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  • 1. UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE “L. Spallanzani” VINO SPUMANTE CRUASÈ DOCG:studio dei fenomeni di adsorbimento degli antociani da parte di lieviti vinariRelatore: Prof. Rino CellaCorrelatore: Prof. Roberto FoschinoCorrelatore: Dott.ssa Daglia Maria Tesi Sperimentale di Laurea in Scienze Biologiche di Alessandra Baldi
  • 2. Anno Accademico 2011-2012INTRODUZIONEIndagini di mercato condotte in questi ultimi anni indicano che il consumo pro-capite di vinoè in lenta ma continua diminuzione. Recenti dati pubblicati dall’Istituto Nazionale di Statistica(ISTAT) stimano che la quota della popolazione che consuma vino è leggermente diminuitanegli ultimi anni ed è soprattutto cambiato “lo stile nel bere”. Nel 2012 l’ISTAT ha riportatoche il 53,3 % della popolazione italiana beve vino e che, tra i consumatori, quelli abitualistanno leggermente calando, a favore di un consumo più sporadico. In effetti, si beve moltomeno di un tempo, e questa è la vera ragione del calo del volume consumato, inoltre ilconsumo di vino si sta spostando sempre più verso i vini di qualità (1).Il vino rosato, che un tempo era ritenuto un vino di scarsa qualità, associato ai periodi caldidell’anno e al consumo femminile, negli ultimi anni è stato giustamente riscoperto e il suoconsumo è aumentato. Oggi il vino rosato costituisce l’8,5 % della produzione mondiale divino (1). L’Europa ne produce il 73,1 % e, al suo interno, la Francia è il primo produttoremondiale con una quota del 29 %, seguita dall’Italia (21 %) e dalla Spagna (18 %). IlContinente americano concorre al volume totale del vino rosato prodotto a livello mondiale,con il 23 % della produzione totale, con il contributo maggiore da parte degli Stati Uniti (18%). Pur essendo il consumo di vino rosato inferiore rispetto a quello degli altri vini, dal 2003al 2007 il segmento dei vini rosati ha registrato un incremento dei consumi sia a livellomondiale che a livello italiano, in controtendenza rispetto ai vini rossi e bianchi (2). In Italia,nel triennio 2006-2009, il consumo di vino rosato è cresciuto del 6 % in valore e del 5 % involume. Inoltre, in base ai risultati di un’indagine condotta nel 2008 dall’Istituto di Servizi peril Mercato Agricolo (ISMEA) sugli acquisti in Italia, la ripartizione percentuale in quantità deivini DOC/DOCG per categoria era del 2,04 % per i rosati (nel 2007 era 1,80 %) contro quelladel 62,59 % dei rossi e del 35,37 % dei bianchi. I vini rosati DOC/DOCG sono acquistatimaggiormente nel Nord-Ovest mentre i rosati da tavola sono acquistati maggiormente nel Sudd’Italia. Il primato nella produzione spetta al Veneto (2.480.000 bottiglie) seguito dallaLombardia (1.267.000 bottiglie), tuttavia una lunga tradizione riguarda anche altre regioniitaliane quali la Puglia, l’Abruzzo, la Calabria, e la Campania (3).In questo contesto di crescente rilevanza del vino rosato, l’Oltrepò Pavese ha proposto il vinospumante “Cruasè”, un vino rosé naturale DOCG ottenuto da uve Pinot Nero attraverso ilmetodo classico (4). 2
  • 3. PROCESSO DI VINIFICAZIONE DEL VINO SPUMANTE ROSATOCRUASE’L’uvaggio del vino base utilizzato per la rifermentazione è ottenuto, come da disciplinare diproduzione, da un minimo di 85 % di uve Pinot Nero fino al l00 %. I grappoli d’uva, prelevatiin vigna in cassette, vengono introdotti nella pigia-diraspatrice. Il pigiato ottenuto è posto inuna pressa a polmone in cui viene immesso ghiaccio secco, per inibire gli enzimi ossidantiche possono influire negativamente sul colore. All’interno della pressa vengono aggiuntianche enzimi pectolitici di macerazione per favorire la degradazione delle pectine presentinella buccia dell’uva. Le pectine chimicamente sono polisaccaridi che svolgono unazionestrutturale allinterno della cellula vegetale. Una volta liberate durante le operazioni dipigiatura e pressatura, provocano un aumento della viscosità del mosto, rendendo leoperazioni di chiarifica difficoltose. Lobiettivo principale dellaggiunta di enzimi è pertantoquello di aumentare la velocità di degradazione delle pectine, riducendo, già dopo poche ore,la viscosità del mosto. La miscela viene lasciata macerare per tre ore nella pressa al fine diestrarre le antocianine contenute nelle bucce, azione che è anche favorita dall’utilizzo deglienzimi di macerazione e estrazione del colore, che svolgono unazione di disgregazione dellestrutture cellulari delluva interferendo nella dinamica dellestrazione stessa.L’operazione di pressatura è graduale e si arriva a un valore di 0,8 bar di pressione; ciòpermette di ottenere il mosto di prima pressatura. Il succo ottenuto è fatto decantare in vasca afreddo, al fine di ottenere l’illimpidimento del vino. All’interno della vasca viene introdottaanidride solforosa, nella dose di circa 5 g per quintale di mosto d’uva. L’aggiuntadell’anidride solforosa ha lo scopo di inibire l’azione dei lieviti e dei batteri, poiché lafermentazione nello stadio di illimpidimento non deve attuarsi. Quando il sedimento èdecantato sul fondo della vasca viene compiuta la sfecciatura, che consiste nel separare ilmosto limpido dal sedimento. Ora il mosto d’uva è pronto per la fermentazione e in tale fasein esso viene inoculato il lievito Saccharomyces bayanus, lievito del genere Saccharomyces,ampiamente utilizzato per le fermentazioni di mosti con elevato contenuto di zuccheri e per laproduzione di spumanti con metodo classico. La fermentazione avviene a una temperaturacostante di 18 °C.Il processo di produzione dello spumante con il metodo classico prevede che al vino basevenga addizionata una soluzione costituita da lieviti selezionati e zucchero di canna,comunemente definita liqueur du tirage. Successivamente a tale fase si procedeall’imbottigliamento, per cui la seconda fermentazione ha luogo nella bottiglia, all’interno 3
  • 4. della quale i lieviti consumano lo zucchero provocando la rifermentazione, detta presa dispuma, con sviluppo di anidride carbonica che forma le classiche bollicine, e genera unapressione di 5-6 atm.L’invecchiamento richiede nel caso del Cruasè almeno 24 mesi, nei quali le cellule di lievitodopo circa 120 giorni muoiono per autolisi, formando la feccia che si deposita in bottiglia. Alfine di rimuovere tali fecce, si effettua il remuage, che consiste nella messa in punta dellabottiglia per permettere alle fecce di scivolare verso il collo della bottiglia ed essere piùfacilmente eliminabili. L’operazione successiva viene definita sboccatura o degorgement, econsiste nell’immergere i colli delle bottiglie in una soluzione refrigerata a -20 °C, in modotale che la feccia si ghiacci. Ciò permette di eliminare facilmente il sedimento, divenutosolido, quando viene fatto saltare il tappo, riducendo al minimo la perdita del prodotto.SELEZIONE DEI CEPPI DI LIEVITO UTILIZZATI NELLARIFERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI VINI SPUMANTILa selezione di ceppi di lievito per la seconda fermentazione in bottiglia si basa sulle proprietàfisiologiche e tecnologiche (5) quali l’attitudine a iniziare una seconda fermentazione inambiente alcolico, la capacità fermentativa a basse temperature, la formazione di schiuma, labuona capacità di aggregazione e flocculenza, che differiscono considerevolmente da lievito alievito a seconda delle caratteristiche strutturali e della composizione chimica della paretecellulare del lievito selezionato. È stato dimostrato che i lieviti diminuiscono il contenuto dicomposti fenolici presenti nel vino in quanto le mannoproteine, componenti delle pareticellulari, assorbono i polifenoli liberi mediante interazioni deboli e reversibili (6). Ladifferente polarità e la contemporanea natura idrofobica e idrofilica delle mannoproteinedefinisce la capacità dei lieviti di adsorbire i differenti composti del vino, come le molecolevolatili o i pigmenti. Durante il processo di vinificazione, i differenti ceppi di lievito possonoavere una differente influenza sul profilo antocianico, poiché la composizione della paretecellulare varia in base al ceppo di lievito d’appartenenza e poiché le differenti antocianine, aseconda della struttura chimica possono essere assorbite in modo differente dai lieviti. È statoinfatti dimostrato che antociani con più sostituenti metossilici sono assorbiti in quantitàmaggiore rispetto a quelli con più sostituenti idrossilici. Questo dato conferma chel’adsorbimento degli antociani è causato prevalentemente da interazioni idrofobiche.In particolare, in questo lavoro di tesi sono stati considerati gli antociani, molecoleidrosolubili che conferiscono il caratteristico colore al vino. Tali composti polifenoliciappartenenti alla classe dei flavonoidi, si trovano nella buccia degli acini d’uva dove 4
  • 5. ricoprono un importante ruolo antiossidante, proteggendoli dai danni provocati dalleradiazioni solari UV. In particolare gli antociani sono in grado di reagire con gli ossidanti,quali ossigeno molecolare e specie reattive all’ossigeno (ROS), riducendo i danni che questemolecole possono provocare alle cellule e ai tessuti vegetali.Presenti sotto forma di singole molecole nelluva e nel mosto, nel corso della vinificazione edella maturazione i polifenoli tendono ad aggregarsi, assumendo una struttura polimericapoco solubile, e in parte precipitano, provocando una diminuzione del colore rosso o rosatodel vino e la comparsa di un colore più scuro tendente all’arancione/bruno (7).Nel campo enologico il fenomeno dell’adsorbimento delle antocianine da parte dei lieviti èstato recentemente proposto come criterio per la selezione dei lieviti stessi che possono essereresponsabili dell’incremento o della riduzione del colore del vino. Pertanto ceppi di lievitocon elevato potere adsorbente possono essere utilizzati nella correzione di colore dei vinibianchi. Mentre, per quanto riguarda i vini rossi, potrebbe essere possibile potenziare ilcolore, indice di qualità del vino, attuando una selezione di lieviti caratterizzati da un bassoprofilo di adsorbimento nei confronti delle antocianine (8).ANTOCIANIDINE E ANTOCIANINELe antocianine, sono flavonoidi idrosolubili che, in base al pH e, in molti casi, alla presenza diagenti complessati, possono assumere diverse colorazioni come il rosso, il viola e il blu. Peridrolisi del legame glicosidico, le antocianine liberano il corrispondente aglicone, dettoantocianidina. Esse sono ampiamente diffuse nel regno vegetale, possono trovarsi nellamaggior parte dei tessuti degli organismi vegetali superiori, incluse radici, fusti, foglie e frutti:per questo motivo possono essere considerati il gruppo più rilevante dei pigmenti naturalipresenti negli alimenti derivati dai vegetali, incluso il vino rosso.Durante la fermentazione che avviene nella produzione del vino, specialmente nel primo annodi maturazione, le antocianine monometriche coinvolte in diverse reazioni, portano alla sintesidi vari derivati antocianici di natura polimerica e quindi a nuovi pigmenti, il cui ruolo èfondamentale per la stabilità del colore.Antocianine. Nei vini rossi giovani, le antocianine, caratterizzate da una particolareinstabilità chimica, sono la componente principale responsabile del colore del vino. Durante ilperiodo d’invecchiamento del vino, gli antociani monomerici sono gradualmente incorporatiin nuovi pigmenti derivati da altri fenoli; questo processo è evidenziato dal progressivoviraggio di colore dal rosso-violaceo, caratteristico dei vini rossi giovani, al rosso-aranciatotipico dei vini rossi invecchiati. 5
  • 6. I vini rossi prodotti con uve provenienti da Vitis vinifera L., sono composti per la maggiorparte da antocianine monomeriche 3-O-monoglucoside, che comprendono: pelargonidina-3-O-glucoside, cianidina-3-O-glucoside, delfidina-3-O-glucoside, petunidina-3-O-glucoside emalvidina-3-O-glucoside. Le sei antocianine differiscono fra loro nella struttura chimica, peril numero e la posizione dei gruppi sostituenti idrossilici e metossilici dell’anello B dellamolecola. L’idrossilazione dell’anello B delle antocianine può avere un effetto diretto sullastabilità del colore, determinata dall’effetto della delocalizzazione degli elettroni all’internodella struttura della molecola. Per esempio, le antocianine con più sostituenti idrossilicisull’anello B possono contribuire allo sviluppo del colore blu, mentre una maggiormetossilazione dell’anello B favorisce il prevalere del colore rosso. (9-13).Struttura ed equilibi fra le differenti antocianine. Nei vini giovani, in cui le antocianinemonomeriche sono ancora presenti, queste risultano in equilibrio dinamico tra cinque diversestrutture molecolari, a cui corrispondono altrettante differenti colorazioni: il composto flaveneaddizionato a bisolfito (incolore), la base chinoidale (blu-violetto), il catione flavilio (rosso-arancio), l’emichetale, detto carbinolo pseudobase (incolore), e il calcone nelle forme cis- etrans- (di colore giallo tenue).La forma corrispondente al catione flavilio può andare incontro a due tipi di reazioni, unareazione di idratazione oppure una reazione acido-base. Attraverso la prima il catione flaviliosi trasforma nell’emichetale corrispondente, mentre la seconda reazione porta alla conversionedel catione flavilio nella base chinoidale.L’apertura dell’eterociclo e il riarrangiamento dell’emichetale portano alla formazione delcalcone.Diversamente se il catione flavilio viene fatto reagire con HSO 3- si forma il composto flavene,per cui l’antociano diventa incolore.I fattori che influiscono sull’equilibrio che si instaura fra queste diverse forme della molecolae sul suo colore sono il valore del pH, la temperatura e la quantità di anidride solforosa liberaall’interno del vino. In condizioni acide prevale la forma cationica flavilio, mentre a unincremento del pH segue un incremento della porzione di antocianine in forma chinoidale, dicolore blu violetto. (14-17).Degradazione delle antocianine. Come sopra riportato, le antocianine nei vini rossi non sonoparticolarmente stabili, e la loro concentrazione spesso diminuisce drasticamente nei viniinvecchiati in bottiglia o in barrique. Dopo alcuni anni d’invecchiamento, nonostante il coloredel vino rimanga di tonalità rossa, le antocianine monomeriche non sono più presenti. Tale 6
  • 7. fenomeno è dovuto alle reazioni di polimerizzazione o ad altre reazioni che modificano leantocianine monomeriche che si trasformano in composti diversi da quelli originariamentepresenti nel vino.Generalmente la stabilità delle antocianine monomeriche dipende da vari fattori, quali: la loroconcentrazione all’interno del vino, la struttura, il pH del vino, il tempo e la temperatura a cuiil vino è sottoposto durante il periodo d’invecchiamento, lo stato di ossidazione, l’esposizionealla luce, la presenza di altre sostanze all’interno del vino (come acido ascorbico, zucchero,solfiti, cofattori e ioni metallici).Normalmente, le antocianine sono più stabili in mezzo acido che in un mezzo alcalino. Il vinogiovane ha un pH basso, per questo motivo gli antociani gli conferiscono un colore rossovivace. Quando il vino invecchia, la diminuzione dell’acidità e la contemporanea ossidazionedegli antociani fanno emergere tonalità grigie, che combinandosi con il rosso chiaro dannoorigine a sfumature aranciate; la tendenza al colore aranciato è un fenomeno caratteristico delvino spumante Cruasè. Inoltre la stabilità delle antocianine è elevata a basse temperature,l’esposizione alla luce promuove il loro processo di degradazione e la presenza di acidoascorbico e zuccheri produce un decremento di stabilità della struttura antocianica. (18-20).Influenza delle pratiche enologiche sugli antociani del vino. La concentrazione delleantocianine monomeriche presenti all’interno del vino dipende da diversi fattori derivanti dalmetodo di vinificazione, quali la varietà dell’uvaggio impiegato, le condizioni di macerazione,l’uso di enzimi, la temperatura di macerazione e di fermentazione.La macerazione a basse temperature (comprese tra 5 e 15 °C) permette l’estrazione dipigmenti, tannini e aromi che passano dalla buccia dell’uva al vino. L’estrazione di questicomposti avviene in assenza di etanolo, poiché le basse temperature causano l’inibizionedell’azione dei lieviti vinari, impedendo l’inizio della fermentazione alcolica. L’estrazionedegli antociani dalle bucce dell’uva durante la macerazione dipende pertanto dallatemperatura, dal grado alcolico e dai livelli di anidride solforosa.(21-22)L’aggiunta di enzimi pectolitici durante la macerazione può facilitare l’estrazione degliantociani, con un conseguente incremento del colore. Gli enzimi provocano la rottura dellepectine presenti nella parete cellulare dell’uva, questo processo libera gli antociani e altricomposti fenolici, anch’essi inclusi nella parete cellulare (7, 23) 7
  • 8. VINO SPUMANTE CRUASE’Il termine Cruasé è un neologismo formato dalla fusione delle due parole “cru” (selezione) e“rosé” con l’interposizione di una “a” che funge da congiunzione. Il termine “Cruà” eral’antico nome del vitigno/vino prodotto di eccellenza in Oltrepò Pavese nel XVIII secolo.Unendo le due espressioni “Cruà” oppure “cru” e “rosé” è stato coniato il termine “Cruasé”. Ilmarchio è di proprietà del Consorzio dell’Oltrepò Pavese e la produzione del vino Cruasè èregolamentata da un disciplinare di produzione che 1) prevede l’uso di un minimo pari all’85% di uve di Pinot Nero a denominazione di origine controllata, 2) indica che il vino è ottenutomediante metodo classico e 3) vi deve essere un affinamento sui lieviti della durata di almeno24 mesi (8).Poiché, come sopra riportato, i dati di mercato suggeriscono che il vino di qualità è quello chenel futuro verrà maggiormente consumato, l’ottenimento di vini di qualità dovrebbe essere ilprincipale obiettivo delle aziende vitivinicole, indipendentemente dalle dimensioni, dalprodotto lavorato, dalla fascia di mercato occupato e dalla localizzazione geografica. Perprodurre vino di qualità tutte le fasi del processo produttivo, dalla coltura della vite allavendita, dovrebbero essere attentamente monitorate, con il fine di ottimizzare le proprietàsensoriali e quindi aumentare l’affezione dei consumatori nei confronti del prodotto vino.Il presente lavoro di tesi si colloca nell’ambito degli studi volti a migliorare una delle piùimportanti caratteristiche sensoriali del vino spumante Cruasè DOCG, che è rappresentata dalcolore. In particolare, è noto che i diversi ceppi di lievito, utilizzati per la secondafermentazione, finalizzata alla produzione del vino spumate, presentano caratteristichegenetiche eterogenee, che si ripercuotono per esempio a livello della struttura della paretecellulare del lievito, influenzando le loro caratteristiche adsorbenti nei confronti delleantocianine responsabili del colore rosato del prodotto finito. Pertanto lo scopo della presentericerca è monitorare, durante rifermentazioni in provetta, il potere adsorbente esercitato dailieviti vinari sugli antociani presenti nel vino con la finalità di scegliere i lieviti chepermettono, alla fine del processo di vinificazione, di ottenere un vino caratterizzato dalcolore tipico del Cruasè. 8
  • 9. MATERIALI E METODILieviti. In questa sperimentazione sono stati presi in considerazione tre lieviti startercommerciali (S1, S2 e S3) comunemente impiegati nelle rifermentazioni vinarie per laproduzione dello spumate metodo classico. I ceppi, appartenenti alla specie Saccharomycescerevisiae, provengono dal laboratorio di microbiologia dell’Università di Milano presentinella collezione del Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente.Rivitalizzazione dei ceppi starter selezionati. I tre ceppi di Saccharomyces cerevisiae,conservati alla temperatura di -80°C, una volta scongelati e portati a temperatura ambiente,sono stati coltivati in piastre Petri contenenti terreno Wallister’s Laboratory Oxoid (WL) emesse a incubare per 48 h a 25 °C (tabella 1). Le colonie di lievito cresciute in piastravengono prelevate in condizioni sterili e poste in 20 ml di brodo (YEPD) (tabella 2). Il terrenodi crescita inoculato con il microrganismo viene posto in termostato a 25 °C per due giorni.Al termine dell’incubazione, l’inoculo è sottoposto a misura della densità ottica (OD) a λ 660nm, per valutarne la densità di popolazione iniziale.Tabella 1. Composizione del terreno Wallister’s Laboratory Oxoid (WL) e valore di pH. Composizione terreno colturale WL (mg/l) Estratto di lievito 4000,0 Caseina idrolizzata 5000,0 Glucosio 50000,0 Potassio diidrogenofosfato 550,0 Cloruro di potassio 425,0 Cloruro di calcio 125,0 Solfato di magnesio 125,0 Cloruro di ferro 2,5 Verde di bromo cresolo 22,0 Agar 17000,0 pH 5,5 9
  • 10. Tabella 2. Composizione mezzo colturale Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) evalore di pH. Composizione mezzo colturale YEPD (g/l) Estratto di lievito 10 Peptone 20 Glucosio 20 Cloramfenicolo 0,1 Acqua distillata. q.b pH 5,5Aggiunta di elementi nutritivi al vino base e filtrazione. Per la micro-rifermentazione èstato utilizzato un vino base per la produzione di spumante Cruasè, prodotto a seguito dellavendemmia 2012 presso la cantina di micro-vinificazione del Centro di ricerca, formazione eservizi della vite e del vino Riccagioia S.C.p.A. Per favorire l’avvio della rifermentazione, alvino base è stato addizionato, quale sostanza nutritiva necessaria alla crescita dei lieviti,zucchero, aggiunto in quantità tale da permettere il raggiungimento all’interno delle provettedi una pressione di 5-6 atmosfere (24g/l di zucchero). Per prevenire contaminazionibatteriche, il campione di vino è stato sottoposto a filtrazione su membrana di nitrocellulosaWhatman con pori del diametro di 0,45 µm, posizionata all’interno di un dispositivo difiltrazione a vuoto (Sartotius Sartolab RF/BT). Successivamente, sono state aggiunte al campione di vino: 1) una miscela di vitamine,appartenenti principalmente ai gruppi D e B, nella quantità di 1 ml/l; e 2) 3 g/l di ammoniosolfato.La miscela di vitamine ha la seguente composizione: D-biotina 0,05 g/l, Ca-D-pantotenato 1,00 g/l, acido nicotinico 1,00 g/l, mio-inositolo 25,00 g/l, tiamina cloridrato 1,00 g/l, piridossale cloridrato 1,00 g/l, acido p-aminobenzoico 0,20 g/l.Preparazione della miscela di vitamine. La biotina è sciolta in 10 ml di NaOH 0,1 M ediluita con acqua distillata fino a un volume pari 0,75 l. Il pH deve avere un valore di 6,5. Aquesto punto vengono aggiunte tutte le altre componenti della miscela sopra citate. Viene 10
  • 11. aggiunta ulteriormente acqua fino ad arrivare al volume di 1l. La soluzione è filtrata mediantefiltri sterili, infine la soluzione risultante viene conservata alla temperatura di 4°C.Inoculo dei ceppi starter di lievito nel campione di vino. 400 ml di vino base,precedentemente addizionati di zucchero, vitamine e ammonio solfato, come sopra riportato,sono stati suddivisi in quattro aliquote: alla prima aliquota, a sua volta ripartita in quattroprovette di vetro Pirex con tappo a vite, non è stato addizionato lievito (controllo negativo),mentre alle restanti tre aliquote (anch’esse suddivise in 4 provette) sono stati inoculati i tredifferenti ceppi di lievito selezionati (106 UFC/ml). Tutti i campioni così preparati sono statiposti in termostato a 18 °C al riparo dalla luce per 9 giorni. Le analisi microbiologiche(determinazione della densità ottica a 660 nm, conta diretta al microscopio ottico e conta inpiastra) e le analisi chimiche (determinazione degli antociani totali e analisi del colore)finalizzate alla determinazione dell’adsorbimento da parte dei lieviti delle antocianine, sonostate eseguite ai tempi t0= 0 giorni, t1= 1giorno t2= 3 giorni, t3= 6 giorni e t4= 9 giorni.E’ stata quindi condotta una successiva prova in cui al vino base è stato addizionato il ceppodi Saccharomyces cerevisiae (S2), che nelle prove precedenti presentava il minor potereadsorbente nei confronti delle antocianine. In questa seconda fase della sperimentazione leanalisi microbiologiche (determinazione della densità ottica a 660 nm, conta diretta almicroscopio ottico e conta in piastra) e le analisi chimiche (determinazione delle antocianinemediante metodo RP-HPLC-UV-Vis, come riportato nel Compendium of InternationalMethods of Analysis-OIV (25), e analisi del colore) sono state eseguite ai tempi t0= 0 giorni,t1= 7 giorni, t2= 14 giorni, t3= 21 giorni, t4= 28 giorni, t5= 61 giorni, t6= 91 giorni.SAGGI MICROBIOLOGICIMisura della vitalità. La vitalità dei lieviti è stata valutata tramite conta al microscopio. Ilvetrino viene preparato con soluzioni coloranti a base di blu di metilene. 1ml di campione èstato risospeso in 1ml di soluzione colorante, la cui composizione è riportata in tabella 3.Dopo 10 minuti, 10 µl di tale soluzione sono stati posti nella camera di conta di Thoma. Almicroscopio ottico, con ingrandimento 40x , vengono contate le cellule di lievito vive,bianche, distinguendole da quelle morte, blu.Tabella 3. Composizione della soluzione di blu di metilene. Soluzione blu di metilene (g/l) Blu di metilene 0,200 KH2PO4 27,200 NA2HPO4 0,071 Acqua distillata q.b. 11
  • 12. Conta della concentrazione cellulareI campioni vengono diluiti opportunamente dapprima con acqua peptonata (la cuicomposizione è descritta in tabella 4) e in seguito distribuiti uniformemente per spatolamentosu terreno WL .Per il calcolo della concentrazione cellulare si contano sulle piastre, incubate per tre giorni a25°C, le unità formanti colonie (UFC) e viene applicata la seguente formula:UFC/ml= ΣC / (1*n1 + 0.1 *n2) dDove:ΣC = somma del numero di colonie delle piastre contabilin1 = numero di piastre contabili nella prima diluizionen2 = numero di piastre contabili nella seconda diluizioned = rappresenta la prima diluizione in cui si riscontra la prima piastra contabile.Si considerano contabili le piastre che hanno un numero di colonie compreso tra 10 e 300.Tabella 4. Composizione dell’acqua peptonata e relativo valore di pH. Composizione del mezzo (g/l) acqua peptonata Triptone 10 NaCl 5 Acqua distillata . q.b. pH 7,2Densità otticaÈ stata effettuata una misurazione della densità ottica a λ 660 nm, per valutare la densità dipopolazione dei lieviti.Questa misura è effettuata mediante Spettrofotometro UV/VIS Lambda 35 PerkinEImer.Il campione viene posizionato in cuvette di plastica con camino ottico da 1cm.Al fine di effettuare le analisi chimiche ad ogni tempo di monitoraggio i campioni sono staticentrifugati a 4000 rpm per 20 min (centrifuga Sigma D-37520); in questo modo i lievitiprecipitano sul fondo sotto forma di pellet cellulare, per cui si ha la possibilità di separare ilieviti dal resto del vino (surnatante).ANALISI CHIMICHEAnalisi del colore del vino. Tutti i campioni preparati nella prima e seconda fase dellasperimentazione sono stati sottoposti alla determinazione del colore che è stata effettuatamediante misura spettrofotometrica (Spettrofotometro UV/VIS Lambda 35 PerkinEImer), con 12
  • 13. il programma Wine Color Analysis in dotazione allo strumento. Tale programma misural’assorbanza a λ 420 nm, 520 nm, 620 nm, corrispondenti rispettivamente ai coloricomplementari giallo, rosso e blu. I campioni di vino sono stati analizzati in cuvette concammino ottico da 1 cm effettuando una scansione da 780 nm a 380 nm. Sono stati analizzatisia i campioni di vino a cui non erano stati addizionati lieviti (controlli negativi) sia icampioni di vino inoculati con i tre ceppi di lievito utilizzati nel progetto. Le analisi sono statecondotte sul surnatante ottenuto dopo centrifugazione del campione.Analisi del colore dei lieviti. I campioni ottenuti nella seconda fase di sperimentazione, altermine del rispettivo periodo di monitoraggio, sono stati sottoposti a centrifugazione a 4000rpm per 20 min. Il precipitato, separato dal surnatante, è costituito dai lieviti. Tale precipitatoè stato ripreso con 1 ml di soluzione tampone a pH 7 (sale triptone) e la sospensione cosìottenuta è stata posta su un disco di carta da filtro Whatman. Il filtro è asciugato parzialmentea t.a. fino a quando il campione raggiunge una compattezza pastosa che permette di effettuarele analisi colorimetriche utilizzando la sfera integratrice del colore associata allospettrofotometro Lambda 35. La sfera è un apparato che consente di misurare la trasmittanza(definita riflettanza) della luce su materiali opachi e si compone di un volume sferico, biancointernamente e altamente riflettente, che ha la funzione di riflettere e moltiplicare il raggioluminoso riflesso da un corpo opaco e ne permette la misura del colore.Determinazione degli antociani totali. Tutti i campioni derivanti dalla prima fase dellasperimentazione sono stati sottoposti ad analisi per la determinazione del contenuto diantociani totali. L’analisi è stata effettuata mediante l’analizzatore enologico automaticomultiparametrico Wineflow (Gibertini s.r.l., Novate Milanese), che permette ladeterminazione degli antociani totali (espressi in mg/l), presenti nel vino, mediante analisispettrofotometrica secondo il metodo ufficiale OIV (25). Le prove sono state effettuate sia sulvino tal quale sia su campioni di vino addizionati con antociani commerciali utilizzati nellepratiche di cantina.Analisi RP-HPLC-UV-Vis. L’analisi cromatografica è stata eseguita sui surnatanti ottenutidai campioni preparati nella seconda fase della sperimentazione dopo centrifugazione a 4000rpm per 20 minuti. Le analisi sono state condotte impiegando un sistema HPLC MERCKHITACHI serie L, modulare, con pompa L-6200 e detector UV-Visibile L-4200, fornita diintegratore D-2500. La separazione cromatografica è stata condotta su colonna Purospher StarRP-18 encapped 5μm, mediante eluizione in gradiente, come riportato in Tabella 5, a flussopari a 0,8 ml/min e utilizzando una fase mobile binaria costituita da una soluzione acquosa di 13
  • 14. acido formico al 10% e da acetonitrile. I cromatogrammi sono stati registrati a λ 516 nm. Il volume di campione iniettato è pari a 20 µl. Tabella 5. Programma di eluizione in gradiente. Tempo (min) Solvente A % Solvente B % 0 94 6 15 70 30 30 50 50 35 40 60 41 94 6• soluzione A = miscela di acqua,acido formico e acetonitrile in proporzione 87:10:3 (v/v/v)• soluzione B = miscela di acqua, acido formico e acetonitrile in proporzione 40:10:50 (v/v/v). 14
  • 15. RISULTATI E DISCUSSIONENella fase iniziale della ricerca il vino base, comunemente utilizzato per la preparazione dellospumante Cruasè DOCG mediante metodo classico, è stato inoculato con tre differenti ceppidi Saccharomices cerevisiae, scelti tra quelli maggiormente impiegati in enologia nella fase dirifermentazione. I campioni ottenuti come riportato in Materiali e Metodi sono stati sottopostiad analisi microbiologiche e chimiche a intervalli di tempo definiti, al fine di monitorarel’adsorbimento da parte dei lieviti delle antocianine, responsabili del colore rosato del vinooggetto di studio.Nelle prove preliminari la rifermentazione è stata monitorata per un periodo di nove giorni ele analisi sono state eseguite all’inizio della rifermentazione (cioè all’atto dell’inoculazionedella coltura starter), dopo 1, 3, 6 e 9 giorni (t0, t1, t2, t3, t4 ).Per quanto riguarda le analisi microbiologiche, volte alla valutazione della concentrazionemicrobica e della vitalità del lievito, sono stati eseguiti tre differenti saggi: determinazionedella densità ottica a λ 660 nm, conta diretta al microscopio ottico e conta in piastra.La densità ottica dei campioni analizzati, riportata in tabella 6 e in figura 1, aumentaall’aumentare della durata della rifermentazione, a indicare un aumento della concentrazionemicrobica.Poiché tale saggio non permette di discriminare le cellule vive da quelle morte, la ricerca èproseguita con la conta diretta al microscopio ottico e la conta in piastra. I dati ottenuti sonoriportati nelle tabelle 7 e 8 e nelle figure 2 e 3. I risultati della conta diretta al microscopioindicano un decremento della vitalità cellulare al termine del monitoraggio (9 giorni) del 20%circa con un concentrazione microbica media, calcolata mediante conta in piastra, pari a circa7,9 105 UFC/ml.Tabella 6. Densità ottica misurata a λ 660 nm. S. cerevisiae Densità ottica (OD/ml) λ 660nm Ceppo t0 t1 t2 t3 t4 S1 0,5 0,9 1,0 2 2,9 S2 0,5 0,9 1,9 2,7 4,5 S3 0,5 1,2 1,6 2,2 3,8Figura 1. Densità ottica misurata a λ 660 nm. 15