Marcha toxicologica
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  • 1. MARCHA TOXICOLÓGICA DE URGENCIA PARA LABORATORIOS DE BAJA COMPLEJIDAD Las técnicas citadas han sido recopiladas de libros, apuntes personales e internet, o bien cedidas por colegas bioquímicos de diferentes laboratorios del país. Ninguna de las técnicas es de producción personal, pero se les dio el ordenamiento de MARCHA TOXICOLÓGICA que aplico en mis lugares de trabajo.RAQUEL FERNÁNDEZ DE CATTANEOBIOQUÍMICA - TOXICÓLOGA - CRIMINÓLOGALaboratorio de Toxicología del Cuerpo Médico Forense.Poder Judicial de Mendoza.Adjunta de Cátedra de Química Toxicológica y Legal.Facultad de Bioquímica - Universidad Juan Agustín Maza.Responsable del Área de Criminología. Post Grado de Medicina Legal.Facultad de Ciencias Médicas - Universidad Nacional de Cuyo.Docente de la Cátedra de Toxicología, Maestría en Criminología.Facultad de Psicología - Universidad del Aconcagua.Mendoza - ArgentinaAño 2007Tel: 261 - 4445871e-mail: raquelcattaneo@millic.com.ar
  • 2. 2 MARCHA TOXICOLÓGICA DE URGENCIAI- OBJETO: realizar una marcha toxicológica sencilla, de manera de poder descartar o confirmar grandes grupos de tóxicos.II- INFORMACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS: antes de comenzar un análisis es importante obtener tanta información sobre el paciente como sea posible: médica, social, la historia ocupacional, tratamiento dado, y de resultados de laboratorio o de otras investigaciones previas. Indagar acerca del tiempo que transcurrió entre la ingestión o exposición y la colección de muestras.. Toda la información relevante sobre un paciente se debe registrar en el laboratorio.III- POOL BÁSICO DE MATERIALES PARA LABORATORIOS DE URGENCIAS TOXICOLÓGICAS A) SANGRE. B) ORINA. C) CONTENIDO GÁSTRICO.IV- RECOLECCIÓN , CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE A) SANGRE: tratar de no dejar cámara de aire. 1. Sangre heparinizada: 10ml, como mínimo. 2. Sangre con FlNa u oxalato : 2ml. B) ORINA. En lo posible 50ml, en envase estéril, hermético y sin conservantes. La muestra se debe obtener cuanto antes, idealmente antes de que se inicie cualquier terapia de droga. C) CONTENIDO GÁSTRICO: como mínimo 20ml, en envase estéril, hermético y sin conservantes. 1. Vómito. 2. Aspirado gástrico. 3. Primer lavado gástrico. D) RESIDUOS DEL LUGAR DEL HECHO: Es importante que todas las botellas u otros envases y otros materiales sospechosos encontrados con o cerca del paciente (residuos de la escena) se recojan y conserven para el análisis en caso de necesidad puesto que pueden estar relacionados con el episodio de la intoxicación.V- RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO de MUESTRAS A) IDENTIFICACIÓN: Las muestras enviados para el análisis se deben etiquetar claramente con el nombre completo del paciente, la fecha y la hora de la recolección, aclarando la naturaleza del espécimen (sangre, orina, etc.). B) RECEPCIÓN: La fecha y la hora de la recepción de las muestras si no han sido obtenidas en el mismo nosocomio. C) REGISTRO: todas las muestras deben ser registradas con un número único para su identificación. D) ALMACENAMIENTO: todos las muestras biológicas se deben almacenar en 4°C antes y después del análisis. También debe disponerse de freezer para la conservación de las muestras cuando deban resguardarse por más tiempo.VI- PROCESAMIENTO DE LOS MATERIALES: esquema generalMarcha Toxicológica de Urgencia
  • 3. 3 A. TÓXICOS VOLÁTILES1. ETANOL I. Reacciones de ORIENTACIÓN: en orina, sangre, en contenido gástrico, líquidos varios.1) REACCION DEL BICROMATO DE POTASIO en cámara de ConweyMateriales: sangre 1ml, orina 1ml, humor vítreo 1ml, tejidos 4ml, cualquier líquido ainvestigar.En compartimento externo se coloca el material a investigar + agente liberador: CO3K2solución saturada 1ml, en el compartimento interno el agente captador 2ml de Soluciónsulfocrómica 0.1 NSe deja en reposo a T° ambiente por tres horas.POSITIVO: Se observa el cambio de color de naranja a verdoso. II. Reacción de CERTEZA1) REACCION DE LIEBEN MODIFICADA: para diferenciar etanol de aldehídoetílico y acetona2ml del destilado + 0.5ml NH4(OH) + gota a gota solución yodo yodurada hasta tinteoscuroEn presencia de alcohol etílico se produce un precipitado negro, que desaparece porcalentamiento y reaparece por agregado de reactivo. En las mismas condiciones el aldehídoetílico y la acetona producen yodoformo. III. CUANTIFICACIÓN1) COLORIMETRÍA en cámara de CONWEY: en SANGRE ENTERA (el valor lo da la curva o los testigos), en ORINA (en esta matriz, al resultado se le debe agregar un 10%), en contenido gástrico no es representativo ya que allí se encuentra lo que no se absorbió.Reacción INESPECÍFICA, basada en las propiedades reductoras del alcohol, la dantambién otros alcoholes, aldehídos, etc.Se basa en la lectura en espectrofotómetro de la aparición del color verde del Cr+++ (lecturaa 600nm) debido a la reducción del bicromato por la acción del etanol, o la desaparicióndel color amarillo del bicromato (lectura a 450nm).Se trabaja conCámara problema,Cámara blanco (en lugar de muestra, agua destilada),Cámara testigo (con solución de concentración conocida de etanol). a. Colocar vaselina en el borde de la cámara, preparar el vidrio esmerilado b. En el interior de la cámara: 1ml de Solución sulfocrómica 0.1 N c. En el exterior de la cámara: 100µl de la muestra + 0.5ml de CO3K2 solución saturada.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 4. 4 d. Cerrar herméticamente la cámara. e. Dejar a temperatura ambiente una hora más ó menos. f. Se deja enfriar y se transfiere el líquido colector a tubos de ensayo, se lava la cámara con agua se vuelca en el tubo y se enrasa a 4ml con agua destilada. Se hace la lectura en espectrofotómetro a 450nm del blanco, del problema y del testigo (enlugar de testigo, se puede realizar una curva de calibración con varias cámaras consoluciones de concentraciones conocidas).Cp Ct Cp = Ct . DOpDOp DOt DOtSE DEBE REALIZAR CURVA DE CALIBRACIÓN PREVIA, O TRABAJAR CONTESTIGO DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA.2. METANOL1) Reacción del ácido cromotrópico para diferenciar de etanol. Reacción ESPECÍFICA. Se realiza en sangre, orina, contenido gástrico. Se puede cuantificar, en realidad el solo hecho de encontrarlo ya es diagnóstico de intoxicación, NUNCA debe encontrarse en estos materiales. 30 ´ /T°AMuestra + carbonato potasio sol sat 2ml sulfúrico 10%Reactivos a. ácido sulfúrico al 10% (fijador) b. solución saturada de carbonato de potasio c. solución acuosa de permanganato de potasio d. solución acuosa saturada de bisulfito de sodio de preparación reciente e. ácido cromotrópico al 0,5% f. ácido sulfúrico concentradoTécnica Se coloca en el compartimiento interno 2ml de ácido sulfúrico al 10 %, en el externo2ml de solución saturada de carbonato de potasio más 1ml de sangre (o la muestra aanalizar). Se mezcla por rotación suave y se deja difundir 2 horas a temperatura ambiente.Luego se toman 2ml de la solución del compartimiento central, repartiéndose por partesiguales en dos tubos rotulados 1 y 2. En el tubo 1 se agrega 0.15ml de la solución acuosa de permanganato de potasio, y enel 2 un volumen similar de agua destilada. Luego ambos tubos se procesan del mismomodo, comenzando por dejarlos reposar 10 minutos para que el metanol se oxide a formol,luego de los cuales se debe agregarles 0.2ml de la solución acuosa saturada de bisulfito deMarcha Toxicológica de Urgencia
  • 5. 5sodio y agitar hasta decoloración total, después de la cual se debe agregar 0.2ml del ácidocromotrópico al 0.5% y mezclar bien colocando ambos tubos en un baño de hielo y sal.Posteriormente se agregan 2.5ml de ácido sulfúrico concentrado y se lleva a baño maríahirviente durante 15 minutos. Se deja enfriar y se mezcla, y se lee a 570 manómetros.Abs. del metanol = Abs tubo 1 – Abs tubo 2Abs. del formol = Abs tubo 2 – Abs del blanco Para estimar la concentración del formol y del formaldehído debe hacerse una curvade calibración, con una solución madre de metanol (790mg/l) que se prepara diluyendo1ml de metanol absoluto en c.s.p. para 1.000ml con ácido sulfúrico al 10% v/v. En la tablainferior se detallan los puntos tentativos de la curva. Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4Metanol mg/l - 197.5 395 592 790ml metanol - 0.25 0.5 0.75 1(sol. madre)ml de H2SO4 1 0.75 0.5 0.25 -10% v/v La curva se realiza agregando a todos los tubos la solución acuosa de permanganatode potasio y realizando todos los pasos de la reacción descripta. El resultado anteriordeberá multiplicarse por 1.21 en el caso de muestras de sangre u orina pues la tensión delmetanol no se reduce a cero en él líquido absorbente (H2SO4 10% v/v) del compartimientocentral de la cámara, alcanzándose el equilibrio de difusión cuando la absorción adquiereun valor aproximado al 82.5%. El color obtenido con el ensayo cromotrópico sigue la leyde Beer dentro de los límites de la curva de calibración. Si las lecturas fueran muy altas sepuede diluir (B, T y D) a 10ml con H2SO4 48% v/v.3. MONÓXIDO DE CARBONOTodas estas reacciones se realizan en SANGRE ENTERA. I- Reacciones de ORIENTACIÓN1) ENSAYO DE DILUCIÓN Se diluye en dos tubos rotulados, una muestra de sangre normal como testigo y lamuestra problema, al 1% en agua destilada (+ó-).Agua destilada 10ml + unas gotas de sangre entera de la muestra observar ladiferencia de color entre el problema y el testigo. La sangre normal es de color rojo naranja, y la del intoxicado con CO es de color carmín.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 6. 62) ENSAYO ALCALINO:(Reacción de Hoppe – Seyler).. Se les agrega unas gotas de Na(OH) 0,1N a cada tubo y seobserva la diferencia y la velocidad de cambio de coloración.Agua destilada 10ml + unas gotas de sangre entera de la muestra + Na(OH)observar la diferencia de cambio de color entre el problema y el testigo.La sangre normal inmediatamente comienza a ponerse de un color verde castaño desde elfondo del tubo hacia arriba, la sangre de un intoxicado se acentúa el color carmín y demoraen cambiar de color o no cambia. II- REACCIONES DE CERTEZA1) Difusión en cámara de CONWAY: - aislamiento - identificacion - cuantificacionAISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN; con cloruro de paladio (Cl2Pd); en estatécnica los dos pasos se realizan conjuntamente.El CO es liberado de su combinación con la hemoglobina por ácidos diluidos (agenteliberador en cámara externa con la muestra problema: SO4H2 al 10%) y difundido a unasolución captadora de cloruro de paladio (Cl2Pd 0.01: 0.088gr%ml de agua) que se colocaen la cámara interna. Se deja aproximadamente 2 horas. a. En el interior de la cámara: 2 ml de Cl2Pd 0.001N. b. Colocar vaselina en el borde de la cámara, preparar el vidrio esmerilado c. En el exterior de la cámara: 1ml de la muestra + 1 ml de sulfúrico al 10% d. Cerrar herméticamente e. Dejar a temperatura ambiente 2hs.Si la reacción es sólo cualitativa, es suficiente esperar a que se forme el Pd° como películanegra.SIEMPRE realizar una prueba en paralelo con sangre normal, a veces el Cl2Pd seautoreduce y dar un falso positivo, si esto sucede se debe preparar nuevamente la soluciónde paladio. La concentración del reactivo de paladio es la que indica Gisbert Calabuig pararealizar luego la cuantificación, en nuestro laboratorio como es forense no cuantificamos,por lo que la solución del reactivo la hago un poco más concentrada para ver mejor lapelícula de Pd°. III- CUANTIFICACIÓNCARBOXIHEMOGLOBINA.Método facilitado por la Red de Toxicología RETOXLABDEFINICIONES-ABREVITURAS: Carboxihemoglobina (COHb), Oxihemoglobina(OHb), solución (sol), minutos (min).Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 7. 7DESARROLLOMUESTRA:Sangre obtenida por punción venosa o arterial y recolectada sobre Heparina en un tubo lomás hermético y lleno posible (para evitar pérdidas por evaporación). Se puede conservarhasta 48 hs en heladera. En lo posible remitir lo antes posible al laboratorio.FUNDAMENTO:Las distintas formas de la Hemoglobina tienen la particularidad de presentar bandas deabsorción en la región del espectro visible. En solución alcalina y en presencia de hidrosulfito la oxiHb y la metaHb se transformanen deoxiHb con un máximo de absorción a 555 nm.La COHb no es afectada en estas condiciones y su máximo ocurre a 541 nm.El empleo de la solución amoniacal es para formar hematina alcalina que posee una curvade absorbancia distinta a la COHb y OHb.REACTIVOS:Solución de hidróxido de amonio 0.12M (1.6 ml de amoníaco en 100 ml de aguadestilada), es estable en heladera por un año. Hidrosulfito de sodio sólido (ditionito), ácidosulfúrico, formiato de sodio, hidróxido de sodio 10 %(P/V).INSTRUMENTAL:Espectrofotómetro que posea un ancho de banda de 3nm. Celdas de lectura de 10 mm depaso de luz. Centrífuga. Equipo generador de monóxido de carbono.TÉCNICA:1.- Realizar una dilución de la sangre 1/10 en agua (0.5 ml + 4.5ml). Homogeneizar. Dejaren reposo 5 min. Y centrifugar 10 min a 3000 rpm.2.- Tomar 0.5 ml de la sol anterior y colocar en 4.0 ml de sol amoniacal y agregar unapizca (aproximadamente 10 mg) de ditionito. Homogeneizar y dejar reposar 5 min.3.- Leer las absorbancias a 541 y 555 nm.4.- Obtener el cociente de absorbancias Ab 541/Ab 555.Cálculo: Empleando la relación obtenida en el punto 4 anterior, entrar en la curva de calibración (oempleando la ecuación de regresión lineal) y hallar el % de COHb.Construcción de una curva de calibrado:A una muestra de sangre fresca obtenida con heparina (o pool de muestras) de pacientesnormales, no fumadores y sin patologías respiratorias, efectuar dos diluciones 1/10 porseparado en agua.A una fracción hacer burbujear Oxígeno de 99.5% de pureza por 15 min para eliminar elposible monóxido de carbono presente.A una segunda fracción hacer burbujear monóxido de carbono durante 20 min obtenido apartir de ácido sulfúrico y formiato de sodio (como se describe en el diagrama); si sedispone de un tubo de monóxido de 99.5% de pureza, burbujear 5 min. De esta manera seobtendrá una sangre con 100% de saturación.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 8. 8Empleando la 1º fracción no contaminada realizar diluciones de manera de obtener 75, 50,25, 12.5 y 6.25 y 0 % de saturación.Procesar como se indica en la técnica a partir del punto 2.Construir la curva de calibración, representando en el eje Y la relación de Abs y en X el %de saturación de COHb.Generador de Monóxido de Carbono:(1) Acido sulfúrico. (2) Formiato de sodio o ácido Fórmico. (3) Solución de Hidróxido de Sodio al 10% (P/V). (4) sangre a saturar.Sobre 1 gr de Formiato o 10 ml de ác. fórmico hacer caer de 5 a 10 ml de sulfúricoconcentrado gota a gota (lentamente y de a poco según la intensidad del burbujeo en lasolución sanguínea). El calentamiento del balón debe ser suave y transitorio (cuando elburbujeo disminuye francamente).4. CIANUROS I. REACCIÓN DE IDENTIFICACIÓN1) Investigación de CIANURO por difusión en cámara de Conway: en CONTENIDO GÁSTRICO. a. En el interior de la cámara: 2 ml de Na(OH) 0.1N b. Colocar vaselina en el borde de la cámara, preparar el vidrio esmerilado c. En el exterior de la cámara: 2 ml de la muestra + 1 ml de sulfúrico al 10 d. Cerrar herméticamente e. Colocar en estufa 40ºC 1 hora f. Trasvasar el líquido colector a un tubo de ensayo y verificar la presencia de CN-.Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 9. 9Formación del Azul de Prusia: específica para cianuros.Se recoge 1ml mililitros del centro de la cámara + 1ml de sulfato ferroso al 10% reciénpreparado, se calienta suavemente, enfriar, y se agregan unas gotas de ácido clorhídrico.En caso de haber cianuros en la muestra aparecerá el color azul característico.2) Investigación de CIANURO por difusión en erlenmeyer con tapa hermética y papel alcalino: en SANGRE, PULMÓN, para investigar CN en casos de incendio En erlenmeyer colocar como mínimo 5ml de sangre, diluir con 10 ml de aguadestilada (10gr de pulmón molido con 10 a 15ml de agua (d)) y agregar ClH 20% hasta pHácido, colocar a. Papel alcalino (tira de papel de filtro embebida en hidróxido de sodio al 20%) en la boca del frasco sin que toque la muestra y cerrar herméticamente. Dejar en BM a 70ºC 60 minutos. Retirar el papel y sobre él realizar la reacción de Azul de Prusia. b. Papel de Ácido pícrico (tira embebida en sol saturada de ácido pícrico), formación de furfural (reacción más sensible pero menos específica) de color rojo. II. CUANTIFICACION:1) METODO VOLUMETRICO DE DENIGES IAg + 2 CN- [Ag(CN)2] + I-2ml del destilado o de cámara de Conway en medio amoniacal (NH3, 6N) + IK , se titulacon NO3Ag 0,1 N hasta turbidez amarilla de IAg ( se basa en la acción disolvente delanión cianógeno sobre el IAg coloidal, mientras haya CN- se forma el complejoARGENTICIANOGENO soluble, cuando se acaba el CN- se forma la turbidez del IAg) 1ml de nitrato de plata = 0,0054gr. de CNH5. TOLUENO I. REACCIÓN DE ORIENTACIÓN1) REACCION DE LA ROSEN Para ORINA o SANGRECon Reactivo de MarquísSe debe realizar en medio anhidro.En cámara de Conway: 2ml de muestra en compartimento externo y 2ml de tetracloruro decarbono en el interno se agita suavemente, se espera durante 2 horas. Se retira eltetracloruro se coloca en tubo y se realiza la reacción con el reactivo de Marquís.Rvo de Marquís: sol de formol al 10% en SO4H2 (c), preparar en recipiente con hielo enel momento de usar.2ml del tetracloruro de carbono + 2 ó 3gtts. de Rvo. de MarquísBioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 10. 10 II. CUANTIFICACIÓN 1) METABOLITO: Ácido hipúrico. Ver BENCENO 6. CLORADOS I. REACCIÓN DE ORIENTACIÓN 1) Test de Fujiwara para clorados: para ORINA O SANGRE DESPROTEINIZADA. Para tricloro compuestos (hidrato de cloral, cloroformo, tricloroetileno, dicloralfenazona)Esta reacción se realiza con blanco y testigo de ácido tricloroacético a. En tres tubos agregar respectivamente (i) 0.5ml de muestra (ii) 0.5ml de agua (muy importante hacerlo!! (iii) 0.5ml de ácido tricloroacético (10mg/l) b. Agregar A CADA TUBO 1ml de Na(OH) (5molar) + 1ml de piridina c. Agitar suavemente y colocar en BM hirviente por 2 minutos. POSITIVO: color rojo/púrpura en la capa piridínica (superior) de los tubos a y c, el blanco b no debe cambiar de color. 7. BENCENO I. CUANTIFICACIÓN1) Investigación de Acido HIPÚRICO en ORINA. Reactivos a. Ácido clorhídrico (0.05mol/l). b. Rvo. Dimetilaminobenzaldehido: p-Dimetilaminobenzaldehido (40 g/l) en anhídrido acético que contiene algunos cristales (cerca de 0.5g) de acetato anhidro del sodio. c. Cloruro de sodio (sólido). d. Silicona precipitada. e. Estándares (i) Orina como blanco (ii) Orina a la cual se ha agregado ácido hipúrico en las siguientes concentraciones 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 g/l. Todas las muestras se deben preparar a partir de un espécimen de la orina. Estas soluciones son estables para 1 mes si están almacenadas en 4°C en la oscuridad. Método a. Ajustar el pH de 1.0ml de muestra o del estándar a 2 con el ácido clorhídrico 0.05mol/l, y agregar el cloruro de sodio hasta saturación. Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 11. 11 b. Agregar 2ml de éter dietilico: metanol (9: 1), se agita en vortex 1 minuto y luego se centrifuga por 5 minutos. c. Pasar la capa etérea a un tubo limpio y re extraer la fase acuosa con 2ml más de éter dietílico: metanol (9: 1). d. Combinar los extractos etéreos y agregar 1ml a 0.5 g de la silicona precipitada en un tubo limpio. e. Dejar evaporar el solvente debajo de una corriente del aire o del nitrógeno comprimido. f. Agregar 3ml de reactivo de dimetilaminobenzaldeido, y calentar en un bloque de la calefacción a 135°C por 5 minutos. g. Enfriar, agregar 4ml de metanol, agitar con vortex 1 minuto y centrifugar por 5 minutos. h. Recuperar el extracto metanólico y pasar a un tubo limpio y re extraer la silicona con 4ml más de metanol. i. Combinar los extractos metanólicos y medir la absorbencia en 460 nanómetro contra el extracto en blanco de la orina. Resultados Preparar un gráfico de calibración con las lecturas de las soluciones de ácido hipúrico estándares y calcular la concentración ácido hipúrico en la muestra. Es importante utilizar una porción de la misma orina para preparar los estándares y el blanco, puesto que la excreción del hipurato varía con el consumo de productos que utilicen benzoato, según lo indicado arriba. Sensibilidad Hipurato, 0.1 g/l.8. NITRO DERIVADOS, Determinación de METAHEMOGLOBINA I. REACCIÓN DE ORIENTACIÓN1) Reacción de DILUCIÓN Con niveles importantes se ve sangre color chocolate que no cambia a rojo – rosa incluso luego de 10 minutos de contacto con el aire.2) Con CIANURO DE POTASIO El cambio inmediato del color chocolate de una dilución 1/100 de sangre por el agregado de un cristal de cianuro de potasio es un indicio de metahemoglobinemia. II. CUANTIFICACIÓN1) Método ESPECTROFOTOMÉTRICO Los métodos de cuantificación se basan en que lla hemoglobina presenta un máximo de absorción a 522nm y la metahemoglobina a 578nm. Se realizan lecturas a ambas longitudes de onda de un hemolizado desconocido y un control al que se le agrega ferricianuro de potasio para llevar toda la hemoglobina a metahemoglobina.Materiales a. Sangre heparinizada (5ml) del paciente y normal para control b. Solución fisiológicaBioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 12. 12 c. Buffer fosfato 0.01 M pH 6.5 d. Tubos de hemólisis e. Ferricianuro de potasio (en cristales)TécnicaLavar los hematíes (paciente y control) 3 veces con solución fisiológica.Suspender 20µl de hematíes lavados en 3ml de buffer fosfatoAgitar vigorosamente y luego de 5 minutos colocar 10 minutos en heladera 10 minutos.Retirar y centrifugar 10 minutos a 3000rpmSeparar 1ml del sobrenadante y diluir con 2ml de buffer fosfatoLeer absorbancia de ambos hemolizados (paciente y control) a 522 y 578 usando comoblanco el bufferAñadir al hemolizado control 1 – 2 microcristales de ferricianuro de potasio y leer a 522 y578nm. Esta lectura corresponde al 100 % de metahemoglobinaTanto para la muestra del paciente como la del control (antes y después de añadirferricianuro de potasio) calcular la relación A578/A522.Interpretación de los resultados1. El valor R correspondiente al control sin ferricianuro de potasio se le asigna un valorde metahemoglobina 0 % y se representa en el eje de las ordenadas (Y) de una hoja depapel milimetrado. El valor R del control con ferricianuro se representa en el eje de lasabscisas (X) asignándole un valor de 100 % de metahemoglobina. Se traza una recta queuna ambos puntos.2. Si el R de la muestra es igual o superior al control sin agregado de ferricianurosignifica que la muestra carece de metahemoglobina3. Si el R de la muestra es inferior se calcula el % de metahemoglobina de la muestratrazando una paralela al eje de abscisas desde el valor situado en el eje de ordenadas hastala recta patrón y de ahí una perpendicular al eje de abscisas que dará el resultado.2) PARAAMINOFENOL: metabolito. Determinación de paraaminofenol en orina Se utiliza ácido tricloroacético para precipitar las proteínas y se determina la cantidad de paraaminofenol en una alícuota de sobrenadante mediante el agregado de fenol para formar el complejo fenol-indofenol de color azul que se mide espectrofotométricamente a 640nm. B. TÓXICOS METÁLICOSEXTRACCIÓN Y REACCION DE ORIENTACIÓN GENERAL Ensayo de Reinsch:para arsénico, antimonio, bismuto y mercurio Esta técnica fundamentada en la electrólisis, proporciona un método de rápidadetección y separación, para posterior identificación y determinación de los elementos:arsénico, antimonio, bismuto y mercurio, con una sensibilidad del orden de los 10µg.Pueden interferir: selenio, teluro y azufre, por lo que insistimos solo debe aprovecharsepara la SEPARACIÓN , debiendo realizarse después ensayos específicos deidentificación.Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 13. 13 Este método es importante porque • Permite revelar pequeñas cantidades de los tóxicos más comunes e importantes en toxicología. • Puede ser aplicable a materia orgánica como vísceras, pero también a orina, contenido gástrico, vómitos, bebidas, alimentos, etc., ANTES de realizar la destrucción de los mismos y así orientar las operaciones analíticas a seguir.TÉCNICA: a. el material se desmenuza si es sólido, y se coloca en erlenmeyer, se agrega ClH al 10% (V/V) en cantidad suficiente. b. Se incorpora en el recipiente, una laminilla de cobre electrolítico de 1cm2, o un alambre grueso de cobre de 2 – 3mm de diámetro y 150m de longitud que se enrolla sobre un lápiz para obtener una espiral, que se ha tratado previamente con ácido nítrico 2N puro hasta que quede limpio y brillante, para eliminar impurezas y óxidos superficiales, se enjuaga con agua destilada, se pasa por alcohol para desgrasar y se seca con toalla de papel. c. Se cuelga la laminilla o la espiral desde la boca del material de vidrio y se coloca a BM hirviente una hora, se saca la laminilla y se observa si ha sufrido alguna modificación en su color y aspecto. d. El depósito obtenido se disuelve en ácido nítrico y se somete la dilución a análisis de cationes. e. Existen también reacciones que se realizan directamente con la lámina o el espiral de cobre que son rápidas pero menos seguras como es el ensayo de Gutzeit para arsénico.RESULTADO: a. Si el cobre mantiene su brillo y color primitivo puede deducirse que no hay tóxicos, o los hay en tan pequeña proporción que no puede revelarse con esta técnica. No obstante aunque no se observe a simple vista se puede seguir con la investigación analítica, hay tóxicos como el As, puede no verse nada e igual presentarse rastros. b. Si el cobre toma aspecto plateado, se debe a mercurio; si la coloración es negra puede deberse a: arsénico, antimonio, bismuto, selenio, teluro o azufre (que puede proceder de la descomposición de la materia orgánica). Por diferencia de pesadas podríamos tener el resultado cuantitativo (electro gravimetría).1. ARSÉNICO I. REACCIONES DE ORIENTACIÓN1) Reacción de Bougault: Se puede realizar disolviendo una parte de las cenizas obtenidas en la mineralización con destrucción orgánica por vía seca, con ClH puro y filtrar por algodón de vidrio.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 14. 14REACTIVO Hipofosfito de Na 10gr Agua destilada 10ml ClH puro 100mlLa reacción se basa en la acción fuertemente reductora del ácido hipofosforoso en medioclorhídrico que separa As°, se visualiza como precipitado negro.2) Reacción de Bettendorf: es una reacción semejante a la anterior pero usa como reductor el Cl2Sn en medio clorhídrico.REACTIVO: se debe preparar en el momento de usar. Cl2Sn 10gr ClH puro 100ml II. REACCIONES DE CERTEZA1) Método de GutzeitSe puede realizar en la laminilla usada para la reacción de Reinsch o en la soluciónproveniente de la mineralización sulfo- nitro – perclórica. FORMACIÓN DEARSENAMINA.Reactivos: - ClH purísimo - Cl2Sn al 40 % en ClH al 60 % en vol. - Zn puro - NO3Ag puro - Papel impregnado y seco en sol. Alcohólica de Cl – o Br- mercúrico al 5% cortar en franjas para adaptar al tubo C C B: algodón impregnado de acetato de Pb A: ErlenmeyerProcedimiento: en el erlenmeyer A colocar 25 ml de agua destilada y 10 – 12 ml de ClH,incorporar 0.5 ml de Cl2Sn y mezclar bien; agregar 10 a 12 granallas de Zn° y adaptar lacolumna de vidrio B que contiene algodón impregnado en acetato de Pb. Cubrir la aberturasuperior del tubo B con un trozo de papel de filtro sobre el que se colocan unos cristales denitrato de Ag ° y dejar desprender H durante 5 minutos como mínimo; los cristales nodeben presentar color amarillo ( ensayo blanco)Introducir rápidamente la laminilla de Cu y después de unos minutos se observará, deexistir As que el nitrato de Ag adquiere color amarillo que se intensifica progresivamentehasta hacerse amarillo canario. Retirar el papel con los cristales y adaptar rápidamente eltubito que contiene el papel de Br 2 Hg para captar la arsenamina restante y disponer así deMarcha Toxicológica de Urgencia
  • 15. 15otro ensayo de identificación. Depositar 1 gota de agua sobre los cristales y se observará deinmediato que el color amarillo desaparece y se hace negro (Agº)Interpretación del proceso de separación del As mediante el ensayo de Reinsh y suidentificación con la técnica de Gutzeit.El elemento de As puede hallarse en el material parcialmente disuelto como Ac arsenioso oen fina suspensión como trióxido. As2O3 + 3 H2O ⇔ 2 As O3H2 - + 2 H+Depósito sobre Cu 2AsO3H2- + 6 Cu ° + 8 H+ → As2 Cu3 + 6 H2O + 3 C u++ As2O3 + 6 Cu ° + 6 H+→ As2 Cu3 + 3 H2O + 3 C u++Al introducir la laminilla con el depósito de arseniuro en el dispositivo de Gutzeit sedesprende AsH3 que es arrastrada mecánicamente por el H, e incide sobre el nitrato de Ag. As2 Cu3 +6 H +→ 2 As H3 + 3 Cu+ 2 H+ + Zn °→ Zn++ + H2 AsH3 + 6 NO3Ag → As Ag3. 3 NO3Ag (amarillo) + 3 NO3- + 3 H+El complejo amarillo se descompone por hidrólisis y aparece color negro (óxido –reducción interna)As Ag3. 3 NO3Ag (amarillo) + 3 H2O→ AsO3H2- + 3 NO3- + 3 H+ + 6 Ag2. TALIO I. REACCIONES DE ORIENTACIÓN1) TECNICA DE KOVARIN-MOUCKAPuede realizarse en forma directa (orina) o sobre el producto de la mineralización.A 2 ml de la solución acuosa – sulfúrica del mineralizado obtenido por vía húmeda, o bien,a 2ml de orina, agregar 2 gotas de ClH puro y 5 gotas de agua de Br a saturación. Agitarbien y dejar reposar durante 2 minutos. Reducir el exceso de Br por agregado de 5 gotasde solución acuosa de ácido sulfosalicílico al 20 % agitando enérgicamente después delagregado de cada gota (no debe percibirse olor a Br). Agregar 2 – 3 ml de benceno y luego2 gotas de violeta de metilo en solución acuosa al 0.2 %. Agitar enérgicamente y dejarseparar: en presencia de Tl la capa bencénica superior adquiere color azul – violeta avioleta de intensidad variable. Es importante ensayar el benceno (blanco) usando unasolución acuosa – sulfúrica al 10 % en volumen. LA capa inferior acuosa adquiere colorverde o amarillo de acuerdo con la acidez del medio, ya que el colorante se comporta comoun indicador.Ensayo negativo: capa orgánica superior incolora, mientras el colorante queda en la faseinferir o acuosa.Ensayo positivo:El Tl es oxidado por el Br: Tl+ + Br2 → Tl+3 + 2 Br-El Tl oxidado se compleja con el Cl – (agregado en forma de ClH)Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 16. 16 Tl +3 + 4 Cl- → Cl4Tl-El ácido sulfosalicílico reduce el exceso de Br. HO. O C – C6 H3 . OH – SO3 H + 2 Br2 → HO. O C – C6 H Br2 . OH – SO3 H + 2BrHEl complejo (Cl4Tl-) origina el derivado que sigue, con el violeta de metilo, de color azul aazul – violeta.El violeta de metilo es una mezcla de los clorhidratos tetra, penta y hexametil p –rosanilina. Algunos autores recomiendan usar el violeta cristal como colorante, ya que esun compuesto puro (clorhidrato de exametilrosanilina). Este ensayo puede realizarse conotros colorantes derivados del trifenilmetano como el verde brillante y verde malaquita. Seha visto que en las condiciones de mineralización el Au interfiere notoriamente, no así loselementos normales y otros que pueden estar presentes.2) ENSAYO MICROCRISTALOSCÓPICO DE FAZIO Se puede realizar sobre mineralización previa o sobre orina directa.Técnica:Llevar 1 gota de solución mineralizada a portaobjetos y evaporar a sequedad a bajatemperatura, repetir el agregado si fuera necesario y al residuo obtenido se le incorpora 1gota de solución acuosa de tiosulfato da Na al 25 %, agitar con fina varilla de vidrio. Sinretirar la varilla hacer deslizar por la misma una gota de etanol de 96° que al difundirseprovoca la aparición de un precipitado microcristalino en forma de finas agujas (tiosulfatode Tl, insoluble en etanol de 50 ° o de mayor graduación; efecto salino asociado imputableal exceso de reactivo).Los cristales son aciculares, birrefringentes, incoloros, aislados o en haces. II. CUANTIFICACIÓN1) METODO DE LA DITIZONA: Aplicable a la orina. Reactivo a. Reactivo del cianuro. Disolver 1.6 g de hidróxido del sodio, 1.2 g de tartrato de sodio de potasio y 1.36g de cianuro del potasio en 10 ml de agua. b. Solución del Ditizona (250mg/l) en el cloroformo (recién preparado) Estándares a. Orina como blanco. b. Orina a la cual se ha agregado una solución del acetato del talio en el agua purificada (1.0-g/l) para dar concentraciones de ion talio de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0mg/l. Método a. Agregar 1 ml de reactivo de cianuro a 5 ml de muestra o al estándar en un tubo de vidrio de 10ml tapado agitar en vortex por 10 segundos.Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 17. 17 b. Agregar 2 ml de solución del ditizona, agitar con vortex por 1 minuto, y centrifugarlos por 5 minutos. c. Desechar la capa superior, acuosa y filtrar el extracto del cloroformo a través del papel de filtro en tubo limpio. d. Medir la absorbencia del extracto en 480 nanómetro contra un extracto en blanco de la orina. Resultados Un color rosado/rojo en la capa más baja del cloroformo indica la presencia del talio en las concentraciones de 1mg/l o más. Construir un gráfico de la calibración de absorbancia contra la concentración del talio en los estándares y medir la concentración del talio en la muestra. Un número de iones del metal pueden interferir en este análisis. El espectrofotómetro de absorción atómica es necesario para medir el talio definitivo. Sensibilidad Talio, 0.1mg/l. Interpretación clínica La intoxicación aguda con las sales de talio puede conducir a la estasis gastrointestinal, mientras que la intermedia y los últimos efectos pueden incluir disturbios de los sistemas nerviosos periféricos y centrales, del sistema cardiorrespiratorio, de ojos y de la piel. El cuero cabelludo y la pérdida facial del pelo es una muestra típica del envenenamiento del talio. Los pacientes con concentraciones urinarias de talio que exceden 0.5mg/l deben ser tratados con potasio ferrohexacyanoferrate (azul prusiano; ver la tabla 6) hasta que la excreción urinaria del talio está debajo de 0.5mg/día. C. TÓXICOS ORGÁNICOS FIJOS I. REACCIONES DE ORIENTACIÓNTodas estas reacciones son en ORINA SIN EXTRACCIÓN PREVIA1) ANALGÉSICOS a. ACETAMINOFENO (PARACETAMOL) directo en ORINA.Hacer orina normal en paralelo. (i) 1ml de orina problema + 3gtts. ClH concentrado colocar en BM a ebullición 10 minutos y enfriar. (ii) 200µl del hidrolizado del paso anterior + 1ml H2O (iii) Agregar 0.5ml de O-Cresol (al 5% en agua) + 1gtt. Na(OH) al 10%; agitarRESULTADO: POSITIVO (sobredosis): azul NEGATIVO: celeste.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 18. 18 b. SALICILATOS (i) Reacción Cualitativa directo en ORINA1/2ml de orina + Cl3Fe al 5% en H2O se agrega gota a gota agitarRESULTADO: POSITIVO para compuestos fenólicos cuando da violeta fugaz alagregado de cada gtt. (Novalgina da negativo). (ii) Reacción Cuantitativa: se realiza en ORINA, SUERO O PLASMA. MÉTODO DE TRINDER: precipita las proteínas con HgCl2 y ClH y dosa el color que aparece cuando el salicilato es acomplejado por el ión Fe3+ como nitrato férrico.Reactivo de Trinder:Disolver 40gr de cloruro mercúrico en 840 ml de agua destilada por calentamientoadecuado; enfriar y luego agregar 120 ml. de ácido clorhídrico 1N; incorporar 40 gr. denitrato férrico cristalizado y después de su disolución llevar a 1 litro.Solución Stock de Salicilato de Sodio :100 mg, de ión Salicilato por 100 mlDisolver 580 mg. de la sal en agua destilada y se completa luego a 500 ml. Conservar porel agregado de unas gotas de cloroformo y mantener a 4ªC.Soluciones testigos de ión Salicilato: 25, 50, y 75 mg. por 100 ml• T25 : Tomar 25 ml de la solución Stock y llevar a 100 ml con agua destilada• T50 : Tomar 50 ml de la solución Stock y llevar a 100 ml con agua destilada• T75 : Tomar 75 ml de la solución Stock y llevar a 100 ml con agua destiladaEstas soluciones se conservan de la misma manera que la solución Stock.TÉCNICA En 5 tubos de centrífuga colocar respectivamente 0.5 ml de agua destilada, T25,T50, T75 y sangre. Agregar 5 ml de reactivo de Trinder. Mezclar por agitación ycentrifugar para separar el precipitado en el tubo de sangre.Determinar la densidad óptica a 540nm. Llevar a cero con blanco de reactivos.Con los valores obtenidos construir el gráfico de calibración. Por interpolación se obtieneel valor de la salicilemia.Otra forma de determinarlo es directamente con los testigos más próximos al valor delproblema, sacando un factor.FACTOR APROXIMADO = 116INTERPRETACIÓN Por este método se consideran valores dentro de los nivelesterapéuticos concentraciones de salicilatos de hasta 25mg/ 100 mlMarcha Toxicológica de Urgencia
  • 19. 19 Concentraciones : entre 30 y 50mg % se considera salicilismo suave de 50 a 80mg % intoxicación moderada más de 80mg % intoxicación severa. Existe una susceptibilidad individual que sitúa la dosis mortal de los salicilatos entre 3 y 10 gr. dependiendo lógicamente de la edad. La salicilemia suele alcanzar un valor crítico en sangre con 30mg % pero es necesario extrapolar esta cifra en el momento de la ingestión, pues a medida que pasa el tiempo hay una curva exponencial que disminuye la salicilemia en un 50 % durante las 24 primeras horas. Quiere decir que 30mg % de Salicilato a la hora de ingerido, tendrá un mejor pronóstico que la misma cantidad 4 horas después. 1. ANTISICÓTICOS y ANTIDEPRESIVOS TricíclicosANTISICÓTICOS (Clorpromazina, Fluoperazina), y ANTIDEPRESIVOS Tricíclicos (Triptilina,Nortriptilina, Amitriptilina). 1) Se realiza con Reactivo De FORREST: • Solución acuosa de Bicromato de potasio (2g/l): 25ml. • Solución de ácido sulfúrico en agua (300ml/l): 25ml. • Solución de ácido perclórico acuosa (200g/Kg.): 25ml. • Solución acuosa de ácido nítrico (500ml/l): 25ml TÉCNICA: Muestra de orina 0.5ml + 1ml de reactivo de Forrest agitar unos segundos. RESULTADOS: POSITIVO: De color amarillo verdoso que pasa a VERDE OSCURO O AZUL 2. HERBICIDAS (Paraquat y Dicuat) en ORINA, o en líquidos que envíen al laboratorio. 1) Reactivo: Ditionito alcalino, preparación en el momento, siempre usar un testigo. • Solución acuosa de NH4 (OH) (2mol/l) 0.5ml • Ditionito sódico al 1% en la solución alcalina de amonio. TÉCNICA: 1ml de orina + 1ml de reactivo de DITIONITO ALCALINO agitar RESULTADOS: PARAQUAT POSITIVO: color azul celeste, azul oscuro. DIQUAT POSITIVO: amarillo verdoso, es insignificante al lado del positivo de paraquat. Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 20. 20 3. Compuestos NITROGENADOS en general y ALCALOIDES 1) Test de Marquis El reactivo de Marquis se prepara mezclando 1 volumen de formol con 9 volúmenesde sulfúrico concentrado y un gran número de compuestos reaccionan con él para dar unaescala de colores que prácticamente cubren el espectro.Se trabaja en tubo o placa de toque.Resultados: • rojo: fenilefrina, tranilcipromina • naranja: adrenalina, anfetamina, tetraciclina • amarillo: clordiazepóxido (librium), lorazepam, colchicina • azul: clofibrato • violeta: codeína, morfina, nalorfina, promazina • marrón: doxepina, ergotamina, LSD, naproxeno 2) Con Reactivo de Mayer (solución de yodomercuriato de potasio): Reacción de precipitación, se realiza en placa de toque.Reactivo: Cloruro mercúrico 1.35g. Yoduro de potasio 4.98g. Agua destilada csp 100mlEn placa de toque_________Una pizca de polvo más dos ó tres gotas de reactivoResultado: hacer testigos de cada uno. 3) Con Reactivo de Dragendorff (solución de yodobismutato de potasio):En placa de toque_________Una pizca de polvo más dos ó tres gotas de reactivoResultado: hacer testigos de cada uno. 4) Con solución saturada de ácido pícrico:En portaobjeto_________Una pizca de polvo más dos ó tres gotas de reactivoResultado: hacer testigos de cada uno. Cristales característicos. 6. METABOLITOS URINARIOS de DROGAS DIVERSAS Muestra biológica usada: ORINA. Se investigan generalmente los METABOLITOS de drogas de abuso:cocaína, marihuana, opioides, metadona, anfetaminas, benzodiazepinas, barbitúricos, etc.Los métodos más usados son: enzimoinmunoanálisis, inmunoensayo de polarizaciónfluorescente (FPIA). Son excelentes métodos, muy rápidos, que no requieren extracción niningún tratamiento previo, ideal para los ingresos en las guardias de hospitales y se quieredescartar intoxicación por drogas.Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 21. 21 1) INMUNOENSAYO DE POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FPIA): existen diferentes aparatos comerciales, nosotros tenemos el TDX de Laboratorio ABBOT, es excelente y permite dosar semicuantitativamente drogas de abuso (las habituales como cocaína, marihuana, opioides, anfetaminas y también psicofármacos como benzodiazepinas y barbitúricos) en ORINA.También permite el seguimiento de tratamientos con los psicofármacos nombrados y otroscomo carbamazepina, antidepresivos tricíclicos, etc TODOS éstos en SUERO. 2) ENZIMOINMUNOANÁLISIS: el más conocido en nuestro medio es el TRIAGE, pero hay muchas marcas, además vienen para múltiples drogas, o para investigar una sola, eso se maneja según las necesidades de cada laboratorio. Son cajitas o tiritas semejantes a las que se usan para los tests de embarazo. 7. DROGAS DIVERSASCROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Esta técnica, cuando no tenemos otro métodos con tecnología de última generaciónpara realizar exámenes de certeza, se puede transformar en tal cuando realizamos unacorrida general para ácidos ó básicos tipo screening primero y luego una corridaespecífica para cada sustancia, SIEMPRE con TESTIGOS, y si se puede en dos solventesdiferentes para tener dos rf cada uno con su testigo. 1) EXTRACTO ÁCIDO a. DROGAS: barbitúricos, aspirina.MUESTRA: Llevar la orina, el contenido gástrico, el suero o el material a estudiar a pHácido con ácido tartárico solución saturada, centrifugar, colocar 3ml en columna extrelutrotulada, una vez absorbida esperar 15 minutos y eluir con éter etílico, éter de petróleo(50:50), llevar a sequedad y retomar con 100µl de etanol. Siembra aspirinaSOLVENTE DE CORRIDA: cloroformo - acetona (4:1)REVELADORES: Para aspirina: Cl3Fe al 5%. Para barbitúricos: El más sencillo sol. acuosa de MnO4K2. Secuencial: Acetato de cobalto en metanol una pizca. Siembra barbitúricos Li(OH) en metanol. A estufa: barbitúricos: color violeta.Bioq. Raquel Fernández de Cattaneo
  • 22. 22b. PESTICIDAS1) Reacción de orientación:EN SUERO: REACCIÓN DE PSEUDOCOLINESTERASA, con kits comerciales.EN GLÓBULOS ROJOS: COLINESTERASA ERITROCITARIA2) Reacciones de certeza: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.Se debe realizar un EXTRACTO ÁCIDO, los fosforados y clorados se recuperan enextracto neutro, pero se extraen perfectos en medio ácido junto a los carbamatos. .MUESTRA: orina, contenido gástrico, o cualquier líquido que llegue al laboratorio.Llevar la muestra a pH ácido con ácido tartárico solución saturada, centrifugar, colocar3ml en columna extrelut rotulada, una vez absorbida esperar 15 minutos y eluir con éteretílico, éter de petróleo (50:50), llevar a sequedad y se retoma con acetona 100µl.En el caso de sangre y bilis cuando se agrega el ácido se hace una pasta por lo que primerodebe agregarse agua a una cantidad de muestra medida, llevar a 15ml para usar una de lasextrelut grandes y recién dar el pH, luego centrifugar y usar el sobrenadante para colocaren la columna de 15 ml, rotulada, esperar 15 minutos y eluir con éter etílico, éter depetróleo (50:50), llevar a sequedad y se retoma con acetona 100µl. SOLVENTE DE CORRIDA (Fase Móvil): solvente cuádruple hexano – ciclohexano – cloroformo – acetona (40:40:10:10) REVELADORES: secuencial Observar con luz UV. Solución de Cl de Pd al 5% en ClH al . (fosforados amarillos) Na(OH) al 10%: fosforados amarillos y marrones. Este paso ES OBLIGATORIO. Para nitro benceno/tetra/fluoroborato una pizca en etanol – dietilénglicol (9:1). Carbamatos, violetas o azules. 2) EXTRACTO ALCALINOPara benzodiazepinas, cocaína, marihuana, anfetaminas, antidepresivos, antisicóticosy cualquier droga alcalina., también ESTRICNINA. TRABAJAR CON TESTIGOS.MUESTRAS: orina, contenido gástrico (tener en cuenta que es lo NO absorbido),sangre, líquido pericárdico, soluciones del lugar del hecho, etc. Los comprimidos y polvos (ej: “ravioles”) no hace falta llevar el pH a alcalino, se pulverizan, se disuelven en un poco de acetona y se siembran.Llevar a pH 10 u 11 con NH4(OH), centrifugar, colocar 3ml en columna extrelut rotulada,una vez absorbida esperar 15 minutos y eluir con cloroformo. Llevar a sequedad y retomarcon 100µl de acetona.SOLVENTE DE CORRIDA (Fase Móvil): metanol – amoníaco (100+1.5).REVELADORES: secuencial1- Observación con UV: se observa con UV. Las benzodiazepinas se ven celestes fluorescentes en la parte superior de la placa, van casi con el solvente de corrida.Marcha Toxicológica de Urgencia
  • 23. 232- Acidificar con ClH: Secar la placa y observar al UV. Si se corrió con METANOL-AMONÍACO se acidifica rociando con ClH al 10%.3- Con NQS (Nafto Quinón Sulfonato de Sodio): se prepara con un poquito de droga y agua.4- Con IODOPLATINATO: Solución 1: iodoplatinato 1gr Agua 20ml Solución 2: yoduro de potasio 18gr Agua csp 180ml Se mezclan las soluciones 1 y 2, agregar 400ml de agua destilada y guardar en frasco color caramelo.5- Con CLORURO FÉRRICO:6- Con reactivo de DRAGENDORFF:Suspender 5gr de oxicarbonato de bismuto en 50ml de agua destiladaAgregar 10ml de ClH concentradoLuego 25gr de yoduro de potasioBioq. Raquel Fernández de Cattaneo