Practica 1 crecimiento levaduras

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Practica 1 crecimiento levaduras

  1. 1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS BIOTECNOLOGÍA PRACTICA 1. COMPARACION DE LA RESPIRACIÓN Y LA FERMENTACIÓNOBJETIVO. El alumno analizará y distinguirá el comportamiento de una levaduracuando su metabolismo se desarrolla bajo condiciones aerobias y bajo condicionesanaerobias, relacionando los resultados de la producción de biomasa con la eficiencia encada proceso.INTRODUCCION. Las levaduras son microorganismos eucariotes ubicuos encontrados en diversosambientes naturales. Esta capacidad de colonización está relacionada con su altaadaptabilidad fisiológica. Las rutas metabólicas entre diferentes especies de levaduras sonbásicamente idénticas, sugiriendo la conformación de un grupo metabólicamentehomogéneo. Sin embargo, los mecanismos para la toma de nutrientes, el número dediferentes isoenzimas, y sobretodo la regulación de fermentación y respiración difierensustancialmente. En las levaduras, como otros organismos heterotróficos, el metabolismo de laenergía y el carbono están íntimamente interconectados, es decir, el anabolismo estáacoplado al catabolismo. El ATP provee la energía para toda clase de trabajo celular y esprovisto por la oxidación de moléculas orgánicas que también sirven como fuente decarbono para la biosíntesis. En la naturaleza, las diferentes especies de levaduras utilizanun espectro de fuentes de carbono, tales como polioles, alcoholes, ácidos orgánicos,aminoácidos, pero prefieren los carbohidratos. Enfocando la atención sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae, es unmicroorganismo facultativo que emplea la respiración aerobia al igual que lafermentación alcohólica para metabolizar la glucosa como fuente de energía y decarbono. La glucosa inicialmente es transformada a través de la glicólisis hasta laformación de piruvato, el cual es un punto de ramificación del flujo metabólico,dependiendo de la presencia o no de oxígeno. En la presente práctica, se tiene como objetivo que el alumno determina lacantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y formaciónevidente de metabolitos bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, para establecer ladiferencia del crecimiento de la levadura.MATERIAL.Medio de extracto de maltaGlucosaAgua destiladaLevadura secaSolución de azul de metileno 0.01%Solución de DNS
  2. 2. Microscopio de campo claroMicroscopio de contraste de fasesHematocitómetroPipeta PasteurTubos de vidrioEtanolBaño maríaTermómetroMETODOLOGIA.Medio de cultivo.1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta3.- Preparación del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g deglucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada.4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor.Suspensión de levadura.1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo deensaye, mezclar hasta obtener una suspensión uniforme.2.- Realizar conteo en cámara de Neubauer3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el número de células por mL.Incubación.1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensión de levaduras, etiquetecomo fermentación y coloque en una incubadora a 30ºC.2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensión de levaduras, etiquete comorespiración y coloque en una agitadora a 30ºC y 200 rpm.3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz yguárdelos en refrigeración.4.- Determine el número de levaduras para cada muestra.5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra.Conteo de levaduras.A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno yhomogenizar. De la solución homogénea, colocar una alícuota en el hematocitómetro yrealice el conteo al microscopio. En el apéndice 1 encontrará información acerca del usodel hematocitómetro o de la cámara de Neubauer.1. Verifique que el microscopio está alineado, y en su caso haga la corrección necesaria.2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz.3. Realice el cálculo del número de células/mL.
  3. 3. Determinación de glucosa.La determinación de glucosa se realiza utilizando el método del DNS (apéndice 2).1) Diluir la muestra, calculando que la concentración de glucosa se encuentre en el rangode 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilución.2) Tomar un alícuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso3) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con elblanco.7) Interpolar lectura en la curva patrón para determinar la concentración de glucosa.CUESTIONARIO1.- ¿Cuál es el papel del azul de metileno en la tinción de levaduras?2.- ¿Qué es fermentación desde el punto de vista bioquímico?3.- ¿Cuántas y cuáles son formas de reproducción tiene Saccharomyces cerevisiae?4.- Explique cómo se coloca la muestra para el conteo en la cámara de Neubauer5.- ¿Qué es respiración celular?6.- ¿Dónde se obtiene mayor biomasa, en la respiración o en la fermentación? Expliquepor qué7.- La técnica del DNS es útil para cuantificar sacarosa, por qué8.- ¿Qué es la glucólisis?9.- ¿Qué es el catabolismo?10.- Durante los experimentos que desarrolló, Saccharomyces cerevisiae realizóanabolismo, explique.REPORTE.Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la práctica, objetivo, introducciónbreve, metodología, resultados, discusión, conclusión, bibliografía. Como guía puedeutilizar el formato de cualquier artículo científico.
  4. 4. APENDICE 1. CUANTIFICACION DE LEVADURASOBJETIVO. El alumno cuantificará levaduras mediante la técnica de conteo directo almicroscopio.CONTEO EN CÁMARA DE NEUBAUER. La cámara de Neubauer es una cámara de conteo que se utiliza para determinar elnúmero de células. Figura 1. Cámara de Neubauer. Para utilizar la cámara de Neubauer realice el siguiente procedimiento:• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedarcentrada.• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribuciónde las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa yaque la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro dellenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara esde líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Para el conteo: Lleve la cámara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo conel ocular de 4X. Al hacerlo observará en el campo una imagen parecida a la figura 2. Figura 2. Cámara de Neubauer en 4X• Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc.,ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguientemanera:
  5. 5. Figura 3. Cámara de Neubauer en 10X• En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las célulaspresentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central,lo que garantiza un conteo aleatorio.• Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de loscampos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar entodos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (altopoder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera: Figura 4. Cámara de Neubauer en 40X• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar elconteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que nose cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan elcuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales célulasson contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan lasegunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen.Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una Xson las que no se deben contar. Figura 5. Conteo en cámara de Neubauer.
  6. 6. • Después de contar las células se procede a calcular el número de células por unidad devolumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido enel que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámaray la laminilla de cuarzo. La cámara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y suprofundidad es de 0.1 mm. Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las células uotras partículas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Paracélulas pequeñas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm2 y el cuadro del centro.Por ejemplo, si se cuentan 187 células en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tieneun área de 1/25 mm2, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de(0.04x0.1 = 0.004) 0.004 mm3. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de0.02 mm3. Por lo tanto, se tienen 187 células en 0.02 mm3, que equivale a 9350células/mm3. Hay 1000 mm3 en 1 cm3, por lo que la cuenta es de 9 350 000 céluals/mL. Para fines prácticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente: Células/mL = Total de células contadas * 50000 Para determinar el número de células en la muestra original hay que multiplicarpor la dilución.METODOLOGIA.A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno yhomogenizar. De la solución homogénea, colocar una alícuota en la cámara de Neubauery realice el conteo al microscopio.
  7. 7. APENDICE 2. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR DNSOBJETIVO: Determinar el contenido de azúcares reductores en mosto fermentadomediante el uso del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) mediante espectroscopia visible.INTRODUCCION El método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se basa en la reducción del DNS(de color amarillo) al reaccionar con un azúcar reductor para formar ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de laabsorbancia en la zona de 540-570 nm.MATERIALES.DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)FenolSulfito de sódioHidróxido de sodioAgua destilada2 Vasos de precipitado de 600 mL1 Matraz aforado de 100 mL1 Matraz aforado de 1 LTubos de ensayeEspectrofotómetroPipetas volumétricas de 1 mLPipeta volumétrica de 2 mLPipeta volumétrica de 5 mLPROCEDIMIENTO.Preparación de la solución de DNS.1) Pesar 1 g de hidróxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matrazErlenmeyer con agitación. CUIDADO EL HIDRÓXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL.2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solución de hidróxido de sodio conagitación, para lograr una disolución rápida y completa.3) Esperar a que la solución se enfrié a temperatura ambiente4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solución anterior con agitación.5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solución anterior con agitación.6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a unmatraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solución.
  8. 8. 7) Guardar la solución en un frasco ámbar para proteger de la luz.Preparación de curva patrón.1) Preparar una solución estándar de 1 mg/mL de glucosa2) Preparar una serie de tubos con las cantidades indicadas en el cuadro siguiente: Tubo Concentración Glucosa mL de mL de Número (mg/mL) Solución agua Estándar destilada 1 0 0 1 2 0.1 0.1 0.9 3 0.2 0.2 0.8 4 0.3 0.3 0.7 5 0.4 0.4 0.6 6 0.5 0.5 0.5 7 0.6 0.6 0.4 8 0.7 0.7 0.3 9 0.8 0.8 0.2 10 0.9 0.9 0.1 11 1.0 1.0 03) Tomar una alícuota de 0.5 mL de la solución de glucosa para cada dilución4) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar5) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos6) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar7) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con elblanco.Preparación de muestras.1) Diluir la muestra si el contenido de azúcares reductores es mayor a 1 mg/mL, para quese encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilución.2) Tomar un alícuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso3) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos5) Aforar a 10 ml adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con elblanco.Cálculos1) Con las lecturas de la curva patrón hacer una regresión lineal de concentración deglucosa contra absorbancia y calcular la ecuación de regresión lineal correspondiente.2) Sustituir el valor de absorbancia de la muestra en la ecuación de regresión y calcular laconcentración de azúcares reductores expresados como glucosa. Al dato obtenidomultiplicarlo por la dilución.

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