chen, 1990).
• En Colombia se
encuentra en el bajo
Magdalena, Atrato,
Sinú y algunos ríos
de la Orinoquía
colombiana.

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Ficha Taxonómica
Ficha taxonómica
Reino Animalia
Subreino Metazooaria
Filo Chordata
Subfilo Vertebrata
Superclase Tetrapoda
Clase Mammalia
Subclase Theria
Infraclase Eutheria
Orden Sirenia
Familia Trichechidae
Género Trichechus
Especie Trichechus manatus
Subespecie Trichechus manatus manatus

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MANATUS
Objetivo General
Caracterizar el haplotipo en la secuencia de la
región control (D-Loop) del ADN mitocondrial
en el manatí Trichechus manatus.

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Objetivos Específicos
• Determinar el método mas confiable de obtención de ADN de
alta calidad y en suficiente cantidad a partir de muestras de piel,
sangre y hueso de manatí T. manatus, mediante la comparación de
tres métodos de extracción.
• Identificar el haplotipo de las muestras analizadas mediante la
secuenciación del producto amplificado con la técnica de PCR.
• Relacionar el haplotipo del individuo estudiado con otros
haplotipos obtenidos para esta especie en investigaciones
anteriores.

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DISEÑO METODOLÓGICO
Colecta de las muestras Fase de laboratorio Procesamiento de los datos
Se tomó la muestra
de cuatro individuos Extracción de ADN Descripción del producto
1ml de sangre, manatí del Amplificación de Base de datos GenBank
Caño aguas negras y marcadores moleculares
Ciénaga grande de Santa Marta
Secuenciación de Software Mega 4, BioEdit,
Una biopsia de tejido manatí los productos Clustal W
de San Bernado del Viento
Córdoba
Se tomó una porción de hueso
manatí proveniente del
caño aguas negras

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Resultados
• Las modificaciones a este protocolo consistieron en:
- Tiempo adecuado de incubación: 1h
- Temperatura de incubación: 70 – 80º
- Cantidad de la muestra empleada: 1cm cuadrado
- Tiempo de agitación con vórtex: 10seg cada 15min
• Comparación de los métodos
Fuente
Método Protocolo Resultado
de ADN
Sangre 1 Chelex 5% (mancha s de sangre en papel filtro) +
Chelex 5% (Tejido cutáneo), Chelex 20% -
Piel 1 -
Proteinasa K Solución Li si s - Chelex 5%
2 Tritón - Fenol:Cloroformo - CTAB -
3 Kit de extracción de ADN +
Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) con
Hue so 2 +
precipitación con acetato de amonio.

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Métodos 1 y 2 para muestras de sangre y piel
1 2 3 4 5 6 7 8
550 pb 650 pb
Aprox. 500 pb
• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, muestras amplificadas con los iniciadores
H16894 y L15925. 1. Chelex 5% en manchas de sangre, 2. Chelex 5% en tejido cutáneo, 3.
Solución Lisis-Chelex 5%, 4. Chelex 20%-Proteinasa K, 5.Método 2: Tritón- Fenol: cloroformo-
CTAB. 6. Reamplificación método 2, 7. Marcador de Peso Molecular 1Kb.

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Método 2 para muestras de hueso
1 2 3 4 5 6 7 8
550 pb
600pb aprox.
500pb
• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, muestras amplificadas con los iniciadores
H16894 y L15925 1. Marcador de Peso Molecular 100pb, 2. y 3. Fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25:24:1) 4. y 5. Reamplificación 6. y 7. Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1)
– Acetato de amonio 8. Control positivo

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Métodos 1 y 3 en muestras de sangre y piel
1 2 3 4 5 6 7 8
600 pb 550 pb
500 pb aprox.
• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, comparando de los métodos de extracción
positivos 1 y 3 muestras amplificadas con los iniciadores H16894 y L15925 1. Marcador de Peso
Molecular 100pb, 2. y 3. Método 1: Chelex 5%, manatí Zoológico de Barranquilla 4. y 5. Método
3: Kit de extracción, manatí San Bernardo del Viento, 6. y 7. Método 1: Chelex 5% manatí
Ciénaga Grande de Santa Marta

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Cuantificación del ADN genómico
Tipo de Método de Abs Abs µgADN/
Muestra Abs260/280
muestra extracción 260 280 ml
Caño Aguas
Negras, Rio 0.054 0.054 1.000 17.49
Sangre Chelex 5%
Magdalena
San
Bernardo 0.071 0.050 1.78 103.7
Piel Kit Promega
del viento
Ciénaga
Grande de Sangre Chelex 5% 0.063 0.049 1.56 77.66
Santa Marta
• Se obtuvo un ADN de 89% de pureza y 103.7µg/ml de
concentración con el uso del Kit Wizard de Promega

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Secuenciación del producto de la amplificación de la región
control del ADN mitocondrial de la muestra del individuo
proveniente de San Bernardo del Viento - Córdoba
Segmento del cromatograma obtenido a partir de la secuenciación de la Región Control del ADN
mitocondrial en T. manatus
• Se obtuvo un cromatograma con el que se estableció la secuencia
nucleotídica de 550pb aproximadamente, la secuencia se
denominó Tma1.

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Determinación del haplotipo del ejemplar de San
Bernardo del viento - Córdoba
• Del alineamiento en el programa BLAST, se determinó la secuencia consenso para la
muestra analizada correspondiente a 410pb.
• La secuencia obtenida presentó un porcentaje de máxima identidad nucleotídica 98% con
el haplotipo C01
Número de Max- Total E Max
Descripción
acceso score score value ident
Trichechus manatus haplotype C01 control region,
AY963846.1 736 736 0.0 98%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype A01 control region,
AY963840.1 725 725 0.0 98%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype D01 control region,
AY963847.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype B01 control region,
AY963845.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype A05 control region,
AY963844.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype A04 control region,
AY963843.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype A03 control region,
AY963842.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus manatus haplotype A02 control region,
AY963841.1 719 719 0.0 97%
partial sequence; mitochondrial
Trichechus inunguis haplotype X01 control region, 9e-17
AY963893.1 634 634 94%
partial sequence; mitochondrial 9
Trichechus senegalensis haplotype Y02 control 2e-17
AY963895.1 606 606 92%
region, partial sequence; mitochondrial 0
Dugong dugon haplotype Dd control region, partial
AY963899.1 326 326 6e-86 81%
sequence; mitochondrial

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• Para determinar los sitios de identidad nucleotídica con los haplotipos
reportados en GenBank se obtuvo un alineamiento múltiple permitiendo
destacar los sitios conservados y polimórficos
• El alineamiento se presenta en base al haplotipo C01

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• Los sitios conservados se representan por puntos y los sitios
variantes o polimórficos están determinados por los cambios de
base en diferentes puntos de la secuencia.

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• Los sitios variantes van desde 2 bases para el haplotipo A01
hasta 28 bases en los haplotipos G02 y H01.

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• Se presentan sitios de confusión representados por la letra N correspondiente
a las bases 229, 347, 352, 358 y 362, sin embargo corresponden a sitios
conservados o comunes en todos los haplotipos reportados para la especie

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• Para Colombia se han reportado 8 haplotipos para la especie y la
secuencia de este estudio, sigue presentando alta similaridad con
el haplotipo C01.
• Se descarta el haplotipo A05 que presenta porcentaje similar de
97% ya que en el sitio 192 presenta la base guanina.

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Composición y frecuencia nucleotídica
T(U) C A G Total
HaplotypeA01 31.0 28.5 26.6 13.9 410
HaplotypeA02 30.7 28.8 26.6 13.9 410
HaplotypeA03 31.0 28.5 26.3 14.1 410
HaplotypeA04 31.2 28.3 26.6 13.9 410
HaplotypeA05 30.7 28.8 26.6 13.9 410
HaplotypeB01 31.2 28.3 26.6 13.9 410
HaplotypeC01 30.7 28.8 26.8 13.7 410
HaplotypeD01 30.7 28.8 27.1 13.4 410
HaplotypeE01 31.0 28.5 28.3 12.2 410
HaplotypeG01 31.0 28.5 28.0 12.4 410
HaplotypeG02 31.0 28.5 27.8 12.7 410
HaplotypeH01 30.7 28.8 28.0 12.4 410
HaplotypeI02 31.2 28.5 28.0 12.2 410
HaplotypeJ01 31.0 28.8 28.0 12.2 410
HaplotypeK01 31.2 28.8 27.6 12.4 410
HaplotypeL02 31.5 28.3 27.3 12.9 410
HaplotypeM01 31.5 28.3 27.1 13.2 410
HaplotypeM02 31.7 28.0 27.1 13.2 410
HaplotypeM03 31.2 28.5 27.1 13.2 410
HaplotypeN01 31.2 28.3 27.1 13.4 410
HaplotypeO01 31.5 28.3 26.8 13.4 410
Tma1 30.7 28.7 26.7 13.9 404
Promedio 31.1 28.5 27.2 13.2 409.7

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Discusión
• Se obtuvo el análisis genético completo para el manatí proveniente de
San Bernardo del Viento – Córdoba. Sugiriendo la presencia del
haplotipo C01 en Colombia como lo plantea Vianna et.al (2006) quien
clasifica a los individuos de esta especie en tres clusters ubicando al
C01 dentro del Cluster I.
• En Colombia la variedad haplotípica es alta confirmado por la
presencia de 8 haplotipos (Vianna et. al 2006) principalmente por las
características hidrográficas del país.
• Existe similaridad alta con el haplotipo A01 que no esta reportado para
Colombia.

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• La especie T. manatus presenta porcentaje de similaridad de 94% con T.
inunguis, dato que concuerda con los resultados de estudios evolutivos
como el de Vianna et.al (2006) donde destaca esta especie como el
pariente mas cercano del manatí caribeño.
• En filogeografía el estudio de la región control del ADN mitocondrial
constituye la vía mas acertada para determinar el origen de la especie T.
manatus soportado por investigaciones anterirores como la de Vianna
et.al (2006), la cual sugiere a Colombia como el probable lugar de
origen del manati antillano debido a la alta variabilidad genética
encontrada en el país.

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Conclusiones
• La secuenciación de la región control del ADN mitocondrial,
permitió identificar el haplotipo del individuo de San Bernardo
del Viento Córdoba.
• Se obtuvo una secuencia cercanamente relacionada con el
haplotipo C01 con un porcentaje de filiación de 98%.
• Para las manchas de sangre vertidas en papel filtro el método 1
fue el mas confiable para la obtención de ADN; para las
muestras escasas de tejido cutáneo el Kit Wizard mostró los
mejores resultados y en la obtención de ADN de hueso el fenol:
cloroformo: alcohol isoamílico con acetato de amonio fue el
método que mostró resultados positivos.

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Recomendaciones
• Utilizar un método de extracción de ADN con el cual se logre aislar
directamente ADN mitocondrial
• Para las extracciones de ADN de material antiguo se empleen protocolos que
garanticen el total aprovechamiento de toda la fuente de extracción.
• Emplear un protocolo de purificación del ADN inmediatamente después de
amplificado.
• Secuenciar en ambos sentidos para asegurar la ocurrencia de las bases en el
ADN estudiado.
• Completar este estudio con las muestras que no se pudieron secuenciar y
unificar la información que se obtenga del análisis a otros individuos de la
especie Trichechus manatus.

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Agradecimientos
• A la Fundación Zoológico de Barranquilla, la Fundación Omacha y al Museo
de Colecciones Biológicas de la Universidad del Atlántico por la ayuda en la
consecución de las muestras.
• Al grupo de Investigación de Inmunología y Biología Molecular de la
Universidad del Atlántico por el apoyo y financiamiento de este proyecto.
• A nuestra directora Lourdes Varela Prieto por formarnos en el camino de la
investigación.
• A los profesores Carmiña Vargas y Alfredo Lagares de la Universidad del
Atlántico, por sus asesorías que fortalecieron esta investigación.
• A nuestros pares evaluadores Dary Luz Mendoza y Roger del Valle por sus
valiosos aportes y conocimientos.
• A los integrantes del grupo de investigación Samir, Gina, Juan, Isis, Jose,
Aimara y demás integrantes por colaborarnos en la ejecucion de este trabajo.

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Método 1: Extracción con Quelex
En un eppendorf se agregó un trozo de papel filtro con agua, 200 ml
MANCHAS
resina chelex 5%, se incubó 70-80º y vórtex. Se centrifugó y se extrajo
DE SANGRE
el sobrenadante. Walsh et.al (1991)
• Se colocó un pedazo en sln Chelex 5%, se incubó 45min 100º,
vórtex y se centrifugó 13000 rpm cada 15 min. Se extrajo el
sobrenadante. Morín et. al. (1994)
• Se coloco un fragmento en sln Chelex 20% y Proteinasa K
PIEL 20mg/ml, se incubó 12h 55º se centrifugó y se colectó el
sobrenadante Goupurenco (2002)
• Se colocó un fragmento en una sln lisis celular (Chelex 5%, SDS
0.2%, Tris 10mM pH 8.0 EDTA 0.5mM pH 8.0 y Proteinasa K
20mg/ml) se incubó 12h 65º, vórtex y se colectó el sobrenadante

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Método 2: Extracción con Solventes orgánicos
Se maceró la muestra y se agregó Tritón 2%, se calentó a 94º, se
centrifugó a 13000rpm se tomó el sobrenadante y se extajo con fenol:
PIEL cloroformo 24:1, seguido de la adición de NaCl y CTAB, se agregó
igual volumen de fenol: cloroformo 24:1, fue precipitado con
isopropanol y lavado con etanol. Saad et.al (1995)
El hueso se desinfectó con hipoclorito, se pulverizó con martillo
estéril a 0.3gr de hueso se agregó Tris-HCl 10mM pH8.0, NaCl
100mM, SDS 2%, Proteinasa K 1mg/ml se incubó a 60º en agitación
HUESO
continua durante 72h. Se centrifugó y se extrajo el sobrenadante con
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25:24:1. Se precipitó con
Acetato de amonio 3M. Riego et.al. (1997)
Método 3: Extracción con Kit
Se utilizó Kit Wizard Genomic DNA siguiendo el protocolo de
PIEL
instrucción del fabricante

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Cuantificación del ADN Genómico
• Espectofotometría UV
Cubetas de cuarzo
Dilución 1:50 de ADN
en TE 1X
260nm 280nm
µg/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilución X 50 mg ADN/ml) Spectronic
BioMate3
(Thermo)

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Reacción en cadena de la polimerasa
• Amplificación del marcador molecular mediante PCR:
– Región Control L15926 (5’-TCA AAG CTT ACA CCA GTC TTG
TAAACC - 3’) y H16498 (5’- CCT GAA CTA GGA ACC AGA TG -3’)
Kocher, T. D. 1989
• Protocolo de Vianna et.al (2006) 35 ciclos de amplificación:

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Mezcla para la PCR
Componentes Volumen x Reacción Concentración
25µL final
Buffer PCR 10X 2.5µL 1X
MgCl2 50mM 0.8 µL 1.5mM
dNTPs 10mM 0.5 µL 200µM
Primer L 10 µM 1.5µL 0.5µM
Primer H 10 µM 1.5µL 0.5µM
Taq Polimerasa 0.25 µL 2.5 U
5U/µL
ADN (muestra) 10 µL 20µg/ml

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Electroforesis
• Geles de agarosa estándar 1.5%
• 1µg/ml bromuro de etidio
• Buffer TBE 0.5X
• Condiciones del corrido:
70V durante 1h.
• Geles de agarosa bajo punto de fusión
3.0%
• 0.6µg/ml bromuro de etidio
• Buffer TBE 0.5X
• Condiciones del corrido:
45V durante 6h.
• Visualizados en el fotodocumentador Universal HoodII

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Secuenciación
• Secuenciador
MegaBace DNA
analysis system
(Amersham)
• kit DYEnamic ET
Dye Terminador Kit
(Amersham)
• PCR Clean-Up
System (Promega)

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Números de acceso a las secuencias de los
haplotipos en la base de datos GenBank
Numero de
Número HAPLOTIPO acceso
GenBank
1 Haplotipo A01 AY963840.1
2 Haplotipo A02 AY963841.1
3 Haplotipo A03 AY963842.1
4 Haplotipo A04 AY963843.1
5 Haplotipo A05 AY963844.1
6 Haplotipo B01 AY963845.1
7 Haplotipo C01 AY963846.1
8 Haplotipo D01 AY963847.1
9 Haplotipo E01 AY963848.1
10 Haplotipo G01 AY963849.1
11 Haplotipo G02 AY963850.1
12 Haplotipo H01 AY963851.1
13 Haplotipo I02 AY963852.1
14 Haplotipo J01 AY963853.1
15 Haplotipo K01 AY963854.1
16 Haplotipo L02 AY963855.1
17 Haplotipo M01 AY963856.1
18 Haplotipo M02 AY963857.1
19 Haplotipo M03 AY963858.1
20 Haplotipo N01 AY963859.1
21 Haplotipo O01 AY963860.1