FORMARE E INFORMARE PER AUMENTARE IL LIVELLO
DI COMPETITIVITA’ DEL TERRITORIO LOMBARDO

Il controllo di insetti parassiti ...
Insetti


Malattie della vite
Batteri

Fillossera della vite

Tumore batterico

(Daktulosphaira vitifogliae)

Cicaline

...
Alcune specie di insetti dannosi per la vite
fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae, Rhynchota, Homoptera)
cical...
fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae)

Specie di origine Americana,
arrivata in Europa alla metà

del secolo I...
Scaphoideus titanus

uova

larve 2a-3a età

larva 5a età

adulti

in accoppiamento

Specie di origine Americana, monovolti...
Nell’infezione dell’insetto, i fitoplasmi attraversano la parete dell’intestino medio, si moltiplicano
nell’emolinfa, entr...
Sintomi riconducibili a Flavescenza dorata (FD)

A

B

C

D

A: disseccamento del grappolo

B: arrossamenti fogliari setto...
cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus)

Specie polifaga, con ciclo su
differenti organi della pianta ospite.

Vett...
cicalina verde della vite Empoasca vitis

Specie diffusa in tutta la regione paleartica
In Italia si ritrova con maggior f...
Tignola della vite, Eupoecilia ambiguella

Specie di Lepidottero con 2 generazioni all’anno (1a generazione antofaga), la ...
tignoletta dell’uva o della vite Lobesia botrana

Specie di Lepidottero con 3 generazioni all’anno:
1a generazione: uova d...
Drosophila melanogaster (moscerino della frutta o m. dell’aceto)

Specie di dittero, divenuto organismo modello di eccelle...
Drosophila suzukii (spotted wing drosophila)

Di origine asiatica, è una nuova specie invasiva.
Al di fuori dell’Asia, il ...
Specie esotiche di insetti dannosi per la vite che hanno espanso il loro areale
di diffusione stabilendo popolazioni deriv...
Insetti parassiti

Aspetti dinamici
Estensione della
distribuzione al di là
della zona naturale
Ospiti
L’ambiente
(Comples...
Processi invasivi
Cos’è un processo invasivo?
Quale è l’origine geografica delle specie di interesse ?

Definizione geogra...
Migrazione

Invasioni Biologiche

Componente importante dei cambiamenti globali con effetti
potenzialmente dannosi sulla s...
Ma perché alcune specie diventano invasori
di successo? :
(Cicaline, moscerini della frutta, zanzare)
La diversità di cara...
Il punto critico è una comprensione
della storia del processo di
invasione
La variabilità delle popolazioni avventizi dipe...
Conoscendo le fasi dell’invasione è possibile prendere in considerazione
strategie atte a frenare o bloccare un’invasione
La ricostruzione dei percorsi
d’invasione:
PERCHE’?
• Esso facilita la progettazione di strategie per
prevenire invasioni ...
Metodi di ricostruzione di un
percorso invasivo:
• Diretti
- Sulla base di documenti storici di
presenza/assenza di taxa i...
Metodi per la ricostruzione
• Indiretti
Modelli genetici osservati dentro e tra le popolazioni
con marcatori molecolari (R...
Il caso studio
La storia delle specie invasive, Scaphoideus
titanus
Records storici di Scaphoideus titanus
Metodo diretto
FRANCIA meridionale
ITALIA settentrionale
SVIZZERA
occidentale e mer...
Metodi indiretti mediante l’uso di marcatori molecolari che definiscono
il “fingerprint” dei singoli individui di ciascuna...
Raccolta dei campioni di S. titanus nell’areale di diffusione
Scelta dei marcatori molecolari per determinare i “fingerprints” dei singoli individui

Pattern molecolare di individui di...
USA (NY state)
Francia
Italia
Svizzera
Slovenia
Spagna

Relazioni genetiche tra popolazioni
illustrate dall’ albero di con...
Considerazioni dedotte dall’analisi dei dati

In accordo con l’origine Neartica della specie, le due popolazioni native Am...
Al contrario, i dati genetici mettono in luce una frammentazione genetica tra popolazioni sia entro
che tra i Paesi Europe...
Metodi di controllo contro gli insetti

Metodi su base chimica (insetticidi)

Metodi compatibili con l’ambiente
su base bi...
Resistenza agli Insetticidi
All’interno di una popolazione esistono fattori biochimici e genetici che conferiscono resiste...
Resistenza agli Insetticidi
Fattori operativi

Caratteristiche chimiche

Caratteristiche delle applicazioni



natura chi...
I nuovi approcci biotecnologici, permettendo di conoscere la struttura del
genoma del parassita (insetto, patogeno), offro...
Insetti parassiti

Aspetti dinamici
Estensione della
distribuzione al di là
della zona naturale
Ospiti
L’ambiente
(Comples...
Popolazioni - ambiente: l’olfatto
come finestra sul comportamento
(manipolazione dell’olfatto)
Lo studio dell’olfatto e della chemorecezione permette di identificare l’apparato
molecolare coinvolto nel riconoscimento ...
Esempio: Ceratitis capitata
mosca mediterranea della frutta

Genomica, genomica funzionale e approcci
biochimici/fisiologi...
Medfly geni chemosensoriali

Noi siamo cratterizzati da geni/proteine coinvolte
nel riconoscimento di ligandi esterni (pia...
Caratterizzazione dei geni: Obp/Pbp
Structural features:
Signal peptide, Conserved Cysteine profile: Classic, Minus-C, Plu...
Specificità
dell’espressione
tissutale:
analisi SEM degli organi olfattivi
di Medfly (antennae and maxillary
palps) e iden...
I geni Obp sono identificati con funzioni leganti
i ferormoni putativi
Sono Pbps?

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•

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Chromosomal location
Localizzazione di un gene pheromone binding protein (PBP) sui cromosomi
CcPbprp1 hybridisation to chr...
Caratterizzazione funzionale delle proteine PBP

Espressione
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purificazione

Studi di Binding
(identificano la s...
Seguremo l’approccio che abbiamo adottato per la Medfly:

Caratterizzazione
dei componenti
ferormonici

Caratterizzazione
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Identification of active compounds by GC-EAG

19 composti chimici
hanno evidenziato una
elevata risposta
antennale, quando...
Sono state finora caratterizzate 5 PBPs (Pheromone binding proteins) di
C. capitata e sono stati altresì identificati i lo...
Si possono in tal modo mettere a punto metodi biotecnologici che interferiscono con
la capacità dell’insetto di riconoscer...
Monitoraggio e metodi di eradicazione

delle popolazioni

Le biotecnologie sono importanti anche per l’applicazione
della ...
La Sterile Insect Technique (= SIT)
Rilascio di un elevato numero di insetti maschi sterili all’interno di una

popolazion...
Sterilizzazione tramite radiazioni
Sterile Insect Technique (SIT)

Wimmer 2005, Nature Biotechnology 23: 432
Vantaggi della strategia SIT
1. Non inquinante
2. Specie-specifico
3. Potenziale per l’eliminazione locale
Campagne di era...
Ad oggi, SIT è il metodo di controllo più ampiamente utilizzato contro le mosche
della frutta appartenenti alla famiglia T...
Limiti della strategia SIT
• Solo i maschi sterili contribuiscono alla soppressione della
popolazione. La presenza di femm...
Nonostante notevoli successi, SIT non si è mostrato appropriato per tutte
le specie di insetti dannosi, principalmente per...
Monitoraggio
Fino ad ora le pupe, allevate in laboratorio e
sterilizzate, sono marcate con polveri
fluorescenti per distin...
Transformazione della linea germinale, basata su trasposoni (= sequenze mobili di DNA)
genes of interest
white+

Vector

t...
Sviluppo di un sitema di colorazione dello sperma,
Usando un promotore di un gene specifico per la
spermatogenesi,
driving...
Sex and tissue-specific expression of Ccb2t in adult individuals
5’ pBac

G

5’ pBac

attP

b2t

G attP

DsRedEx

b2t

tGF...
Risultato:
14 linee transgeniche

Quante copie transgene?
Effetto del sito di inserimento?
Penetranza?
Stabilità del trans...
Persistenza della fluorescenza in testicoli di mosche morte
Espressione testicolo-specifica del Ccb2t-DsRedEx e -tGFP
era ...
868 bp la regione a monte del gene Ccb2tubulin è in grado di
dirigere l’espressione di DsRedEx e tGFP durante la
spermatog...
Sono queste le linee potenzialmente utili per la marcatura dello
sperma?

La misurazione risulta difficoltosa
Uso in
labor...
Capacità di
accoppiamento del
maschio
In esperimenti sulla competizione in accoppiamento, i maschi delle
linee 2 Ccb2t-tGF...
Spermatozoi transgenici sono trasferiti con successo alle femmine.
Essi sono chiaramente visibili nelle spermateche di fem...
Population replacement
Questo approccio mira all ’ introduzione di un
meccanismo di resistenza in grado di prevenire la
tr...
Gli avanzamenti tecnologici degli ultimi decenni hanno permesso di

sviluppare e migliorare, a livello teorico e operativo...
Il batterio acetico Asaia sp., candidato agente di controllo simbiotico per la lotta a FD della vite trasmessa da
Scaphoid...
Grazie per l’attenzione

46-million-year-old mosquito, the first ever fossilized blood meal

Insetti: le enormi difficoltà...
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Presentazione Giuliano Gasperi

  1. 1. FORMARE E INFORMARE PER AUMENTARE IL LIVELLO DI COMPETITIVITA’ DEL TERRITORIO LOMBARDO Il controllo di insetti parassiti nella vite Anna Rodolfa Malacrida - Giuliano Gasperi Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani” Università di Pavia 22 ottobre 2013 RICCAGIOIA S.C.p.A. – TORRAZZA COSTE (PV)
  2. 2. Insetti  Malattie della vite Batteri Fillossera della vite Tumore batterico (Daktulosphaira vitifogliae) Cicaline  Malformazioni infettive (arricciamento, mosaico giallo, etc.) Scaphoideus titanus  Accartocciamento  Hyalesthes obsoletus Legno riccio Vite (cicalina del Legno nero)   (Agrobacterium tumifacines) (flavescenza dorata)  Virus Fitoplasmi Empoasca vitis Flavescenza dorata (cicalina verde della vite) Funghi  Rickettsie  Oidio o mal bianco della vite Lobesia botrana  Muffa grigia  Mal dell’esca  Escoriosi Drosophila melanogaster  Marciume nero o black-rot  Ragno rosso della vite (marciume acido per acetobatteri)  Peronospora della vite (tignoletta dell’uva o della vite)   (tignola della vite)  Eupoecilia ambiguella  Marciume radicale fibroso  Ragnetto giallo Drosophila suzukii  Marciume radicale lanoso  Acariosi della vite (rischio presunto)  Marciume acido  Erinosi Malattia di Pierce Nematodi Nematodi galligeni Acari
  3. 3. Alcune specie di insetti dannosi per la vite fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae, Rhynchota, Homoptera) cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus, Rhynchota, Homoptera) cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus, Rhynchota, Homoptera) cicalina verde della vite (Empoasca vitis, Rhynchota, Homoptera) tignola della vite (Eupoecilia ambiguella, Lepidoptera, Hetroneura) tignoletta dell’uva o della vite (Lobesia botrana, Lepidoptera, Hetroneura) Drosophila melanogaster, Diptera (marciume acido da acetobatteri) Drosophila suzukii, Diptera (rischio presunto)
  4. 4. fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae) Specie di origine Americana, arrivata in Europa alla metà del secolo IX, diffondendosi rapidamente. Su vite Europea Il danno, determinato dalle sue punture, si riscontra:  sulle radici (formazione di galle nodose) e perdita di capacità assorbente  sulle foglie (galle tondeggianti e rugose) con danno apparentemente trascurabile Su vite Americana  il danno radicale è limitato perché le radici sono poco sensibili e reattive alle punture  le foglie sono molto reattive e producono un grande numero di galle All'interno delle galle si completa lo sviluppo degli stadi giovanili e la specie sverna (in Europa) allo stadio di uovo, a livello radicale
  5. 5. Scaphoideus titanus uova larve 2a-3a età larva 5a età adulti in accoppiamento Specie di origine Americana, monovoltina, svernante come uova nei tralci; è il vettore del fitoplasma che causa Flavescenza dorata (FD)
  6. 6. Nell’infezione dell’insetto, i fitoplasmi attraversano la parete dell’intestino medio, si moltiplicano nell’emolinfa, entrano nelle ghiandole salivari e si moltiplicano ulteriormente Quando l’insetto si nutre su una nuova pianta, i fitoplasmi sono introdotti nel floema (= tessuto di conduzione della linfa elaborata) insieme con i fluidi salivari, e infettano le cellule del floema Il processo di trasmissione è caratterizzato da tre fasi interdipendenti: 1. Acquisizione: alimentazione su piante infette, allo stadio giovanile (ninfe di III e V età) 2. Latenza: periodo variabile (14-28 giorni) che trasforma le cicaline da infette a infettive (= quando raggiungono le cellule di vari organi, tra cui le ghiandole salivari). 3. Inoculazione: attraverso la saliva durante l’attività trofica, gli adulti sono in grado di infettare le piante sane su cui si nutrono (tempi d’inoculazione di alcune ore) Fitoplasmi in cellula di floema
  7. 7. Sintomi riconducibili a Flavescenza dorata (FD) A B C D A: disseccamento del grappolo B: arrossamenti fogliari settoriali su vitigno a bacca rossa C: ingiallimenti e ripiegature fogliari su vitigno a bacca bianca D: aspetto generale di un filare fortemente colpito
  8. 8. cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus) Specie polifaga, con ciclo su differenti organi della pianta ospite. Vettore di fitoplasma (gruppo Stolbur), diffente dal fitoplasma trasmesso da Scaphoideus
  9. 9. cicalina verde della vite Empoasca vitis Specie diffusa in tutta la regione paleartica In Italia si ritrova con maggior frequenza nelle regioni settentrionali Cicadellide polifago, dannoso soprattutto su vite in seguito alle punture provocate sulle nervature fogliari che determinano alterazioni cromatiche del lembo fogliare. L'entità degli attacchi è generalmente limitata, non arrivando a causare gravi danni sulla qualità e quantità della produzione. Ha un nemico naturale: parassitoide delle uova (imenottero Anagrus anatomus)
  10. 10. Tignola della vite, Eupoecilia ambiguella Specie di Lepidottero con 2 generazioni all’anno (1a generazione antofaga), la seconda (carpofaga) svernante allo stadio di nel ritidoma della vite Si alterna negli anni con la tignoletta dell’uva (dimensioni minori), ed in talune aree le due specie coesistono.
  11. 11. tignoletta dell’uva o della vite Lobesia botrana Specie di Lepidottero con 3 generazioni all’anno: 1a generazione: uova deposte sui bocci fiorali 2a generazione: uova deposte sugli acini 3a generazione: stadio di crisalide va incontro a diapausa nel ritidoma della vite
  12. 12. Drosophila melanogaster (moscerino della frutta o m. dell’aceto) Specie di dittero, divenuto organismo modello di eccellenza per le ricerche genetiche, di biologia dello sviluppo, di neurobiologia Ciclo vitale in natura = 3 – 4 settimane Le uova sono deposte su materiale organico (frutta) in decomposizione Marciume acido dell’uva da acetobatteri
  13. 13. Drosophila suzukii (spotted wing drosophila) Di origine asiatica, è una nuova specie invasiva. Al di fuori dell’Asia, il 1° record storico è del 1980 in Hawaii 2008: California, USA 2009: Italia, Spagna, Francia, Germania e Svizzera Nei Paesi in cui si è diffusa ha trovato habitat ideali per espandersi, e lo svernamento avviene in ambienti associati con le abitazioni La femmina depone uova nei frutti in maturazione (piccoli frutti, talvolta acini d’uva)
  14. 14. Specie esotiche di insetti dannosi per la vite che hanno espanso il loro areale di diffusione stabilendo popolazioni derivate, lontano dal loro areale (home-range) sono tra le altre: fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae) originaria di USA orientali 1a entrata in Europa: Francia, 1863 cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus), Originaria di Stati Uniti 1° entrata in Europa: Francia 1958 drosofila con le ali macchiate (Drosophila suzukii) originaria di Asia 1° entrata in Europa: 2009
  15. 15. Insetti parassiti Aspetti dinamici Estensione della distribuzione al di là della zona naturale Ospiti L’ambiente (Complessità) Effetti legati alla stagione Virus, parassiti Adattamento Olfatto
  16. 16. Processi invasivi Cos’è un processo invasivo? Quale è l’origine geografica delle specie di interesse ? Definizione geografica dell’areale di diffusione della specie esotica
  17. 17. Migrazione Invasioni Biologiche Componente importante dei cambiamenti globali con effetti potenzialmente dannosi sulla salute pubblica, l'agricoltura e la biodiversità. Una popolazione invasiva è un insieme di individui (propagulo) che: 1) è stato introdotto in una nuova zona (ARRIVO) 2) si è stabilita, accresciuta di numero (STABILIMENTO: la popolazione cresce e si espande) 3) Si è d
  18. 18. Ma perché alcune specie diventano invasori di successo? : (Cicaline, moscerini della frutta, zanzare) La diversità di caratteri relativi alla «life history» può implicare sostanzialmente diverse e imprevedibili potenzialità d’ invasione per ciascuna specie, ciò determina il successo o il fallimento delle invasioni.
  19. 19. Il punto critico è una comprensione della storia del processo di invasione La variabilità delle popolazioni avventizi dipende da: • La storia della popolazione ancestrale • Il numero/dimensione dei propaguli • I percorsi geografici dei propaguli: molteplici popolazioni di origine e siti di introduzione introduzione di una considerevole variabilità nel corso di un breve periodo di tempo.
  20. 20. Conoscendo le fasi dell’invasione è possibile prendere in considerazione strategie atte a frenare o bloccare un’invasione
  21. 21. La ricostruzione dei percorsi d’invasione: PERCHE’? • Esso facilita la progettazione di strategie per prevenire invasioni (misura di quarantena); • Per eradicazione/contenimento: l'efficacia delle misure di controllo dipende dalla diversità/origine genetica e geografica del genotipo introdotto.
  22. 22. Metodi di ricostruzione di un percorso invasivo: • Diretti - Sulla base di documenti storici di presenza/assenza di taxa invasivi (e.g.: Scaphoideus titanus in Europa)
  23. 23. Metodi per la ricostruzione • Indiretti Modelli genetici osservati dentro e tra le popolazioni con marcatori molecolari (RAPD; SSRs, SNPs, etc.). Metodi di Clustering: • Basati sui dendrogrammi (es. neighbour-joining tree) dalle matrici di distanze genetiche tra le popolazioni. • Antenati in comune degli individui invasori con popolazioni del range nativo (STRUCTURE by Pritchard et al., 2000). Assegnazione di probabilità: direzione d’introduzione(GeneClass).
  24. 24. Il caso studio La storia delle specie invasive, Scaphoideus titanus
  25. 25. Records storici di Scaphoideus titanus Metodo diretto FRANCIA meridionale ITALIA settentrionale SVIZZERA occidentale e meridionale 1958 1963 La specie è di origine nord-Americana, introdotta accidentalmente in Europa nel XX secolo. 1968 Risulta essere monofaga su vite in Europa; è il vettore specifico di Phytoplasma vitis, CROAZIA 1987 SLOVENIA 1987 SERBIA 2003 agente eziologico della Flavescenza dorata (FD) della vite. FD, inizialmente identificata nella Francia meridionale, si è diffusa in molte zone viticole del nord-Italia, della Spagna, della Slovenia e SPAGNA 1995 della Svizzera, assumendo caratteristiche epidemiche. PORTOGALLO settentrionale 1999
  26. 26. Metodi indiretti mediante l’uso di marcatori molecolari che definiscono il “fingerprint” dei singoli individui di ciascuna popolazione geografica, presenti sia nell’areale originario della specie (popolazioni ancestrali) sia nell’areale di diffusione (popolazioni derivate o avventive) Sviluppo di un database di riferimento che permette studi di tracciabilità ogniqualvolta si sia in presenza di un focolaio invasivo (outbreak) Tale database diventa ulteriormente importante se vengono introdotte informazioni relative alla presenza di un patogeno (es. Fitoplasma) nelle singole poplazioni Sviluppo di mappe di rischio (per arginare sia insetto vettore che il patogeno)
  27. 27. Raccolta dei campioni di S. titanus nell’areale di diffusione
  28. 28. Scelta dei marcatori molecolari per determinare i “fingerprints” dei singoli individui Pattern molecolare di individui di due popolazioni di S. titanus ottenuto con l’uso del marcatore molecolare RAPD 494N: San Colombano (Italia) e Valois (USA). Un frammento specifico (410 bp) è presente solo in individui Americani (= marcatore molecolare di popolazione per saggi di tracciabilità); un frammento monomorfo (430 bp) è presente in ambedue le popolazioni
  29. 29. USA (NY state) Francia Italia Svizzera Slovenia Spagna Relazioni genetiche tra popolazioni illustrate dall’ albero di consenso Neighbour Joining (NJ), basato su distanze genetiche D di Nei, derivate dalle frequenze dei marcatori RAPD. Le popolazioni Americane sono chiaramente separate dal mix eterogeneo delle popolazioni Europee.
  30. 30. Considerazioni dedotte dall’analisi dei dati In accordo con l’origine Neartica della specie, le due popolazioni native Americane hanno un’elevata plasticità genetica, che può costituire per la specie un alto potenziale adattativo. In questo contesto è opportune ricordare che nell’areale originario, S. titanus ha capacità di adattamento a diversi ospiti. La diffusione di S. titanus in Europa è avvenuta da occidente ad oriente, adattando il suo ciclo biologico in relazione con il ciclo di Vitis vinifera (Boudon-Padieu, 2002). Ma come è avvenuta questa diffusione, dato il suo ristretto grado di mobilità ed il suo essere monovoltino? Queste caratteristiche biologiche potrebbero suggerire una diffusione “step by step” che dovrebbe riflettere la cronologia delle invasioni.
  31. 31. Al contrario, i dati genetici mettono in luce una frammentazione genetica tra popolazioni sia entro che tra i Paesi Europei, senza un gradiente Ovest – Est. Questo pattern genetico eterogeneo è conseguente ad introduzioni indipendenti (propaguli diversi) entro e tra le aree Europee. E’ possibile che questo scenario sia associate agli scambi commerciali di barbatelle infestate da uova di S. titanus sotto la corteccia (Boudon- Padieu 2002; Weintraub and Beanland 2006). Vitis vinifera è la pianta ospite di S. titanus ed è anche riserva di fitoplasma. Considerando la quantità di materiale vivaistico prodotto e scambiato commercialmente, è evidente la necessità di rigorosi controlli di qualità sia per la presenza di uova che per la presenza di fitoplasma.
  32. 32. Metodi di controllo contro gli insetti Metodi su base chimica (insetticidi) Metodi compatibili con l’ambiente su base biologica (bioinsetticidi, feromoni, etc) su base genetica (SIT, Tecnica dell’Insetto Sterile) su base biotecnologica (transgenesi e paratransgenesi)
  33. 33. Resistenza agli Insetticidi All’interno di una popolazione esistono fattori biochimici e genetici che conferiscono resistenza ad un dato insetticida; la velocità di evoluzione della resistenza è correlata a numerosi parametri Fattori genetici Fattori biologici / ecologici Biotici  frequenza di alleli di resistenza  numero di generazioni / stagione  numero di alleli resistenti  numero di prole / generazione  dominanza di resistenti  monogamia vs poligamia; partenogenesi  interazioni degli alleli resistenti  precedente selezione con altri insetticidi  grado di integrazione di genomi resistenti con fattori di fitness Ecologici /Comportamentali  isolamento; mobilità; migrazione  monofagia, oligofagia; polifagia  presenza di rifugi entro l’area trattata NB: Questi fattori non possono essere facilmente controllati, e l’importanza di alcuni non può essere definita fino a quando la resistenza si sia espressa
  34. 34. Resistenza agli Insetticidi Fattori operativi Caratteristiche chimiche Caratteristiche delle applicazioni  natura chimica degli insetticidi  soglia di applicazione  relazione di prodotti chimici con  soglia di selezione  stadio(i) del ciclo di sviluppo selezionato  modalità di applicazione  selezione limitata nello spazio  selezione alternata quelli usati in precedenza  persistenza dei residui; formulazioni I fattori operativi che influenzano lo sviluppo della resistenza sono mediati dall’uomo, e pertanto possono essere guidati. Il management rella resistenza di popolazioni di insetti dannosi sta diventando una componente estremamente importante di ogni programma di “pest management, specialmente a causa del fatto che vengono attualmente prodotti meno prodotti pesticidi nuovi.
  35. 35. I nuovi approcci biotecnologici, permettendo di conoscere la struttura del genoma del parassita (insetto, patogeno), offrono le possibilità di capire a livello molecolare:  la sua biologia,  i suoi processi riproduttivi  la sua interazione con la pianta ospite Su queste basi si potrà interferire per bloccare  il rapporto insetto – pianta ospite  il rapporto patogeno – insetto ospite
  36. 36. Insetti parassiti Aspetti dinamici Estensione della distribuzione al di là della zona naturale Ospiti L’ambiente (Complessità) Effetti legati alla stagione Virus, parassiti Adattamento Olfatto
  37. 37. Popolazioni - ambiente: l’olfatto come finestra sul comportamento (manipolazione dell’olfatto)
  38. 38. Lo studio dell’olfatto e della chemorecezione permette di identificare l’apparato molecolare coinvolto nel riconoscimento di importanti segnali per la scoperta del cibo, per l’accoppiamento e per l’identificazione dei siti di ovoposizione. Fornisce strumenti per lo sviluppo di prodotti attrattivi / repulsivi, maschio / femmina specifici, per trappolaggio e monitoraggio (di interesse per industrie biotecnologiche)
  39. 39. Esempio: Ceratitis capitata mosca mediterranea della frutta Genomica, genomica funzionale e approcci biochimici/fisiologici: sequenze specie/sesso specifiche correlate alla recezione chimica e alla riproduzione ESTs (profili di espressione) 27,167 high quality ESTs from: Sequenza genomica Embryo (10,267 ESTs), Adult Head (10,986 ESTs), Male Accessory gland and testes (5914 ESTs) Consortium: Pavia, Baylor College, USDA
  40. 40. Medfly geni chemosensoriali Noi siamo cratterizzati da geni/proteine coinvolte nel riconoscimento di ligandi esterni (piante ospiti e componenti feromoni) Obp - Odorant Binding Proteins (OBPs) Pbp - Pheromone Binding Proteins (PBPs) Or - Odorant Receptors (ORs) Csp - Chemosensory Proteins (CSPs) Ode - Odorant Degrading Enzymes (ODEs)
  41. 41. Caratterizzazione dei geni: Obp/Pbp Structural features: Signal peptide, Conserved Cysteine profile: Classic, Minus-C, Plus-C (Vieira et al 2011) Phylogenetic relationships: looking for orthology with known characterized genes/proteins: Obp repertoire of D. melanogaster was used as a reference given the close phylogenetic affinity of the two species (80-100 Mya) (Ayala et al 1996). Chromosomal location: Syntenic groups, Clusters, Cluster conservation Specificity of tissue expression in relation to the chemosensorial compartments: Head, antennae, palps, tarsi
  42. 42. Specificità dell’espressione tissutale: analisi SEM degli organi olfattivi di Medfly (antennae and maxillary palps) e identificazione di tre differenti classi di sensilla
  43. 43. I geni Obp sono identificati con funzioni leganti i ferormoni putativi Sono Pbps? Caratterizzaizone dei geni Pbp : • Localizzazione cromosomica in gruppi di sintesi; • Espressione tessuto specifica in relazione ai comparti chemosensoriali: testa, antenne, palpi, tarsi. Caratterizzazione funzionale delle proteine PBP: • Affinità di binding; • Cristallizzazione.
  44. 44. Chromosomal location Localizzazione di un gene pheromone binding protein (PBP) sui cromosomi CcPbprp1 hybridisation to chromosome 6R in position 95b
  45. 45. Caratterizzazione funzionale delle proteine PBP Espressione proteica e purificazione Studi di Binding (identificano la specificità della proteina per il ligando) Purificazione dei ferormoni: Collection of volatiles Gas-chromatography-mass spectrometry Coupled gas-chromatography /electroantennography Comosti attivi antennali
  46. 46. Seguremo l’approccio che abbiamo adottato per la Medfly: Caratterizzazione dei componenti ferormonici Caratterizzazione di Pheromone binding protein Analisi SEM degli organi olfattivi Saggi di Binding Siciliano et al.(a) and (b), submitted
  47. 47. Identification of active compounds by GC-EAG 19 composti chimici hanno evidenziato una elevata risposta antennale, quando testati su femmine 14 composti hanno evidenziato una risposta antennale, quando testati su maschi 22 diversi prodotti chimici isolati dai maschi come componenti ferormoniche (solo 15 identificati)
  48. 48. Sono state finora caratterizzate 5 PBPs (Pheromone binding proteins) di C. capitata e sono stati altresì identificati i loro ligandi (componenti del feromone) Silenziando i geni di questi PBPs con opportuni approcci molecolari, le corrispondenti proteine non verranno più prodotte, e il legame con lo specifico componente del feromone verrà a mancare. Di conseguenza, si viene così ad interferire con il riconoscimento tra i sessi o con altre funzioni evocate dall’emissione di componenti dei feromoni
  49. 49. Si possono in tal modo mettere a punto metodi biotecnologici che interferiscono con la capacità dell’insetto di riconoscere odori per la ricerca del frutto, per l'accoppiamento e per il riconoscimento di siti di oviposizione. L'identificazione e l'espressione in vitro di geni dell’olfatto, permette studi di binding per l'identificazione di molecole odorose specifiche (ligandi) che innescano la trasduzione di segnale per il riconoscimento della pianta ospite, per l'attrazione sessuale, e per l'identificazione di siti per l'oviposizione. Infatti, l'interazione tra queste molecole odorose (ligandi) e il complesso OBP o PBP/OR determina nell'insetto risposte attrattive o repulsive. L'identificazione di proteine chemosensoriali e dei loro ligandi specifici permette alle compagnie Biotech di adattare high-throughput technologies utilizzate nell'industria chimico-farmaceutica per l'identificazione di molecole (ligandi) che interferiscono con la trasduzione di segnale nei diversi sistemi di chemiorecezione dell’insetto. E' quindi possibile identificare nuove molecole che possono rappresentare potenti attrattivi oppure repellenti, che interferiscono con la capacità dell’insetto di percepire un particolare odore. Tali molecole sono di grande importanza per attività di monitoraggio e per il controllo di insetti dannosi.
  50. 50. Monitoraggio e metodi di eradicazione delle popolazioni Le biotecnologie sono importanti anche per l’applicazione della Tecnica dell’Insetto Sterile (SIT)
  51. 51. La Sterile Insect Technique (= SIT) Rilascio di un elevato numero di insetti maschi sterili all’interno di una popolazione wild-type della stessa specie, così da farli accoppiare e quindi bloccare la riproduzione delle femmine della popolazione wild-type. La tecnica SIT prevede l’allevamento di un gran numero di insetti della specie bersaglio, esponedoli a radiazioni ionizzanti che detrminano la loro sterilità sessuale, poi devono essere rilasciati nella popolazione bersaglio. Il concetto dei SIT è semplice, la pratica è complessa Il successo dell’applicazione dei SIT richiede:  La capacità di allevare, sterilizzare e distribuire sufficienti insetti per ottenere un elevato successo dell’insetto maschio sterile nei confronti del maschio wild-type  I maschi sterili devono prevalere in numero rispetto agli omologhi wild-type, devono perciò poter competere con essi a livello riproduttivo
  52. 52. Sterilizzazione tramite radiazioni
  53. 53. Sterile Insect Technique (SIT) Wimmer 2005, Nature Biotechnology 23: 432
  54. 54. Vantaggi della strategia SIT 1. Non inquinante 2. Specie-specifico 3. Potenziale per l’eliminazione locale Campagne di eradicazione: • New World Screwworm: eradicata da US, Messico, Guatemala, Belize e Panama (40 anni) • Tsetse: eradicata a Zanzibar (1994-1997) • Medfly: eradicata dal Messico (1980-1986) New World Screwworm Tsetse Medfly
  55. 55. Ad oggi, SIT è il metodo di controllo più ampiamente utilizzato contro le mosche della frutta appartenenti alla famiglia Tephritidae: Bactrocera tryoni Bactrocera dorsalis Anastrepha ludens ma è anche diretto a lepidotteri: Pectinophora gossypiella Cydia pomonella
  56. 56. Limiti della strategia SIT • Solo i maschi sterili contribuiscono alla soppressione della popolazione. La presenza di femmine duplica i costi di allevamento • Il successo di SIT dipende dalla fitness e competitività dei maschi sterili e dal comportamento sessuale delle femmine wildtype • Infrastrutture necessarie per allevamento, sterilizzazione, rilascio, monitoraggio
  57. 57. Nonostante notevoli successi, SIT non si è mostrato appropriato per tutte le specie di insetti dannosi, principalmente per la necessità di disporre di: (1) modalità di allevamento intensivo di grandi numeri di insetti per il rilascio massivo (2) efficaci metodi di separazione dei sessi (3) tecniche di sterilizzazione in grado di produrre grandi numeri di insetti con minimi effetti sulla fitness (4) efficienti metodi di rilascio (5) precisi sistemi di marcatura che permettano di identificare facilmente gli individui rilasciati
  58. 58. Monitoraggio Fino ad ora le pupe, allevate in laboratorio e sterilizzate, sono marcate con polveri fluorescenti per distinguerle dalle pupe wildtype quando sono catturate nelle trappole, posizionate intorno all’area di rilascio. Catherine Smallridge Svantaggi: polvere  costosa, non facile da gestire, pericolosa per la salute umana, operazione soggetta a errori Marker ideali: • Durevole • Poco costoso • Non tossico (per insetti e ambiente) • Chiaramente identificabili • Non devono influenzare il normale comportamento, crescita, riproduzione, durata della vita. Possibile soluzione: trasformazione marcatore fluorescente
  59. 59. Transformazione della linea germinale, basata su trasposoni (= sequenze mobili di DNA) genes of interest white+ Vector transposase + Helper inject we G0 embryo with vector/helper mix backcross G0 adult to we host strain select G1 red eye color transformants
  60. 60. Sviluppo di un sitema di colorazione dello sperma, Usando un promotore di un gene specifico per la spermatogenesi, driving GFP o DsRed expression Ricerca di base (studi sul comportamento durante l’accoppiamento) Ricerca applicata (stima di efficacia SIT)
  61. 61. Sex and tissue-specific expression of Ccb2t in adult individuals 5’ pBac G 5’ pBac attP b2t G attP DsRedEx b2t tGFP G G PUb PUb EGFP DsRed 3’ pBac 3’ pBac
  62. 62. Risultato: 14 linee transgeniche Quante copie transgene? Effetto del sito di inserimento? Penetranza? Stabilità del transgene? Stabilità di espressione? Marcatura sperma? È un utilizzo fattibile?
  63. 63. Persistenza della fluorescenza in testicoli di mosche morte Espressione testicolo-specifica del Ccb2t-DsRedEx e -tGFP era rilevabile in individui adulti, anche dopo tre mesi dalla morte Body marker Testes marker Pub-DsRed b2t-tGFP
  64. 64. 868 bp la regione a monte del gene Ccb2tubulin è in grado di dirigere l’espressione di DsRedEx e tGFP durante la spermatogenesi, questo consente di evidenziare lo sperma verde o rosso dai testicoli. tGFP transformed sperm from testes DsRedEx transformed sperm from testes
  65. 65. Sono queste le linee potenzialmente utili per la marcatura dello sperma? La misurazione risulta difficoltosa Uso in laboratorio Eventuale uso in campo Fattori essenziali di base: Longevità Riproduzione capacità di accoppiamento trasferimento / conservazione dello sperma qualità dello sperma
  66. 66. Capacità di accoppiamento del maschio In esperimenti sulla competizione in accoppiamento, i maschi delle linee 2 Ccb2t-tGFP erano in grado di competere con i maschi wildtype per le femmine wild-type. Questo è stato particolarmente evidenziato in una linea che ha guadagnato il 47% degli accoppiamenti. I maschi delle linee 2 Ccb2t-DsRedEx erano significativamente meno competitivi dei maschi wild-type quando erano in competizione con le femmine wild-typeIn media hanno guadagnato solo il 15% degli accoppiamenti. Effetto della proteina esogena DsRedEx?
  67. 67. Spermatozoi transgenici sono trasferiti con successo alle femmine. Essi sono chiaramente visibili nelle spermateche di femmine fecondate wild-type. tGFP transformed sperm DsRedEx transformed sperm
  68. 68. Population replacement Questo approccio mira all ’ introduzione di un meccanismo di resistenza in grado di prevenire la trasmissione della patologia. Attualmente è un approccio in via di sviluppo e necessita di notevole ottimizzazione Richiede due principali elementi: (1) Un meccanismo per la resistenza al patogeno (es. fitoplasma in S. titanus) (2) Un metodo di diffusione del gene nella popolazione
  69. 69. Gli avanzamenti tecnologici degli ultimi decenni hanno permesso di sviluppare e migliorare, a livello teorico e operativo, sia la tecnica SIT che gli approcci basati sul ‘population replacement’con l’uso di batteri simbionti (NB: paratransgenesi)
  70. 70. Il batterio acetico Asaia sp., candidato agente di controllo simbiotico per la lotta a FD della vite trasmessa da Scaphoideus titanus, è trasferito orizzontalmente tra individui che condividono il substrato alimentare. La trasmissione orizzontale è stata dimostrata tramite prove di cofeeding su dieta artificiale, condotte alimentando su una stessa soluzione zuccherina prima un individuo colonizzato con un ceppo marcato di Asaia, e successivamente un esemplare non colonizzato. Il grafico indica le cicaline risultate positive a PCR quantitativa con primer specifici per il gene marcatore (colonne azzurre) sul totale di individui saggiati (colonne blu), in seguito a diversi periodi di condivisione della dieta (da 24 a 96 ore) (modificato da GONELLA et al., 2012)
  71. 71. Grazie per l’attenzione 46-million-year-old mosquito, the first ever fossilized blood meal Insetti: le enormi difficoltà di controllarli in maniera efficace
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