Maria La Piana tesi
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Analisi cromatografiche di Vini Bonarda D.O.C.

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  • 1. 0
  • 2. INDICE INTRODUZIONE …………………………………………………………..……………………….3 CAPITOLO 1: IL VINO ………..………………………………………………..………………….5 1.1 COMPOSIZIONE CHIMICA DELL’ACINO ………………………..………………………...5 1.2 LA PRODUZIONE DEL VINO …………………………...………………………………..…11 1.3 CLASSIFICAZIONE DEI VINI …………………………………………………..………...…13 1.4 I VITIGNI …………………………………………………………………………………...….14 1.4.1 CROATINA ……………………………………….……………………………………...….15 1.4.2 BARBERA ………………………………………….…………………………………….…17 1.4.3 VINI ROSSI DOC: BARBERA E BONARDA ………...……………………………....... 19 1.5 ASPETTI SENSORIALI-colore,odore,gusto ...…………………………….…………….……20 1.5.1 COLORE ...…………………………………………………………………………………...20 1.5.2 ODORE …………………...………………………………………………………………....21 1.5.3. GUSTO ………………………………………………………………………………………22 1.6 – COSTITUENTI CHIMICI DEL VINO COINVOLTI NELL’ANALISI SENSORIALE…..23 CAPITOLO 2 : I POLIFENOLI .......…………………………………………...…………………..28 2.1. BIOSINTESI ...…………………………………………………………………….………….29 2.2 DEGRADAZIONE ...…………………………………………………………………………..33 2.3 CLASSIFICAZIONE ...………………………………………………………………….......…34 2.4 IMPORTANZA DEI POLIFENOLI NEL VINO ……………………………………………..38 2.4.1 ANTOCIANI …………..………………………………………………………………….….38 2.4.2 FLAVANI ……………………………………………………………………………...……..39 2.4.3 ACIDO GALLICO ………………………………...………………………..………………..40 2.4.4 TANNINI ……………………………………...…………………………………...………...41 2.5 POLIFENOLI E SALUTE …………………………………….………………………………43 1
  • 3. CAPITOLO 3: LA CROMATOGRAFIA ………………………………………………………….46 3.1 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE CROMATOGRAFICHE ………………………..46 3.2 PRINCIPIO FISICO DELLA CROMATOGRAFIA ………………………………………….48 3.3 HPLC …………………………………………………………………………………….…….53 CAPITOLO 4: SCOPO DEL LAVORO …………………………………………………………...55 4.1 MATERIALI E METODI ……………………………………………………………….……..58 4.2 PROCEDURA …………………………………………………………………………….……59 4.2.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ………………...………………………………..…...59 4.2.2 ANALISI ………………………………………...…………………………………………...59 4.2.3 LA COLONNA CROMATOGRAFICA ……………...…………………………..……..….60 4.2.4 STANDARD ……………………….………………………………………………..……....62 4.2.5 CURVE DI TARATURA ……………………..……………………………………..……...63 CAPITOLO 5 RISULTATI E CONCLUSIONI …………………………………………………...68 5.1 CROMATOGRAFIA CON DETECTOR A λ=516nm ………………………...…................68 5.2 CROMATOGRAFIA CON DETECTOR A λ=278nm …………………………………….....77 5.3 CONCLUSIONI …………………………………………………………………………….….82 ALLEGATI ………………………………………………………………………………………...84 DISCIPLINARE VINI DOC DELL’OLTREPO’ PAVESE …………………………………….....84 DISCIPLINARE BONARDA DOC DELL’OLTREPO’ PAVESE ………………………………..91 COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHOD OF ANALYSIS-OIV ………………….….95 BIBLIOGRAFIA ………………………………………………………………………..………...105 2
  • 4. INTRODUZIONE La scienza del vino coinvolge tre aspetti principali: la crescita della vite, la produzione del vino e l’analisi sensoriale del vino. La natura botanica delle materie prime (fisiologia e genetica della vite) e la trasformazione biochimica dell’uva in vino attuata da batteri e lieviti, sono fondamentali per comprendere le caratteristiche del prodotto finito. Inoltre è importante precisare che la variabilità del risultato ultimo che caratterizza il mercato e le qualità di ogni vino, dipende non solo dalle diversità territoriali, climatiche e ambientali a cui è esposta la materia prima, ma anche dalle numerose differenti modalità operative che si trovano alla base dei processi che contribuiscono al passaggio dell’uva in vino. Infine la conoscenza della psicofisiologia sensoriale umana aiuta a comprendere tutti gli aspetti olfattivi,visivi e gustativi che determinano la valutazione finale del prodotto da parte del consumatore. In modo particolare, degli studi hanno dimostrato come il colore influenzi l’odore (Brochet F. and Dubourdieu D., 2001) e come entrambi influenzino il gusto percepito dall’uomo. Il giudizio sulla qualità di un cibo o di una bevanda è quindi correlato inizialmente con questi tre aspetti. Ovviamente alla base di tutto ciò è importante studiare la composizione chimica del prodotto perché è questa che determina tutte le sue proprietà. Lo studio della composizione chimica dell’uva e del vino riveste pertanto un ruolo importante per la caratterizzazione del prodotto, per il miglioramento della qualità e per stimare il potenziale enologico che dall’uva può essere trasferito al vino. In questo studio abbiamo deciso di focalizzare la nostra attenzione sui polifenoli ossia delle molecole che sono naturalmente presenti nell’uva e che vengono trasferite al vino; alcune di esse, inoltre, si originano nel vino in seguito ai processi di vinificazione che vengono eseguiti. Lo studio dei composti fenolici dell’uva e del vino si presenta alquanto complesso e articolato per l’ampia diversità di molecole che fanno parte di questa grande famiglia e per il diverso contributo sensoriale apportato. La composizione quantitativa delle uve, in riferimento a questi composti, è estremamente variabile; la presenza di polifenoli nell’acino, infatti, è influenzata da diversi fattori: le condizioni di maturazione del grappolo, le tecniche colturali, l’esposizione al sole, la posizione geografica e il tipo di terreno. Un altro aspetto da considerare è la cosiddetta estraibilità dei costituenti fenolici dalle parti solide, che avviene durante la macerazione e la fermentazione. I polifenoli sono substrati di un gran numero di reazioni chimiche, subiscono diverse variazioni di struttura nel corso dell’affinamento e dell’invecchiamento del vino modificandone le caratteristiche organolettiche e influenzandone inoltre il colore. E' possibile quindi, attraverso l'analisi del profilo polifenolico di un vino nei suoi vari componenti, stabilire a grandi linee la provenienza del vitigno, costruendone una sorta di carta di identità del vino. 3
  • 5. I polifenoli sono anche noti per le loro caratteristiche salutari: sono potenti antiossidanti, antitumorali, riducono l’aggregazione piastrinica, forniscono protezione contro la fragilità capillare e svolgono un’attività antibatterica. Il vino rosso è una significativa fonte naturale di polifenoli e un moderato consumo giornaliero contribuisce all’apporto di circa un grammo di polifenoli . Gli studi e i metodi di analisi per la qualificazione e quantificazione dei polifenoli sono numerosi. Alcuni approcci utilizzano la valutazione di classi di composti mediante l’utilizzo di tecniche spettrofotometriche, mentre altri prevedono analisi più dettagliate come la cromatografia ad alta pressione (HPLC e UPLC), la gascromatografia (GC), la spettrometria di massa (SM). Nella ricerca da noi effettuata le analisi sui polifenoli sono state eseguite in HPLC seguendo il metodo contemplato nel COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS-OIV (Method OIV-MA-AS315-11 -Type II method) che ha permesso di rilevare i picchi relativi corrispondenti alle maggiori antocianine presenti nei vini rossi analizzati, Bonarda e Barbera. Attuando quest’ultimo metodo, abbiamo anche rilevato i picchi relativi corrispondenti all’acido gallico e catechina, eseguendo una lettura alla lunghezza d’onda di 278nm. In questo modo è stato possibile rilevare alcune caratteristiche peculiari delle due tipologie di vino analizzate. 4
  • 6. CAPITOLO 1: IL VINO Fin da tempi molto antichi il vino è stata una bevanda che ha suscitato interesse e ha rappresentato un punto di riferimento per la cultura di molte popolazioni. Basti pensare alla mitologia greca o egiziana per avere un’idea di come il vino fosse conosciuto già nei secoli a.C. e venisse utilizzato non soltanto come bevanda, ma anche a scopi rituali. L’importanza attribuitagli, sia per le sue qualità organolettiche che per le sue proprietà salutari, non ha mai subìto un processo d’arresto ma è stata sempre in notevole aumento, tanto che oggi ci sono degli studi specifici che sono volti a migliorare le conoscenze in questo campo. Il vino, secondo la vigente legislazione, è il “prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione totale e parziale di uve fresche, pigiate e non, o di mosti d’uva”. (Reg. CE 479/08, legge quadro sull’OCM, attuata dai Reg. CE 606/09 e 607/09). 1.1 COMPOSIZIONE CHIMICA DELL’ACINO La bacca d’uva deriva dalla fecondazione dell’ovario o da uno sviluppo per via partenocarpica. La parete dell'ovaio si sviluppa nella parete del frutto o pericarpo ossia un insieme di tessuti che circonda i vinaccioli (Ribérerau-Gayon et al., 2003). Il pericarpo è a sua volta suddiviso in:  esocarpo esterno, chiamato anche buccia, costituito da un sottile strato di cellule appiattite a forma di disco, con bordi ondulati e irregolari; è membranoso e possiede una cuticola con pochi stomi o priva di stomi. Sulla cuticola si può formare, maggiormente in alcune varietà rispetto ad altre, uno strato di natura cerosa detto pruina, che ha una notevole importanza nel trattenimento dei lieviti;  mesocarpo centrale, formato da una serie di strati di grosse cellule piene di succo; la divisione cellulare avviene rapidamente, circa una settimana dopo la fecondazione, per poi rallentare e arrestarsi entro tre settimane. La divisione cellulare cessa dapprima nella parte vicino i vinaccioli e man mano si riduce fino alla buccia;  endocarpo interno, non distinguibile dal resto della polpa, che contiene i semi, chiamati vinaccioli. Mesocarpo ed endocarpo formano la polpa, o sarcocarpo. Nella buccia, oltre l’acido tartarico e citrico, sono contenute parecchie molecole di prodotti secondari tra cui: composti fenolici (antociani, flavanoli e flavoni), tannini, aromi (linalolo, 5
  • 7. geraniolo, nerolo, etc.) ed enzimi che si accumulano in essa durante la maturazione (RibérerauGayon et al., 2003). Nella polpa sono contenute molecole diverse rispetto alla buccia tra cui: zuccheri (glucosio e fruttosio principalmente), acido tartarico, malico, citrico ed altri acidi in tracce, pectine, sostanze colloidali varie, composti azotati, sostanze minerali, etc. Figura 1.1 : Rappresentazione di un acino di uva Le varietà che forniscono vini di qualità superiore, solitamente, hanno bacche più piccole (Stevenson T., 2005), perchè hanno un rapporto buccia/polpa a favore della buccia, ciò è molto importante perchè durante la fase di macerazione, permette l’estrazione di un maggior numero di sostanze nobili. Quest’ultime determinano il colore e il carattere aromatico a cui associamo l’identità varietale di ogni vino (Stevenson T., 2005). Il vinacciolo è formato da un corpo rigonfio e da una parte sottile detta becco. Possiede un tegumento esterno (testa), con epidermide spessa e un tegumento interno (tegmen) che racchiude la parte più interna del seme, la mandorla. Quest’ultima rappresenta l’endosperma secondario provvisto delle sostanze di riserva (oli, granuli di aleurone) che serviranno ad alimentare l’embrione (Fregoni et al., 2006). 6
  • 8. In seguito alla fecondazione e alla recezione dei relativi stimoli ormonali, l'ovario inizia la sua crescita e sviluppo nella bacca. Tipicamente, si osserva una curva di crescita leggermente doppia sigmoide. Nella fase I, chiamata anche “fase erbacea”, il grappolo riceve acidi organici dalle radici e dalle foglie, aminoacidi dalle foglie, sali minerali dalle radici e zuccheri provenienti dalle parti legnose e dalle foglie (Peynaud, 1985). La bacca è caratterizzata da una rapida divisione cellulare, seguita da allargamento delle cellule e sviluppo dell'endosperma. Gli stimoli ormonali di questa fase sono a carico principalmente delle auxine e delle gibberelline, ma intervengono anche le citochinine. Il contenuto ormonale è strettamente correlato alla presenza di vinaccioli nelle bacche. Alla fine della fase erbacea l’acino raggiunge buona parte dello sviluppo definitivo, perde una certa quantità di acqua ed eleva leggermente il tenore zuccherino (soprattutto glucosio), che raggiunge il 2%, ma in alcune cultivar può essere più elevato; si accumula clorofilla nella buccia (Fregoni et al., 2006), inoltre aumenta l’acidità fino ad arrivare al 30% (Peynaud, 1985), quest’ultima è dovuta soprattutto alla presenza di acido tartarico e malico. La fase iniziale dello sviluppo dell’acino dura tipicamente da sei settimane a due mesi. La fase II o “fase traslucida e invaiatura” è un periodo di transizione in cui la crescita rallenta, l'embrione si sviluppa e il seme s‘indurisce. Questa fase è più variabile di durata (1-6 settimane) ed è la più influente nello stabilire se la cultivar è in anticipo o in ritardo nella maturazione. In seguito avviene la diminuzione della clorofilla e la bacca assume un aspetto traslucido; le bacche assumono progressivamente la colorazione tipica della cultivar, cioè dal verde si passa al giallo nelle uve bianche e al rosso più o meno intenso in quelle nere. Questa fase corrisponde ad un esaurimento della sintesi delle sostanze di crescita e ad un aumento dei livelli di acido abscissico. Inoltre inizia la sintesi degli aromi, dei polifenoli e di altri componenti strettamente correlati alle caratteristiche genetiche della cultivar, che raggiungeranno il loro apice di intensità durante la fase di maturazione. Il tutto termina con l’invaiatura. Si arresta inoltre la crescita dimensionale della bacca (Fregoni et al., 2006). Questo punto di svolta, chiamato “vèraison”, è l'inizio del turno fisiologico fondamentale che culmina in maturazione della bacca. La fase III o “fase di maturazione”, dura 5-8 settimane prevede l'ampliamento e la maturazione definitiva della bacca. La maturazione è associata con diversi parametri: la modificazione della consistenza meccanica che da rigida e fragile, diventa morbida e plastica, in seguito a cambiamenti della struttura delle pareti cellulari e alla riduzione del turgore cellulare; una diminuzione dell'acidità e aumento dei livelli di pH del succo come conseguenza dell’ossidazione dell’acido malico, della diluizione e della salificazione dell’acido malico e dell’acido tartarico( la salificazione è soprattutto dovuta all’accumulo di potassio nella bacca stessa); l'accumulo di zuccheri semplici 7
  • 9. quali fruttosio e glucosio grazie alla migrazione delle sostanze elaborate dalle foglie e assorbite dalle radici verso l’acino; l'acquisizione di composti aromatici; la degradazione della clorofilla più o meno completa e la comparsa della colorazione di fondo giallastra tipica dei carotenoidi presenti nella varietà a bacca bianca, o della colorazione che va da grigio-rosa a blu intenso, dovuta all’accumulo di antociani nella buccia; accumulo di amminoacidi (prolina e arginina soprattutto) e di proteine a basso peso molecolare; parziale “inattivazione” delle molecole tanniche che si complessano con oligosaccaridi e proteine (Jackson R.S., 2000). Durante la maturazione, le varie componenti presenti all’interno dell’acino d’uva non aumentano di peso nelle stesse proporzioni. La polpa cresce in modo maggiore della buccia, mentre il peso dei vinaccioli varia poco dall’invaiatura alla vendemmia (Fregoni et al., 2006). La successiva sovra-maturazione del frutto, che si verifica se la raccolta è in ritardo, è chiamato stadio IV. Figura 1.2: Relazione tra stadi di crescita I, II, III e accumulo di solidi solubili totali. 8
  • 10. L’uva, a seconda di diversi parametri, raggiunge il suo grado di maturità in diversi tempi:  Si parla di maturità fisiologica quando cessa l’interazione tra pianta e frutto e quest’ultimo non richiama più linfa elaborata dalla pianta. In questo periodo, se l’uva non viene raccolta, inizia la fase IV, nella quale si ha una concentrazione dei componenti dell’acino dovuta ad una graduale perdita di acqua da parte del frutto. Nel corso della sovramaturazione si ha comunque un certo progresso delle attività metaboliche, anche se in quantità molto minori rispetto alle fasi precedenti, che porta ad alcune modificazioni della bacca quali un’ulteriore riduzione dell’acido malico e l’evoluzione delle sostanze aromatiche e polifenoliche. La sovramaturazione può anche avvenire dopo la vendemmia lasciando i grappoli esposti al sole o in appositi locali a temperature e umidità controllata. Quando la perdita di acqua supera il 15-20% si parla di appassimento.  La maturità tecnologica è invece raggiunta quando nell’uva si ha un particolare rapporto tra zuccheri e acidità totale. L’aumento degli zuccheri totali nell’acino, procede con un aumento costante dall’invaiatura in poi, mentre il contenuto in acidità totale decresce all’incirca dallo stesso momento. Il valore ottenuto dal rapporto tra zuccheri e acidità totale, definito “indice di maturazione”, ci permette di determinare il periodo ottimale di raccolta considerando che il valore di questo rapporto tende a stabilizzarsi, dopo una fase crescente, in prossimità della corretta maturazione tecnologica; superata la corretta maturazione si verifica un arresto di essa e un successivo appassimento delle uve. La maturità tecnologica pertanto può precedere o seguire quella fisiologica .  Nei vitigni a bacca colorata si definisce anche una maturità fenolica, che determina uno stato fisiologico dell’uva caratterizzato da un particolare tenore e da una particolare struttura dei composti fenolici della buccia e dei semi, da cui dipende la loro diffusione nel mosto nel corso della vinificazione (Ribérerau-Gayon et al., 2003). Lo stadio di maturazione incide profondamente sulla composizione polifenolica della bacca e perciò influenza in modo significativo anche la successiva qualità del vino. Durante questo tipo di maturazione avviene un aumento della componente fenolica e una diminuzione di quella antocianica che rende il colore del vino pieno e compatto. 9
  • 11. Figura 1.3 - Maturità tecnologica a confronto. Fonte: Lanati et al., 2002 10
  • 12. 1.2 LA PRODUZIONE DEL VINO Non appena l’uva ha raggiunto la cosiddetta maturità tecnologica , che viene determinata eseguendo delle curve di maturazione nelle quali viene seguito l’andamento zuccherino, acidità, ph e contenuto di polifenoli, è pronta per la vendemmia. Durante la raccolta, il trasporto e lo stoccaggio dell’uva, è necessario ridurre al massimo le alterazioni fisiche e meccaniche del prodotto per evitare lo sviluppo di malattie negli acini che potrebbero alterare la qualità del prodotto finale; bisogna porre una particolare attenzione al fatto di evitare l’inizio di fermentazioni indesiderate da parte dei lieviti presenti sulle bucce. Dopo esser stata raccolta, l’uva viene portata in cantina dove si procede con la diraspatura che consiste nella separazione dei raspi dai grappoli, questa operazione permette di avere un prodotto meno astringente e con un valore di acidità fissa e un grado alcolico maggiore in quanto non ci sarà assorbimento di alcol e cessione di acqua da parte dei raspi. A questo punto, l’uva verrà pigiata in modo delicato per estrarne il succo. Successivamente si procede con la vinificazione. Questa è l’operazione più delicata e si esegue in modo diverso per la vinificazione delle uve bianche o rosse. E’ in questo stadio che le sostanze caratteristiche dell’uva si trasformano in qualità per il futuro vino. Durante questa fase, attraverso un processo di macerazione, la vinaccia è tenuta a contatto con il mosto in modo da favorire l’estrazione delle sostanze coloranti contenute nella buccia dell’uva. La macerazione porta essenzialmente all’estrazione di composti fenolici (antociani e tannini), sostanze aromatiche, sostanze azotate e polisaccaridi. Il cuore di questo processo di trasformazione dell’uva in vino, è la fermentazione. Gli zuccheri infatti sono trasformati in alcol etilico, anidride carbonica e altri composti secondari da parte dei lieviti. La fermentazione può essere regolata, attivandola o rallentandola, con opportuni interventi quali le follature e gli arieggiamenti. Quando la fermentazione tumultuosa diminuisce d’intensità, si effettua la svinatura ossia la separazione del vino dalle vinacce e dalle fecce. Dopo aver svinato, il prodotto è pronto per una seconda fermentazione detta “fermentazione lenta”. L’operazione finale è il travaso, che consiste nella decantazione del vino limpido separandole dalle proprie fecce. Questa operazione è di fondamentale importanza in quanto la permanenza del vino a contatto con le fecce non ha un effetto positivo sulle caratteristiche organolettiche del vino. In funzione della composizione e delle caratteristiche organolettiche del vino, si esegue il travaso con due metodi diversi :  Travaso aperto o all’aria; il vino fuoriesce dal foro della spina e si raccoglie in un recipiente pulito. Questo metodo viene eseguito per i vini giovani che devono rifinirsi, per i vini non destinati all’invecchiamento o per quelli che hanno odori sgradevoli.  Travaso chiuso o fuori dal contatto con l’aria; viene fatto collegando un tubo al foro di uscita della spina in modo che il vino non entri a contatto con l’aria prima di essere stoccato 11
  • 13. in recipienti puliti. Questa pratica è messa in atto per i vini destinati all’invecchiamento o per i vini che hanno la tendenza ad ossidarsi. L’ultima fase è la conservazione e l’imbottigliamento che viene eseguita, previa filtrazione, per eliminare eventuali residui. 12
  • 14. 1.3 CLASSIFICAZIONE DEI VINI I processi descritti in precedenza sono le operazioni standard che generalmente si eseguono per trasformare l’uva in vino. Ovviamente, a seconda delle modifiche specifiche che ogni procedimento subisce, il prodotto finito avrà caratteristiche diverse. Ciò comporta che ci sia una classificazione dei vini non solo per far conoscere al consumatore le caratteristiche del prodotto ma anche per regolamentare dal punto di vista normativo la produzione di un determinato vino. Per questa ragione, a livello europeo, esiste una normativa (Reg. CE 479/08, legge quadro sull’OCM, attuata dai Reg. CE 606/09 e 607/09), che chiarisce l’importanza relativa delle varie denominazioni. Figura 1.4: Classificazione dei vini Ogni denominazione d’origine possiede dei regolamenti dettagliati detti disciplinari, che tutti i vini appartenenti alla categoria devono rispettare. In allegato sono riportati come esempio il disciplinare dei vini dell’Oltrepò Pavese e del vino Bonarda che è stato utilizzato, insieme al Barbera dell’Oltrepò pavese, durante le analisi svolte in laboratorio e su cui si basa il lavoro di ricerca trattato. 13
  • 15. 1.4 I VITIGNI In 7-8 mila anni di viticoltura sono state selezionate nel mondo circa 20.000 varietà di specie, molte delle quali esistenti ancora oggi, ma solo il 10-15% può essere considerato coltivato. La nostra penisola è un territorio che, per le sue caratteristiche territoriali e climatiche, ben si presta alla coltivazione di diverse cultivar. Le stime ipotizzano che in Italia esistono circa 2000 varietà di vite, molte più di quelle che sono coltivate in Francia. La ragione di ciò può derivare dal fatto che la nostra nazione si trova in una posizione geografica “privilegiata”, da sempre è stata una zona di passaggio di diverse popolazioni che hanno occupato e lasciato traccia nel nostro paese della loro cultura e tradizione (Antonaros A.,2000). L’uva è prodotta da piante appartenenti al genere Vitis. Sistematicamente la famiglia delle Vitacee appartiene al regno delle Plantae, Philum Magnoliophita, Classe Magnoliopsida, Ordine Rhamnales. Il genere Vitis è distinto in due sottogeneri: Euvitis le cui viti hanno un corredo cromosomico 2n=38 e Muscandinia con un corredo cromosomico 2n=40. Mentre il sottogenere Euvitis è stato trovato nei depositi del Terziario sia in Asia che nel Nord America, Muscandinia emerge soltanto tra i materiali fossili del nord America, il che suggerisce che questa divisione si sia verificata prima del Quaternario cioè circa due milioni di anni fa. Pare che la famiglia delle Vitacee sia comparsa sulla terra circa140 milioni di anni fa, ma in seguito alle glaciazioni molte specie di viti si estinsero. Si salvò Vitis vinifera nell’area pontica ( posta nel Caucaso tra il Mar Caspio e il Mar Nero) e oggi è coltivata in tutto il mondo. A sua volta essa si distingue in 2 sottospecie una coltivata chiamata Vitis sativa e una selvatica chiamata Vitis sylvestris. Il genoma di Vitis vinifera presenta un corredo cromosomico 2n=38 per un totale di 487 Mb equivalenti a circa 30.000 geni (Jaillon O. et al., 2007). Lo sviluppo negli ultimi decenni della scienza e tecnologia del DNA, affiancata all’ ampelografia, ha permesso di identificare con maggior precisione le diverse specie di viti. I marcatori che permettono di individuare il profilo genetico per ogni varietà sono i microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeats) (Sefe K.M. et al., 2001) , di cui 6 loci sono stati adottati dalla comunità scientifica internazionale. Questo ha permesso di tracciare geneticamente i vitigni e identificarli, in modo da sopprimere eventuali truffe nel mercato del vino. 14
  • 16. 1.4.1 CROATINA Alla base del vino Bonarda vi è il vitigno Croatina. Questo vitigno è coltivato nell’Oltrepò Pavese da parecchi secoli anche se i primi scritti riguardanti la Croatina risalgono alla seconda metà dell’Ottocento. Nelle ampelografie del secolo scorso, la si trova con il nome di Crovattina o Bonarda di Rovescala. Ne parlano noti ampelografi, come Demaria e Leardi nel 1875, Giuseppe Dei Conti di Rovasenda in un saggio del 1877 e Molon nel 1906. La sua etimologia deriverebbe da “croatta” – “cravatta” e starebbe a indicare che il vino ottenuto da Croatina si beveva nei giorni di festa, quando appunto veniva indossata la cravatta, è pur vero che il passaparola generazionale locale identifica questo vitigno come simbolo viticolo dell'Oltrepò Pavese. Il vitigno Croatina è a tutti gli effetti il vessillo della produzione vitivinicola dell'Oltrepò Pavese, diffuso in modo abbastanza omogeneo in tutto il territorio. Ben presente da tempo in molte colline oltrepadane, il vino ottenuto viene chiamato Bonarda fin dall'800. Alla fine del XIX secolo, dopo l'avvento della filossera, molti produttori preferiscono puntare nei reimpianti post-filosserici, sul vitigno Barbera, più costante e produttivo rispetto alla Croatina. Bisogna aspettare la fine del 1960 perché i produttori locali capiscano l'enorme potenzialità di questo vitigno, aiutati anche dalla ricerca e dalla sperimentazione che hanno individuato cloni di Croatina più consoni alle esigenze dei produttori. La sua notevole resistenza all'oidio favorì la diffusione in tutto l'Oltrepò e nel Novarese. Oggi la Croatina, che in passato veniva unita a Barbera e Freisa, ha acquisito, con l’evoluzione di metodi di coltivazione e delle tecniche di vinificazione, una maggiore importanza fino a diventare uno dei simboli indiscussi dell’enologia dell’Oltrepò Pavese. Figura 1.5: Grappolo di Croatina 15
  • 17. La Croatina è un vitigno a bacca nera, dalla foglia media o medio-piccola, allungata e pentagonale, quinquelobata o trilobata; il grappolo è grande, conico allungato, alato, di media compattezza; l’acino è medio, di forma sferoidale regolare, con buccia di colore turchino, spessa e coriacea, abbondantemente ricoperta di pruina. Ha una produzione abbastanza elevata ma altalenante, predilige terreni piuttosto profondi, franco-argillosi limosi o argillosi, calcarei (Somma G.,2008). Appartiene alla specie Vitis Vinifera Linneè e considerando i sei loci degli SSR-marker allelici che caratterizzano la cultivar a livello genetico, il profilo della Bonarda ricavato dal confronto con le 33 cultivar di riferimento codificati, è il seguente: SSR-marker VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 VrZAG62 VrZAG79 Alleli A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 Bonarda 139 151 238 238 247 249 190 195 186 196 245 245 16
  • 18. 1.4.2 BARBERA E' il nome di un vitigno piemontese coltivato per la maggior parte nella zona tra Asti e Casale Monferrato, ma anche largamente coltivato in molte zone lombarde con eguale successo. Il Barbera è identificato da Giuseppe Aldo di Ricaldone, studioso di antichi documenti del Monferrato, con un certo vitigno denominato “Berbexinis” citato in un atto del 1249, nel quale viene narrato che la Chiesa di Sant’Evasio di Casale affittò un terreno a tale Guglielmo Crova con l’obbligo di impiantarvi “bonis vitibus berbexinis”. Secondo altri studiosi, il nome Barbera deriva dalla trasformazione del lombardo “albéra” e del latino “albuelis” con accostamento al nome di luogo Barberi, frazione di Villafranca Sabauda in provincia di Torino. Il Barbera vanta citazione anche nei catasti di Chieri risalenti al 1500 (Cellino A., 2001), il vitigno è diventato nei tempi simbolo della viticoltura locale e ad oggi è uno dei vitigni più coltivati. Figura 1.6 : Grappolo di Barbera La varietà Barbera è caratterizzata da un vitigno di medio vigore che si esprime con produzioni abbondanti e vigorose. Il germoglio è ad apice espanso, verde chiaro quasi biancastro, parzialmente carminato, aracnoideo sugli orli, con foglioline apicali spiegate, poco tomentose sulla pagina superiore, con peli striscianti molto fitti su quella inferiore. La foglia adulta è media, pentagonale, quinquelobata, con seno peziolare a lira, per lo più chiuso, a volte con bordi sovrapposti. La pagina superiore è glabra, quella inferiore è tomentosa. Il grappolo è medio, molto spesso piramidale, più raramente cilindrico, compatto. L’acino è medio, ellissoidale, con buccia pruinosa, sottile, di colore 17
  • 19. blu intenso. La polpa succosa, dolce e acidula ma con un moderato contenuto di tannini..Anche questo vitigno predilige aree argillose e limi di pianalti terrazzati, nonchè quelle contraddistinte da marne argillose e sabbiose con la presenza minima di inclusi lapidei calcarei (Maffi Luciano, 2010). Appartiene alla specie Vitis Vinifera Linneè e considerando i sei loci degli SSR-marker allelici che caratterizzano la cultivar a livello genetico, il profilo della Barbera ricavato dal confronto con le 33 cultivar di riferimento codificati, è il seguente: SSR-marker VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 VrZAG62 VrZAG79 Alleli A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 Barbera 133 135 228 228 249 253 186 190 192 200 243 259 18
  • 20. 1.4.3 VINI ROSSI DOC: BARBERA E BONARDA Il disciplinare di produzione dei vini a denominazione di origine controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese, approvato con DPR 06/08/1970 pubblicato nella G.U. del 27/10/1970 e modificato con DM del 03/11/2011 (Allegato 2), impone che questo vino sia ottenuto da uve prodotte da vigneti aventi la seguente composizione ampelografica: - Croatina: dall’85% al 100% - Barbera, Ughetta (Vespolina), Uva rara: congiuntamente o disgiuntamente fino ad un massimo del 15% Le cui caratteristiche siano: - Colore: rosso rubino - Profumo: intenso e gradevole - Sapore: asciutto o abboccato o amabile, leggermente tannico a volte lievemente vivace - Titolo alcolometrico volumico totale minimo: 12,00% - Acidità totale minima: 4,50 g/l - Estratto non riduttore minimo: 20,00 g/l Il disciplinare di produzione dei vini a denominazione di origine controllata “Barbera dell’Oltrepò Pavese, approvato con DPR 06/08/1970 pubblicato nella G.U. del 27/10/1970 e modificato con DM del 03/11/2011 (Allegato 1), impone che questo vino sia ottenuto da uve prodotte da vigneti aventi la seguente composizione ampelografica: - Barbera: dall’85% al 100% -Altri vitigni a bacca rossa, non aromatici, idonei alla coltivazione nella Regione Lombardia: congiuntamente o disgiuntamente fino ad un massimo del 15% Le cui caratteristiche siano: - Colore: rosso rubino intenso, limpido, brillante - Profumo: vinoso, dopo invecchiamento, profumo caratteristico - Sapore: sapido, di corpo, leggermente tannico - Titolo alcolometrico volumico totale minimo: 11,00 % - Acidità totale minima: 4,50 g/l - Estratto non riduttore minimo: 20,00 g/l 19
  • 21. 1.5 ASPETTI SENSORIALI - colore, odore, gusto La valutazione sensoriale esiste da quando l’uomo ha cominciato ad utilizzare i propri sensi per determinare la qualità e la sicurezza dei cibi e delle bevande. La percezione della qualità di un prodotto è influenzata da molti fattori materiali e immateriali quali colore, odore, gusto, origine, materia prima, prestigio del produttore, prezzo, sicurezza, disponibilità. Essi determinano il profilo percepito dall’utilizzatore finale. Sono stati condotti studi dove viene dimostrato come l’impatto sensoriale abbia un ruolo rilevante nella scelta del prodotto da parte del consumatore. Questi tre aspetti, ovviamente, dipendono dalle interazioni chimico-fisiche che avvengono nel prodotto. 1.5.1 COLORE La visione cromatica di un oggetto dipende dalla sua composizione chimica, da come esso è in grado di assorbire e riflettere le diverse lunghezze d’onda della luce e dall’interpretazione da parte del cervello degli stimoli che riceve a partire dall’occhio. L’occhio umano è in grado di percepire le lunghezze d’onda che vanno da 380nm a 740nm (spettro del visibile). L’occhio umano infatti è caratterizzato da due tipi di fotorecettori: coni e bastoncelli contenuti nella tonaca nervosa o retina distinta in 2 strati, quello più esterno è lo strato pigmentato e quello interno e lo strato nervoso. Il primo ha il compito di assorbire la luce e interagire con i fotorecettori; il secondo elabora e integra le informazioni visive. I bastoncelli non permettono la discriminazione dei colori ma, sono soltanto sensibili alla luce e rendono possibile la visione in ambienti poco illuminati. I coni si differenziano in 3 tipi e la loro stimolazione in varie combinazioni permette la discriminazione dei diversi colori (Martini F.H. et al.,2010). Grazie agli enormi sviluppi nel campo della scienza e tecnologia, oggi è possibile valutare il colore in diversi modelli che rendono l’analisi del colore più oggettiva possibile. Ad esempio, il colore di un vino può essere valutato mediante uno spettrofotometro, sfruttando diversi valori di assorbanza; ciò permette di descrivere due parametri: la densità del colore del vino (WCD) e la sua tonalità (WCH). Tuttavia ci sono metodi più precisi che valutano il colore in una gamma spettrale più vasta, uno di questi è il CIElab che effettua una scansione da 400nm a 700nm. I valori dati da questo metodo permettono di discriminare le caratteristiche distintive di ogni varietà di vino, derivanti dalle pratiche di viticulture e fermentazione (Pèrez-Magarino S.et al.,2006)( Hermosìn Gutièrrez I. et al.,2005). 20
  • 22. 1.5.2 ODORE Il senso dell’olfatto è fornito da organi olfattivi localizzati nelle cavità nasali. Questi sono costituiti da un neuroepitelio specializzato (contenente i recettori olfattivi bipolari,cellule basali e di sostegno) e da una lamina propria contenente le ghiandole olfattive. Il sistema olfattivo è molto sensibile. Bastano infatti 4 molecole di una sostanza odorosa per attivare un recettore olfattivo. L’attivazione di una fibra afferente non garantisce però la percezione cosciente dello stimolo. Lungo le vie olfattive si verifica una notevole convergenza di fibre nervose afferenti e l’inibizione di alcune sinapsi coinvolte può impedire che gli stimoli raggiungano la corteccia cerebrale. La sensibilità olfattiva rappresenta l’unico tipo di impulso che raggiunge la corteccia cerebrale senza interruzioni sinaptiche nel talamo. Le numerosissime connessioni con l’ipotalamo e il sistema limbico rendono ragione della profonda componente emozionale e di particolari risposte comportamentali conseguenti alla percezione di determinati odori (Martini F.H. et al.,2010). La percezione degli odori avviene sulla sommità delle cavità nasali durante la fase di inspirazione oppure quando il vino viene gustato e introdotto all’interno della cavità orale, così l’odore risale nella cavità nasale (sensazioni retro nasali). Gli aromi e i profumi sono dovuti a composti chimici presenti a basse concentrazioni nel vino che, a temperatura ambiente, passano in fase di vapore e vengono percepiti. Uno stesso composto, in base alla concentrazione, può dare sensazioni diverse; per esempio a basse concentrazioni può suscitare sensazioni gradevoli e ad alte concentrazioni può dare sensazioni sgradevoli all’olfatto. Si parla di aroma primario quando l’origine degli odori deriva dall’uva. A questa categoria appartengono gli odori di frutta e fiori. Gli aromi dell’uva sono contenuti nelle foglie, polpa e buccia e in base al grado di maturazione dell’uva possono cambiare. Appartengono a questa categoria i terpeni e i derivati chetonici e aldeidici; essi reagiscono facilmente con l’ossigeno presente nell’aria e si convertono in composti meno odorosi. Si parla di aroma secondario quando l’odore si forma in seguito a processi fermentativi. Dipendono molto dal tipo di lievito utilizzato, dalla modalità fermentativa e dalla composizione del mosto. Essi derivano da sostanze proteiche presenti nell’uva e durante la fase di fermentazione si scindono in amminoacidi e successivamente in ammoniaca e alcoli. Inoltre, se la fermentazione è tumultuosa, l’anidride carbonica tende a fuoriuscire portando con sé le sostanze odorose facilmente volatili. Infine, nel caso in cui l’odore si forma durante la fase di invecchiamento del vino, si parla di aroma terziario o bouquet. In questo senso sono tipici gli odori della botte: vaniglia, legno, tostatura; derivano da processi di ossidazione, acetalizzazione, esterificazione e resinificazione. In fase di degustazione i vini si identificano secondo diversi parametri: finezza, intensità, armonia, durata, franchezza. 21
  • 23. 1.5.3 GUSTO Il gusto fornisce informazioni riguardo le sostanze liquide e solide che vengono ingerite. I recettori gustativi, chiamati “calici” sono distribuiti sulla superficie dorsale della lingua e su porzioni adiacenti di faringe e laringe. I calici si trovano lungo i lati di estroflessioni mucose definite papille. Ogni cellula gustativa mostra sottili microvilli che sporgono nei liquidi circostanti attraverso un’apertura detta “poro gustativo”. Il meccanismo di percezione è analogo a quello dell’olfatto, ovvero le sostanze chimiche disciolte a contatto con i peli gustativi producono uno stimolo che determina variazioni del potenziale transmembrana delle cellule gustative, che stimolate inducono potenziali d’azione nelle fibre afferenti. Le sensazioni gustative primarie sono: dolce, salato, amaro e aspro (Martini F.H. et al.,2010). Nel vino tutte queste sensazioni sono determinate da specifici composti chimici in grado di reagire con le proteine della saliva. Le sostanze responsabili della sensazione del dolce sono in primo luogo gli zuccheri e quindi gli alcoli. La seconda sensazione sapida è l' acidità. E’ necessario che un vino abbia una certa intensità di sapore acido, poiché essa da' la freschezza al vino. La terza sensazione gustativa è la sensazione di amaro. Le sostanze responsabili della sensazione di amaro nei vini normali, potrebbero essere i chinoni, cioè i prodotti dell'ossidazione delle sostanze fenoliche, ovvero i tannini e le materie coloranti. Come per l'acido, solo i sali producono la sensazione di salato, ma non tutti i sali la provocano. Esistono dei sali che danno la sensazione di dolce o di amaro. Nel vino, i sali non sono percepiti in quanto tali: la sensazione di salato è totalmente mascherata dall' alcol e da altre sostanze volatili. 22
  • 24. 1.6 – COSTITUENTI CHIMICI DEL VINO COINVOLTI NELL’ANALISI SENSORIALE Dal punto di vista chimico, il vino è una soluzione idroalcolica e acida complessa in cui sono presenti molte molecole di varia natura. La nostra conoscenza sulla natura chimica dell’uva e del vino ha avuto un notevole incremento a partire dalla fine degli anni ’60 ed è migliorata grazie all’avvento di nuove tecniche come la gascromatografia (GC),la spettrometria di massa (SM), la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia ad alta pressione (HPLC) che hanno permesso una migliore caratterizzazione non solo per quanto riguarda l’aspetto chimico ma anche per quanto riguarda l’aspetto sensoriale. Tuttavia è spesso difficile comprendere quali effetti avrà la composizione chimica su quest’ultimo aspetto, poiché i composti possono interagire tra di loro in svariati modi, influenzando diversamente la percezione sensoriale. Infatti solo raramente un particolare aroma del vino può essere ascritto a uno o pochi composti volatili. La concentrazione di alcuni di questi composti varia da 10-4 a 10-9 g/l e quindi è sotto la soglia umana di percezione sensoriale. Pertanto singolarmente non hanno alcun ruolo sensoriale ma in combinazione con altri possono conferire al vino delle caratteristiche tipiche di ciascuna varietà (Jackson R.S.,2000). Alcune di queste sostanze preesistono nel mosto, altre invece si originano dal processo fermentativo. Etanolo e alcoli superiori, acidi volatili (essenzialmente acido acetico), acidi (lattico, succinico, ecc..), aldeidi e CO2 sono presenti nel vino in seguito al processo di fermentazione attuato dal lievito. Tra le sostanze preesistenti troviamo: H2O, acidi fissi (tartarico, malico e citrico), polifenoli (tannini, antociani, ecc…), sostanze azotate (proteine, enzimi e nitrati), glucidi (esosi e pentosi), polisaccaridi (pectine), sostanze minerali (Sciancalepore V.,1998). Alcuni costituenti chimici dell’uva e del vino apportano un grande contributo all’aspetto sensoriale:  Zuccheri: sono caratterizzati dalla presenza di numerosi gruppi idrossilici, aldeidi e chetoni. Gli zuccheri semplici possono legarsi tra di loro per formare polimeri quali pectine, gomme, amidi, emicellulose e cellulosa, o con altri metaboliti secondari come lattoni e antociani, per formare glicosidi. Glucosio e fruttosio sono naturalmente presenti nell’uva e sono i principali zuccheri contenuti nel vino; essi vengono utilizzati dal lievito, durante il processo di fermentazione, con produzione di alcol. Gli zuccheri non fermentabili come arabinosio, ramnosio e xilosio,vengono chiamati “zuccheri residui”. Altri zuccheri come il riboso sono prodotti e rilasciati dalle cellule di lievito. 23
  • 25. Gli zuccheri sono responsabili della dolcezza dei vini; concentrazioni superiori a 0,2% sono generalmente richieste per generare una percepibile sensazione di dolcezza. Poiché la maggior parte dei vini da tavola ha un tenore di zucchero residuo inferiore a quello precedentemente indicato, essi generalmente tendono ad essere secchi. Quando la dolcezza si rileva nei vini secchi, di solito proviene dalla presenza di composti aromatici, in combinazione con il lieve sapore dolce dell’ etanolo e del glicerolo. A concentrazioni superiori allo 0,2%, gli zuccheri cominciano a mostrare un gusto dolce e contribuire sempre più alla sensazione di corpo.  Alcoli: sono composti organici contenenti uno o più gruppi idrossilici (-OH). Gli alcoli semplici contengono un solo gruppo –OH, i dioli e i polioli hanno rispettivamente due o più gruppi –OH. I fenoli hanno una struttura ad anello con sei atomi di carbonio contenenti uno o più gruppi idrossilici, ma la loro struttura chimica è così complessa da costituire un capitolo a parte. Dal punto di vista sensoriale, l’etanolo è il più importante alcol presente nel vino poiché in maggior quantità rispetto agli altri alcol. Esso è prodotto in piccole quantità nelle cellule dell’uva durante il processo di macerazione, invece la sua presenza nel vino è dovuta alla fermentazione attuata dal lievito. Nelle condizioni standard di fermentazione, esso può accumularsi fino al 15%. Più alti livelli di etanolo sono riscontrati quando si effettua un’aggiunta di zucchero durante la fermentazione. Oltre ai suoi notevoli effetti fisiologici e psicologici sull'uomo, l'etanolo è cruciale per la stabilità, l'invecchiamento, e le proprietà organolettiche del vino. Durante la fermentazione, l’incremento del contenuto di alcol limita la crescita di microrganismi. L’insensibilità del lievito agli alcoli, seppur sempre relativa, assicura che sia esso a dominare nel processo di fermentazione. Microrganismi che potrebbero produrre sgradevoli odori sono generalmente soppressi. Inoltre l'azione inibitoria dell’etanolo verso alcuni contaminanti del vino, combinata con l'acidità, permette alla bevanda di rimanere stabile per anni in assenza di aria. L’etanolo è anche importante perché agisce come solvente per l'estrazione di pigmenti e tannini durante vinificazione in rosso, influenzando i tipi e le quantità di composti aromatici prodotti. L'etanolo ha molteplici effetti sul gusto: esalta direttamente la dolcezza attraverso il proprio gusto dolce e modifica indirettamente la percezione di acidità. Ad alte concentrazioni, superiori al 14%, produce una sensazione di bruciore e può contribuire alla caratteristica di peso o corpo del vino; in particolare nei vini secchi può aumentare l'intensità di amarezza dovuta alla presenza di taluni polifenoli mentre diminuisce la sensazione di astringenza legata alla presenza di tannini. 24
  • 26. Viceversa, a basse concentrazioni (0.5-0.75%) esso aumenta il rilascio di alcuni composti aromatici. Insieme ad altri alcol reagisce con acidi organici per produrre esteri; può anche reagire con aldeidi e produrre acetali (Jackson R.S., 2000).  Alcoli superiori : rappresentano il 50% dei costituenti aromatici del vino, escludendo l’etanolo. Fanno parte di questo gruppo tutti gli alcol che hanno più di 2 atomi di carbonio. Alcuni di essi , come etil-1-esanolo, alcool benzilico, 2-feniletanolo, 3-ottanolo, e 1-octen3olo, provengono dall’uva; altri invece derivano dal processo di fermentazione attuato dal lievito. La loro sintesi è strettamente parallela alla produzione di etanolo. Quantitativamente i più importanti alcol superiori sono: 1-propanolo, 2-metil-1- propanolo (alcol isobutilico), 2-metil-1-butanolo e 3-metil-1-butanolo. Il 2-Feniletanolo è il più importante fenol-derivato degli alcoli superiori. Tutti questi apportano, in combinazione, una diversa caratteristica al vino e influenzano la sensazione di corpo. Gli alcoli superiori più comunemente presenti nel vino hanno un forte odore pungente. A basse concentrazioni (~0,3 g / l o meno), aggiungono complessità al bouquet. A concentrazioni più elevate, essi dominano sempre più il profumo (Jackson R.S., 2002).  Dioli e polioli: tra questi composti ritroviamo il 2,3-butilen-glicol che si forma dalla condensazione di due molecole di piruvato con la liberazione di due molecole di CO2, il quale non ha un forte odore ed è caratterizzato da un sapore lievemente dolce; per questi motivi non ha un significato sensoriale rilevante. Il glicerolo invece è il composto più presente dopo l’acqua e l’etanolo, ciò è rilevante dal punto di vista sensoriale. Il suo sapore è leggermente dolce ed è poco avvertito nei vini dolci, ma potrebbe giocare un ruolo più importante nei vini secchi, nei quali la sua concentrazione supera la soglia sensoriale di dolcezza. Alditolo, arabitolo, eritritolo, mannitolo e sorbitolo sono dei polialcol presenti nel vino a basse concentrazioni. Infezioni fungine o batteriche possono far aumentare la quantità di questi composti nel vino. Essi possono essere ossidati in aldeidi da alcune specie di batteri acetici; ciò può contribuire a dare un leggero effetto di corpo al vino (Jackson R.S.,2000).  Acidi: sono sostanze in grado di ionizzarsi e rilasciare ioni H+ in acqua. Prendendo in considerazione composti organici questa proprietà è associata ai gruppi carbossilici. Nel vino, il grado di ionizzazione dipende dal contenuto cationico, dal pH e dalle caratteristiche di ionizzazione dell’acido. Acido carbonico e acido solforico sono i principali acidi inorganici contenuti nel vino. Si parla di acidità volatile, in riferimento agli acidi che possono essere rimossi tramite distillazione del prodotto; negli altri casi si parla di acidità fissa. In combinazione esse 25
  • 27. costituiscono l’acidità totale del vino; quest’ultima può essere espressa in termini di acido tartarico, malico, citrico, lattico, solforico o acetico. L’acido acetico è un sottoprodotto del metabolismo del lievito ma si forma anche durante il processo di invecchiamento del vino nelle botti di rovere quando avviene l’idrolisi chimica dell’emicellulosa. Acido tartarico e malico sono presenti nell’uva in misura del 90% come acidità fissa e definiscono l’acidità nel vino. Il tipo di fermentazione che avviene nel vino ha degli effetti minimi sull’acidità totale, ma influenza molto il tipo di acidi che saranno presenti nel prodotto; ad esempio, se nel vino avviene la fermentazione malolattica, una parte di acido malico verrà trasformato in acido lattico. Altri acidi organici come l’acido citrico, isocitrico, fumarico, α cheto-glutarico, si possono trovare in piccolissime quantità nel vino e non hanno un valore rilevante per quanto riguarda l’aspetto sensoriale. La presenza di acido gluconico, glucuronico e galatturonico può invece essere associata ad un’infezione batterica dell’uva ma non ha nessun effetto sul sapore o l’odore; tuttavia possono avere un effetto sul colore e portare ad un imbrunimento del vino ( Jayaraman and Van Buren, 1972). Durante la fermentazione e l’invecchiamento, gli acidi sono coinvolti in reazioni che portano alla formazione di esteri, ciò spesso conferisce un profumo fresco-fruttato ai vini. Gli acidi fenolici sono sintetizzati nell’uva o dalle cellule del lievito attraverso la via dell’acido shikimico; essi danno un sapore leggermente amaro al vino. Figura 1.7: acido shikimico Più in generale gli acidi risultano dare un gusto fresco al palato, che diventa aspro se sono in eccesso, e riduce quella sensazione di dolcezza percepita. Oltre ad avere un ruolo nel mantenimento di un basso valore dei livelli di pH, gli acidi influenzano il colore soprattutto nei vini rossi. Infatti in queste condizioni gli antociani subiscono dei cambiamenti che portano il viraggio del colore alla lunghezza d’onda del blu. L’acidità determina la ionizzazione di composti fenolici. La forma ionizzata dei fenoli può essere più facilmente ossidata. Di conseguenza, i vini con un pH tra 3-4 sono molto sensibili alla ossidazione e ciò comporta la perdita del loro aroma fresco e di un vivace colore (Singleton, 1987). Gli acidi inoltre permettono la precipitazione di proteine e pectine che 26
  • 28. altrimenti potrebbero offuscare il vino; tuttavia un effetto di opacità potrebbe esser dato dalla solubilizzazione di ioni ferro e rame. Bassi valori di pH migliorano anche le proprietà antimicrobiche degli acidi grassi, i quali sono più tossici nella loro forma indissociata.  Pectine, gomme e relativi polisaccaridi: sono lunghe catene ramificate di polimeri che si trovano all’interno delle cellule vegetali in cui svolgono un’azione strutturale. Queste sostanze sono estratte durante le operazioni di pigiatura e pressatura dell’uva. I polisaccaridi, in presenza di alcoli, formano colloidi complessi e tendono a precipitare. Essi ostacolano la chiarificazione del vino poichè inibiscono la precipitazione di altri materiali colloidali, come tannini e proteine; la loro incidenza sulle proprietà sensoriali del vino non è stata adeguatamente studiata, ma è comunemente ritenuto essere trascurabile.  Sostanze minerali: sono sostanze che danno generalmente un’impronta salata e acida al vino. Variano da 2 a 4 g/l e sono sali degli acidi minerali e di qualche acido organico; per esempio il bitartrato di potassio ha insieme un sapore acido e salato. 27
  • 29. CAPITOLO 2 : I POLIFENOLI I composti polifenolici sono responsabili di importanti caratteristiche sensoriali del vino quali il colore, l’astringenza e l’amaro. Essi vengono estratti dalle diverse parti dell’acino d’uva durante la vinificazione e, poiché sono substrati di un gran numero di reazioni chimiche, subiscono diverse variazioni di struttura nel corso dell’affinamento e dell’invecchiamento del vino, modificandone le caratteristiche organolettiche. Pertanto la stima della quantità e della qualità dei polifenoli dell’uva, che possono essere estratti durante la vinificazione, ed anche la conoscenza della ripartizione di questi composti tra bucce e vinaccioli possono aiutare l’enologo ad impostare in maniera ottimale la vinificazione in rosso. Nelle uve rosse le ricerche condotte sui componenti del colore hanno evidenziano i seguenti fatti: - nei vini giovani partecipano al colore gli antociani e i tannini; - gli antociani che possiedono gruppi ossidrilici (OH) in posizione orto e para hanno un’azione antiossidante naturale trasformandosi in ortochinoni. Per questo i vini rossi sono in parte protetti dalle ossidazioni, poiché gli antociani reagiscono con l'ossigeno rallentando l'ossidazione degli altri composti. Nel corso della conservazione e dell'invecchiamento gli antociani tendono a scomparire per idrolisi degli eterosidi e/o in seguito a combinazioni con tannini con i quali formano dei copolimeri stabili, che provocano il viraggio del colore verso una tinta arancio mattone ,caratteristica del vino invecchiato. Il termine fenoli o polifenoli si riferisce ad una famiglia di composti organici, della quale fanno parte circa 5000 molecole, che presentano un anello benzenico sostituito da uno o più gruppi idrossilici (-OH ). Come indica il nome, essi sono caratterizzati dalla presenza di molteplici gruppi fenolici associati in strutture più o meno complesse. Il fenolo è il più semplice composto esistente della propria classe, quella dei composti aromatici derivati dal benzene che recano un gruppo ossidrile (-OH) direttamente legato all’anello aromatico (Paronetto, 1979). Figura 2.1: Fenolo La loro reattività è dovuta all’acidità caratteristica della funzione fenolica ed alla nucleofilicità dell’anello benzenico. 28
  • 30. I fenoli sono particolarmente importanti nei prodotti ortofrutticoli dove ne determinano colore e sapore. In particolare viene associato agli acidi fenolici il sapore acidulo, ai tannini l’astringenza, mentre il sapore amaro è spesso associato ad alcuni flavonoidi quali naringenina e neoesperidina, il colore, infine, viene determinato dalla presenza degli antociani e dalle loro caratteristiche reazioni di copigmentazione. Il contenuto dei composti fenolici nei tessuti vegetali varia in funzione della specie, della varietà, dell’organo considerato, dello stadio fisiologico e delle condizioni pedoclimatiche. I composti fenolici si accumulano, in genere, in tutti gli organi della pianta (radici, steli, foglie, fiori e frutti), tale accumulo si realizza in maniera specifica nei vari tessuti a seconda dei vari generi di pianta, con la maggior parte dei fenoli presenti negli strati epidermici e subepidermici dei vari tessuti. In generale, si può affermare che, ad eccezione della lignina, i composti fenolici si accumulano preferenzialmente negli organi aerei della pianta (steli, foglie, fiori e frutti) piuttosto che nelle radici. Questa localizzazione preferenziale viene messa in relazione con l’effetto induttore della luce sul metabolismo fenolico, nonchè con il ruolo protettivo esercitato dai composti fenolici nei confronti delle radiazioni ultraviolette. 2.1 BIOSINTESI Nelle specie di Vitis vinifera, i fenoli sono sintetizzati a partire dalla via biosintetica dei fenilpropanoidi (L. Federico Casassa et al.), pertanto sono derivati da tirosina o fenilalanina. La struttura, come viene evidenziato dal nome, è caratterizzata da un'unità fenilica (C6) legata a un'unità proprionica (C3) (Hahlbrock K. et al,1989). Il metabolismo dei fenilpropanoidi, derivati dall’acido shikimico, prevede una serie di reazioni che portano alla formazione di derivati dell’acido cinnamico (principalmente acidi idrossicinnamici e cumarine). Gli enzimi coinvolti in questo pathway biosintetico sono: la fenilalanina ammonio liasi (PAL) e la tirosina ammonio liasi (TAL); il primo deamina la L-fenilalanina e forma così quantità equimolari di acido trans-cinnamico e ione ammonio. Quest’ultimo verrà incorporato dalla glutammina sintasi (GS) nella glutammina e successivamente in glutammato via glutammina2ossiglutarato ammidotrasferasi (GOGAT); il secondo enzima provvede, analogamente al primo, alla deaminazione della tirosina con formazione dell’acido trans-p-cumarico. Il glutammato così formato funge da donatore di azoto nella biosintesi degli amminoacidi aromatici, fenilalanina e tirosina. Dopo la deaminazione dell’amminoacido, si susseguono una serie di sostituzioni sull’anello aromatico, idrossilazioni e metossilazioni, che portano alla formazione dei vari derivati dell’acido 4-idrossicinnamico (acido p-cumarico). L’acido p-cumarico, a sua volta, viene convertito nel suo corrispondente derivato attivato, il p-cumaroil-coenzima A tioestere, ad opera di una 29
  • 31. idrossicinnamato: CoA-ligasi (4CL). Il derivato attivato dell’acido p-cumarico, oltre che da prodotto finale del metabolismo fenilpropanoidico, funge da precursore nella biosintesi di altri composti fenolici (vedi fig 2.2) Figura 2.2: Metabolismo fenilpropanoidico e principali strutture derivate dagli acidi cinnamici La struttura di base di tutti i flavonoidi è C6-C3-C6, composta da una unità C6 (anello A) a da una unità C6-C3 (anello B ed atomi di carbonio 2, 3 e 4). Il primo anello è il risultato della condensazione testa-coda di 3 unità acetato; l’anello B, con gli atomi di carbonio 2, 3, e 4, viene fornito da un derivato dell’acido cinnamico. A partire da malonil-CoA e p-cumaroil-CoA (derivato attivato dell’acido p-cumarico), un enzima catalizza la formazione dello scheletro C15 dei flavonoidi. In una reazione catalizzata da acetil-CoA carbossilasi (ACC) a partire da acetil-CoA e CO2 si forma maloni-CoA; il p-cumaroil-CoA e gli analoghi esteri idrossicinnamici del CoA vengono forniti invece dal metabolismo fenilpropanoidico. La calcone sintasi (CHS) è l’enzima chiave nella biosintesi dei flavonoidi poiché catalizza la condensazione in più stadi di tre unità acetato, derivanti da malonil-CoA, con un opportuno derivato attivato dell’acido cinnamico, normalmente il p-cumaroil-CoA, con conseguente formazione di un calcone, 4,2’,4’,6’tetraidrossicalcone, dal quale si originano tutte le strutture dei flavonoidi; mentre la CHI catalizza la ciclizzazione del calcone in maniera stereospecifica con conseguente formazione del flavanone (Li Fey al, 2006). Negli stadi successivi della biosintesi calconi, flavanoni, diidroflavonoli e flavan-3,430
  • 32. dioli fungono da precursori nella biosintesi degli antociani, mentre i pathways che portano alla formazione di flavoni e flavonoli rappresentano delle ramificazioni degli stadi iniziali della biosintesi dei flavonoidi. Successivamente una reazione catalizzata dall’enzima calcone isomerasi (CHI) porterà ad una conversione stereospecifica del calcone a 2S-flavanone (naringenina, liquiritigetina) determinando la struttura tipica dei flavonoidi. La biosintesi degli isoflavoni, flavoni, diidroflavonoli e flavan-4-oli sfrutta come intermedio la naringenina (un 5-idrossiflavanone); la liquiritigenina (un 5-deossiflavanone) funge invece da precursore nel pathway degli isoflavoni. A partire da questi flavanoni, e in seguito a varie reazioni in cui intervengono diversi enzimi, si ha la formazione di altri composti:  Flavonoidi, derivati da una reazione catalizzata dalla flavone sintasi I che richiede come cofattori il 2-ossiglutarato, Fe++ ed ascorbato e dalla flavone sintasi II che richiede NADPH ed ossigeno molecolare. Grazie all’azione di questi due enzimi si ha la formazione di un doppio legame tra il C2 e il C3.  Diidroflavonoli, derivati da una reazione catalizzata dalla flavanone-3-idrossilasi (FHT), anch’essa è una diossigenasi 2-ossiglutarato-dipendente, che determina l’idrossilazione del flavanone sul C3.  Flavonoli e Flavan-3, 4-dioli (leucoantocianidine), sintetizzati a partire da diidroflavonoli, che fungono da substrati diretti in una reazione catalizzata da una flavonolo sintasi (FLS), ancora una diossigenasi 2-ossiglutaratodipendente. Le leucoantocianidine sono formate , in seguito all’intervanto di una diidroflavonolo-4-riduttasi (DFR) che utilizza NADPH come cofattore e determina una riduzione stereospecifica in posizione 4 dei diidroflavonoli. La flavanone-4-riduttasi (FNR) catalizza la riduzione NADPH-dipendente del gruppo carbonilico in posizione 4 del flavanone con conseguente formazione dei flavan-4-oli, un tipo di leucoantocianidine, che costituiscono i precursori immediati di apigeninidina e luteolinidina, delle 3-deossiantocianidine rispettivamente di colore giallo-arancio e aranciorosso.  Catechine (flavan-3-oli),proantocianidine (dimeri ed oligomeri di flavan-3-oli), derivati delle leucoantocianidine e prodotte in seguito ad una reazione di riduzione in posizione 4 della leucoantocianidina catalizzata da una leucoantocianidina-4-riduttasi (LAR).  Antocianidine, anch’esse derivate dalle leucoantocianidine per azione di una diossigenasi che introduce un doppio legame tra il C2 ed il C3 della leucoantocianidina. Il composto risultante, il 2-flaven-3,4-cis-diolo può isomerizzare a formare un composto termodinamicamente più stabile, il 3-flaven-2,3-diolo, che probabilmente si disidrata 31
  • 33. spontaneamente formando l’antocianidina. Segue una glicosilazione in posizione 3 dell’antocianidina che rende più stabile la molecola. Figura 2.3 - Schema della biosintesi dei polifenoli. 32
  • 34. 2.2 DEGRADAZIONE La quantità e la qualità dei composti fenolici che si trovano nelle cellule vegetali subisce delle variazioni durante il ciclo di crescita della pianta. Questo dipende non soltanto da fenomeni di tipo catabolico, ma anche dalle relative velocità dei processi di sintesi e turnover. Pertanto, il metabolismo fenolico all’interno della pianta deve essere visto come un sistema dinamico che coinvolge delle concentrazioni di equilibrio dei prodotti finali dei vari step metabolici. Il turnover dei composti fenolici viene determinato da quattro tipi di reazioni:  reazioni di interconversione coinvolte nei processi di biosintesi nel corso dei quali un particolare composto, che apparentemente sembra accumularsi in quantità apprezzabili, funge da intermedio biosintetico.  reazioni di coniugazione imporanti in quanto alterano le proprietà chimico-fisiche (solubilità, valori di pK) e fisiologiche (attività biologica, trasporto attraverso cellule e membrane) delle molecole.  reazioni cataboliche atte a degradare i composti fenolici attraverso una serie di reazioni che vanno dall’ossidrilazione, alla O- ed N-dealchilazione, allarottura dei legami C-C, all’idrolisi ed alla fissione dell’anello aromatico.  reazioni ossidative che portano alla formazione di polimeri insolubili ad elevato peso molecolare 33
  • 35. 2.3 CLASSIFICAZIONE In base alla loro struttura, i polifenoli sono classificati in due gruppi: 1. NON FLAVONOIDI 2. FLAVONOIDI Del primo gruppo fanno parte l’acido benzoico,l’acido cinnamico e i loro derivati (tabella 1). Essi sono esterificati con zuccheri, alcoli vari, o acidi organici. Esteri di questi acidi possono migliorare il colore del vino rosso formando copigmenti insieme alle antocianine. Acido o-idrossibenzoico Composti derivati R1 R2 Acido pirocatechico Acido gallico Acido vanillico Acido siringico H OH H OCH3 OH OH OCH3 OCH3 Acido p-cumarico Acido caffeico Acido ferulico OH OH OH H OH OCH3 Acido cinnamico Tabella 1 : Alcuni composti derivati dall’acido o-idrossibenzoico e dell’acido cinnamico. L’acido gallico e l’acido vanillico sono i composti idrossibenzoici maggiormente presenti e studiati per la loro distribuzione nel mondo vegetale. L’ acido gallico è, insieme all’acido ellagico, il monomero base per la formazione dei tannini idrolizzabili. Gli acidi idrossicinnamici sono fenilpropanoidi derivanti dall’acido p-cumarico (o pidrossicinnamico). Sono comuni in natura quattro varianti della loro formula di base C6-C3: l’acido caffeico, cumarico, ferulico e sinapico. Si trovano nel regno vegetale legati chimicamente ad altri composti. Gli acidi idrossicinnamici svolgono, nelle piante, azione antibiotica e varie funzioni biologiche connesse all’inibizione della crescita e della germinazione. Il secondo gruppo, quello dei flavonoidi, include generalmente dei composti la cui struttura comune è data da uno scheletro chimico, detto scheletro flavonico, che è costituito da un anello benzopiranico, unito a due anelli aromatici fenilici ( Figura 2.4 ). 34
  • 36. Figura 2.4: Struttura generica di un flavonoide Essi possono trovarsi in forma libera o possono legarsi ad altri flavonoidi, zuccheri o non flavonoidi. I diversi sostituenti ossidrilici o chetossilici nelle diverse posizioni degli anelli fenilici, come detto in precedenza, danno luogo a svariati flavonoidi, i quali possono avere funzioni diverse anche se differiscono della posizione di un solo sostituente chimico o di un tipo di legame. Figura 2.5 : Strutture di diversi flavonoidi Le specie di flavonoidi che si ritrovano maggiormente nel vino, e che sono quindi importanti per reazioni e proprietà sensoriali, sono le antocianine, i flavanoli ed i flavonoli; in minore quantità sono invece presenti altri composti appartenenti alla stessa famiglia, i flavanonoli e i flavoni. 35
  • 37. Sulla base del peso molecolare, le sostanze fenoliche si possono distinguere in composti a basso peso molecolare, a peso intermedio e ad alto peso molecolare (Tabella 2). Peso molecolare Struttura Classe fenolica C6-C1 Acidi idrossibenzoici C6-C3 Acidi idrossicinnamici Intermedio C6-C3-C6 Flavonoidi Alto (C6-C1)n Tannini idrolizzabili (C6-C3-C6)n Tannini condensati Basso Es. PM acido gallico: 170,92 PM da 600 a 3500 Tabella 2: Classificazione dei composti fenolici in base al peso molecolare. Le sostanze polifenoliche sono localizzate principalmente nelle parti solide del grappolo cioè nelle bucce, nei vinaccioli e nei raspi solo una minor parte è localizzata nella polpa. Tuttavia non provengono solamente dal frutto, poiché molti fenoli e relativi derivati sono anche prodotti in seguito al metabolismo del lievito; ad esempio la produzione di Tirosolo contribuisce ad avere un gusto amaro nel vino. Questo è particolarmente evidente nei vini spumanti poiché il livello di tirosolo aumenta considerevolmente durante la seconda fermentazione in bottiglia, caratteristica della maggior parte dei vini spumanti (Jackson R.S., 2002). I polifenoli sono responsabili del colore, del gusto e dell’aroma del vino. Durante il periodo di maturazione dell’uva, in particolare nelle varietà a bacca rossa, è possibile osservare un cambiamento della colorazione dovuto alla perdita di clorofilla e ad un accumulo di fenoli. La quantità totale di polifenoli nell’uva dipende dal vitigno, dalle condizioni climatiche e da fattori ambientali (Di Stefano, 1996a e 1996b). Il contenuto medio di polifenoli negli acini è 4 g/Kg nei vitigni bianchi e 5,5 g/Kg nei vitigni rossi; di cui il 65% situato nel vinaccioli, il 30% nelle bucce e il restante 5% nella polpa (Y.Margalit, 2005). La loro presenza nel vino invece dipende dalla vinificazione, cioè il processo di trasformazione biochimica durante il quale si ha la trasformazione dell’uva in vino; ma è soprattutto la fase della 36
  • 38. macerazione a contribuire alla presenza dei polifenoli nel vino. Durante questa fase, in cui le bucce sono mantenute a contatto con il mosto per un periodo di tempo variabile, i composti fenolici vengono trasferiti al vino conferendo ad esso un particolare colore e sapore.. Il contenuto di polifenoli nei vini rossi (di cui l'80-90% sono flavonoidi) è in media 1500 mg/l, variando tra i limiti di 1 e 2 g/l come GAE (equivalenti di acido gallico, che è la molecola polifenolica con la maggiore concentrazione nel vino). I vini rosati possono contenerne 400-800 mg/l, dei quali il 40-60% sono flavonoidi; infine nei vini bianchi si trovano dai 100 ai 400 mg/l . Figura 2.6: Contenuti fenolici in uve bianche e nere. La solubilità della componente fenolica dipende dalla durata della fermentazione, aumenta progressivamente nel corso di questo processo, poiché favorita dalla presenza di alcol (soprattutto di etanolo), dall’acidità del mosto, dall’innalzamento della temperatura, dalla presenza di SO2 e CO2 (la quale aumenta la permeabilità delle cellule della buccia). Di conseguenza, non vi è alcun mezzo semplice di predeterminare il livello di fenoli estratti durante la fermentazione (Jackson R.S.,2000). Il risultato finale dell’estrazione fenolica è quindi uno dei parametri più variabili che si hanno se prendiamo in considerazione tutti i costituenti del vino e anche durante il processo di invecchiamento tende a subire delle notevoli variazioni difficili da prevedere. 37
  • 39. 2.4 IMPORTANZA DEI POLIFENOLI NEL VINO La diversa composizione polifenolica di ogni vino, ci permette di caratterizzarli e assegnare loro delle particolari qualità. Analizzare tutte le componenti che interagiscono nel vino e che definiscono le sue proprietà organolettiche, gustative, olfattive e visive richiede degli studi approfonditi. Ancora oggi sono in atto delle ricerche che mirano a caratterizzare qualitativamente una tipologia di vino in base alle reazioni che avvengono tra le componenti durante i processi di produzione e stoccaggio. Il controllo delle qualità organolettiche del vino richiede lo studio delle interazioni tra sostanze volatili e polifenoli (Dufour C. and Bayonove C. L., 1999). E’ stato già detto in precedenza che i polifenoli apportano un contributo di primaria importanza in questo campo. In riferimento a questo, svariate classi di polifenoli possono esser citate . 2.4.1 ANTOCIANI Sono pigmenti idrosolubili che si trovano nelle foglie, fiori e frutti, che ne determinano la loro colorazione. Gli antociani esistono in natura sotto la forma di antocianina (glucoside), in quanto le antocianidine (aglicone) sono sempre esterificate da una o più molecole di zucchero; ciò conferisce loro stabilità contro l’ossidazione enzimatica e consente una maggiore solubilità in acqua, facilitando così l’estrazione durante il processo di macerazione (Alcalde-Eon C. et al.,2007). Le antocianine sono costituite da due anelli benzenici uniti mediante un anello eterociclico e presentanti a seconda dell’antociano, varianti ai vertici degli anelli benzenici o dell’anello eterociclico. I gruppi sostituenti sono -OH in posizione 3, 5, 7. Gli agliconi presentano ai vari vertici, dei gruppi ossidrilici (OH) e talvolta anche gruppi metossilici (-OCH3) ed in base alla loro posizione deriva l’esistenza, di sei agliconi: cianidina, delfinidina e pelargonidina presentanti solo gruppi ossidrilici; malvidina, petunidina e peonina presentanti anche gruppi metossilici. Figura2.7: Strutture di varie antocianidine 38
  • 40. I vini rossi prodotti con uve provenienti da Vitis vinifera L., sono composti per la maggior parte da antocianine monomeriche 3-O-monoglucoside. L’idrossolazione dell’anello B delle antocianine può avere un effetto diretto sulla stabilità del colore, determinata dall’effetto della delocalizzazione degli elettroni all’interno della struttura della molecola. Per esempio, le antocianine con più sostituenti idrossilici sull’anello B possono contribuire allo sviluppo del colore blu, mentre una maggior metossilazione dell’anello B favorisce il prevalere del colore rosso (Tseng K.C. et al.,2005) Il colore delle antocianine può variare in base al ph del mezzo in cui si trovano, alla temperatura, alla quantità di anidride solforosa libera all’interno del vino e al legame con diversi ioni metallici. In condizioni acide prevale la forma cationica flavilio, mentre se il pH aumenta, si incrementa anche la porzione delle antocianine in forma chinoidale di colore blu-violetto (Cheynier V. et al., 2006) 2.4.2 FLAVANI Hanno formula C6-C3-C6 con l’eterociclo ossigenato dal pirano. Si distinguono in flavan-3-oli o catechine e flavan-3,4-dioli o leucoantocianidine. A differenza degli antociani, le catechine non sono legate a molecole glucidiche e non hanno gruppi metossili come sostituenti dell’anello B. I flavan-3-oli costituiscono il gruppo di flavonoidi più diffusi nel mondo vegetale. Si trovano nella parte solida dell’uva (buccia, semi e steli) in forma monomerica o polimerica. Le unità fondamentali di tali composti sono quattro monomeri: catechina, epicatechina, gallocatechina ed epigallocatechina. Poiché gli atomi di carbonio in posizione 2 e 3 sono asimmetrici, presentano 4 forme otticamente attive e 2 forme racemiche (Fig. 2.8). Figura 2.8: Strutture catechina,gallocatechina ed epicatechina 39
  • 41. Queste molecole, in soluzione acquosa, sono insapore e incolore; si ossidano facilmente e nel vino portano ad un imbrunimento del colore e conferiscono un sapore astringente. Nei leucoantociani, l’idrossile in posizione 4 conferisce a questi delle proprietà molto diverse dalle catechine: mentre le catechine, riscaldate in ambiente acido subiscono condensazione e danno luogo a flobafeni di colore rosso bruno insolubile, i leucoantociani attraverso la stessa reazione producono antociani. 2.4.3 ACIDO GALLICO L'acido Gallico o acido triidrossibenzoico è un acido organico, solubile in acqua, contenuto in molti prodotti di origine vegetale. E’ presente nelle foglie e nelle bucce di molti frutti tra cui l’uva. È comune nelle specie vegetali legnose, presente in forma solubile come estere dell'acido chinico o legato a glucosio nei gallotannini. Esteri di acido gallico, come i tannini, catechine gallati e gallati alifatici sono potenti antiossidanti in vitro. L'acido gallico infatti sembra avere attività antiossidanti, antitumorali e attività antiangiogenica in vitro . I semi d'uva e le bucce sono buone fonti di sostanze fitochimiche come acido gallico, catechina e l'epicatechina e sono materie prime adatte per la produzione di integratori alimentari antiossidanti (Yilmaz Y et al., 2004). Figura 2.9 : Struttura acido gallico 40
  • 42. 2.4.4 TANNINI I tannini comunemente riscontrati nel vino sono di due tipi:  Tannini idrolizzabili che vengono distinti in gallotannini, la cui idrolisi acida o alcalina libera acido gallico, ed elagitannini la cui idrolisi acida libera acido ellagico.  Tannini condensati a cui appartengono anche i tannini dell’uva , detti anche tannini proantocianidici, la cui idrolisi acida libera un’antocianina. I tannini idrolizzabili possiedono numerosi gruppi –OH suscettibili ad essere ossidati e quindi hanno un forte potere antiossidante nei confronti di altre molecole presenti nel mezzo. I tannini condensati sono costituiti da catene di flavan-3-olo originate dal legame C4-C6 o C4C8,oppure per la formazione di un ponte etile derivante dall’ossidazione dell’alcol etilico in aldeide acetica. In seguito all’ossidazione del gruppo fenolico si ha la trasformazione di funzioni alcoliche in funzioni chetoniche, ciò comporta la diminuzione dell’elettronegatività della molecola, quindi la diminuzione della reattività dei tannini con le proteine e l’abbassamento della sensazione di astringenza. Questo accade, ad esempio, nella maturazione ossidativa del vino in barrique o durante la maturazione in presenza di microssigenazione. Per quanto riguarda le reazioni dei tannini con le proteine è stato appurato che la carica elettronegativa globale di un tannino proantocianidico è più alta nel caso di un pentamero piuttosto che di un dimero. I tannini a basso peso molecolare sono più acidi e meno astringenti al gusto, mentre i pentameri avranno un carattere più astringente. I tannini ellagici solitamente sono meno astringenti di quelli gallici e raramente giocano un ruolo significativo nella qualità sensoriale del vino (Pocock et al., 1998). Più grandi sono i polimeri tannici, minore sarà la capacità di reagire in modo efficace con i recettori del gusto o le proteine della saliva. I tannini infatti hanno la capacità di sottrarre liquido alla bocca facendola rimanere asciutta poiché si legano con le glicoproteine della saliva, ad esempio la mucina, facendole precipitare e dando origine ad una formazione flocculare che fa perdere il potere lubrificante della saliva. Questi polimeri insapore si formano lentamente durante l'invecchiamento, ciò spiega la progressiva riduzione della rugosità di vini rossi. Infatti se essi precipitano, il sedimento generato può essere percepito in bocca solo quando è risospeso in seguito ad agitazione. Di solito la presenza nel vino di gallotannini ed elagitannini deriva dal legno delle botti in cui viene riposto il vino. I tannini condensati invece provengono da vinacce, vinaccioli e bucce (Pastor del Rio et al., 2006) e si estraggono mediante macerazione; questi sono maggiormente presenti nei vini rossi giovani . 41
  • 43. Dalla polimerizzazione di catechina e leucocianidina si forma una classe di polimeri chiamati procianidine. Sebbene le procianidine siano presenti nell’uva sottoforma di monomeri, esse nel vino tendono a polimerizzare e assumere la forma di tannini responsabili della sensazione di astringenza del vino. Dal punto di vista chimico e sensoriale , antociani e proantocianidine giocano un ruolo fondamentale nel definire la qualità del vino e contribuiscono alle caratteristiche sensoriali soprattutto sulla stabilità del colore. Durante la conservazione e l'invecchiamento del vino rosso, proantocianidine e antociani reagiscono con altri costituenti; ciò porta alla formazione di pigmenti più stabili che sono responsabili di variazioni nel gusto e di cambiamenti nel colore. Infatti il colore del vino rosso, durante il suo invecchiamento, vira dalla tonalità viola-rosso tipico dei vini giovani a quella di un rosso mattone caratteristico dei vini più vecchi (Jackson R.S., 2000) . 42
  • 44. 2.5 POLIFENOLI E SALUTE Molte piante sintetizzano questi composti per soddisfare varie necessità fisiologiche: la propria difesa contro parassiti, agenti tossici, condizioni ambientali, raggi ultravioletti; l'attrazione degli impollinatori (gli antociani e i flavonoidi); il supporto strutturale (tannini); la regolazione mediante fitormoni (flavonoidi ed altre sostanze fenoliche semplici). Queste funzioni avvengono a spese del metabolismo primario delle piante (accrescimento e riproduzione) in quanto parte degli assimilati sono destinati allo svolgimento delle suddette attività (metabolismo secondario). Una funzione particolarmente importante del metabolismo secondario è la protezione da stress ossidativi e le piante che hanno uno spiccato metabolismo secondario sono tendenzialmente più ricche in sostanze antiossidanti. I fenoli sono i più noti tra gli antiossidanti idrofili. Il vino rosso è una significativa fonte naturale di polifenoli e un moderato consumo giornaliero contribuisce all’apporto di circa un grammo di polifenoli (Soleas G. J. et al., 1997). I polifenoli possiedono innumerevoli attività biologiche: svolgono un’attività antibatterica e di protezione contro la fragilità capillare, diminuiscono l'incidenza di malattia coronarica, riducono l’aggregazione piastrinica (Burns J. et al, 2000), forniscono una protezione anti-cancerogena (Frankel E.N. et al.,1998), hanno capacità antiossidante in vivo (Wang J. et al, 2006) e in vitro (Fernández-Pachón M.S. et al., 2004) ( Cimino F. et al., 2007). Diversi studi sulle componenti fenoliche dei vini rossi hanno dimostrato che esse possono prevenire l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDL) (Frankel, E.N. et al.,1993) contrastando le reazioni chimiche provocate da diverse molecole, fra cui l’ossigeno che è responsabile della formazione dei radicali liberi ovvero di sottoprodotti derivati dal metabolismo aerobico cellulare. Questi ultimi sono sostanze chimiche altamente instabili molto dannose per l’organismo in quanto possono accelerare i processi di invecchiamento cellulare, attivare processi infiammatori , avere effetti cancerogeni e favorire l’aterosclerosi (Taverne Y.J. et al., 2013). L’associazione degli antiossidanti del vino rosso con particelle di LDL potrebbe influenzare la loro resistenza alla modificazione ossidativa. È stato ipotizzato che gli effetti protettivi avvengono a diversi livelli; infatti i fenoli sono antiossidanti a funzioni multiple:  possono chelare metalli di transizione o ioni, quali ferro e rame, diminuendo la loro partecipazione nella generazione di radicali liberi ( Brown et al.,1998). 43
  • 45.  possono agire come agenti riducenti, antiossidanti donatori di idrogeno, quenchers di ossigeno. L’attività antiossidante dei composti fenolici è dovuta alla presenza di gruppi idrossilici legati alle strutture aromatiche ed alla geometria della molecola. La delocalizzazione rende molto più acido l'idrogeno fenolico di uno alcolico (pKa 9, 9 contro 1618), e rende le posizioni orto e para più reattive alla sostituzione elettrofila. Le condizioni fondamentali affinché sia esplicata l’attività antiossidante sono: la presenza degli antiossidanti in basse concentrazioni, rispetto al substrato di ossidazione, per ritardare o prevenire l’autossidazione o l’ossidazione mediata da radicali (Halliwell e Gutteridge, 1990) e la formazione di radicali fenolici stabili attraverso la delocalizzazione elettronica sulle strutture aromatiche ed alifatiche. La configurazione idrossilica dell’anello B è significativamente determinante per l’azione scavenging nei confronti dei ROS e degli RNS (specie reattive dell’azoto). Gli idrossili di tale anello cedono idrogeno, o un elettrone, ai radicali idrossilici, perossilici e perossinitriti stabilizzandoli, e trasformandosi a loro volta in un radicale flavonoide relativamente stabile. Gli ossidrili presenti sull’anello A hanno un’attività antiossidante decisamente più blanda rispetto a quelli dell’anello. Anche l’eterociclo contribuisce all’attività antiossidante per la presenza di un -OH libero in posizione 3, e perché permette la coniugazione tra i due anelli aromatici A e B. Non è essenziale, ai fini dell’attività antiossidante, la presenza dell’eterociclo chiuso, dato che i calconi (appartenenti alla famiglia dei flavanoni) mostrano comunque una spiccata attività antiossidante. L’angolo di torsione dell’anello B, rispetto al resto della molecola, condiziona le proprietà di “free radical scavenger”. La planarità permette una migliore delocalizzazione elettronica e, di conseguenza, una maggior stabilità del radicale fenossilico dei flavonoidi. La differente attività antiossidante, tra flavonoidi poliidrossilati e polimetossilati, è da attribuirsi fondamentalmente alle differenze di planarità e di idrofobicità delle molecole stesse. Ad esempio, la quercetina è uno dei più efficienti scavenger di radicali perossilici, ma le sue forme metilate e glicosilate sono molto meno potenti (Ioku et al.,1995). Gli agliconi sono degli antiossidanti più potenti dei loro corrispettivi glucosidi; infatti, come la metossilazione, la glicosilazione interferisce con la planarità della molecola e la capacità di delocalizzazione degli elettroni. 44
  • 46. Un altro fattore che influenza l’attività antiossidante è il grado di polimerizzazione della molecola. Tuttavia,alcuni studi hanno dimostrato che anche se le procianidine tetramere sono più potenti dei trimeri, dimeri e monomeri nei confronti dello ione perossinitrito e superossido, solo le procianidine dimere e trimere sono molto resistenti all’idrolisi acida dello stomaco e, quindi, assorbibili dall’organismo umano nella loro forma originale. Anche le proprietà chelanti dei flavonoidi e dei tannini contribuiscono al loro potere antiossidante. I punti di attacco degli ioni metallici sono l’o-diidrossi nell’anello B nelle posizioni 3’ e 4’, e la struttura carbonilica in posizione 4 con l’-OH in posizione 3. I flavonoidi inibiscono il danno ossidativo rimuovendo e neutralizzando gli ioni ferro. La chelazione dello ione bivalente non necessariamente neutralizza il flavonoide che può mantenere la propria attività scavenger nei confronti dei ROS. Riassumendo si può dire che i fenoli sono donatori effettivi di idrogeno; in particolare, sono molto attivi, in questo senso, i flavonoli come la quercetina (Rice-Evans et al., 1995), i flavanoli come gli esteri dei catechin-gallati (Salah et al., 1995), le antocianine del vino (Frankel et al., 1993). 45
  • 47. CAPITOLO 3 : LA CROMATOGRAFIA La cromatografia è una tecnica analitica che, mediante un metodo fisico di separazione, permette di frazionare una miscela nei suoi componenti sfruttando la differente distribuzione fra le due diverse fasi messe a contatto, una fase fissa o stazionaria e una fase mobile. Nel 1903 divenne un'importante tecnica d’analisi grazie ai lavori svolti un botanico italo-russo, Semenovich Tswett (1872-1919). Egli riuscì a separare la clorofilla da un estratto vegetale (Gruenwedel D.W. e Whitaker, 1987) con il metodo di adsorbimento su colonne. Una colonna di vetro venne riempita con particelle di carbonato di calcio in polvere e alla sua sommità pose una piccola quantità di estratto di foglie verdi. Fece poi colare, attraverso la colonna, dell’etere di petrolio. Quest’ultimo, scorrendo nella colonna, permetteva la separazione del campione in bande di diverso colore. Ognuna procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità, separando così le diverse molecole. Con questo esperimento egli creò le basi della moderna cromatografia. Da allora questa tecnica è stata profondamente modificata e si è dimostrata non solo un valido strumento di analisi qualitativa, e talora quantitativa, nel caso di miscele di composti tra loro chimicamente molto simili, ma anche un mezzo per purificare determinati composti o per isolare molecole. 3.1 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE CROMATOGRAFICHE Le numerose varianti di cromatografia possono essere classificate seguendo vari criteri. In base allo stato di aggregazione della fase mobile distinguiamo:  La cromatografia in fase gassosa, detta anche gascromatografia (GS) , in cui la fase stazionaria può essere solida (cromatografia gas-solido) o liquida (cromatografia gas- liquido).  La cromatografia in fase liquida (LC),che a seconda dello stato della fase stazionaria si differenzia in cromatografia liquido-solido e cromatografia liquido-liquido; la fase mobile quindi è sempre un liquido.  La cromatografia in fase supercritica in cui la fase mobile è un fluido supercritico e le fasi stazionarie sono le stesse usate in GC e HPLC. La cromatografia di ripartizione è di gran lunga la tecnica più impiegata in HPLC. In questo tipo di cromatografia la fase stazionaria (considerata liquida, ma legata covalentemente ad una matrice di silice tramite i gruppi Si-OH del supporto) e quella mobile hanno differente polarità ed i composti vengono più o meno trattenuti in funzione dei loro diversi coefficienti di distribuzione nelle due 46
  • 48. fasi. Esistono due tipi principali di cromatografia di ripartizione, che si differenziano per la relativa polarità della fase stazionaria e della fase mobile; a seconda che si operi con fase stazionaria polare e fase mobile non polare o viceversa, distinguiamo:  Cromatografia a fase normale; la fase stazionaria è polare mentre la fase mobile è apolare. i diversi componenti di una miscela vengono quindi eluiti in ordine di polarità crescente.  Cromatografia a fase inversa; essa è costituita da una fase mobile polare solitamente miscele di acqua o tamponi con solventi polari come metanolo,aceto nitrile o tetraidrofurano. La fase stazionaria invece è non polare ed è costituita ad esempio da idrocarburi a catena lunga legati ad un supporto di silice. I primi composti ad essere eluiti saranno quelli più polari e successivamente quelli meno polari. 47
  • 49. 3.2 PRINCIPIO FISICO DELLA CROMATOGRAFIA I differenti componenti di una miscela migrano in una fase stazionaria sotto l’influenza di una fase mobile, la quale ha il compito di trascinarli. In base alla loro diversa affinità per la fase mobile o per quella stazionaria, i vari componenti della miscela si spostano lungo la colonna con velocità diverse, determinate dagli equilibri cui prendono parte le specie: ciò fa sì che essi siano eluiti dalla colonna in tempi diversi e risultino così separati. La velocità di migrazione di ciascun soluto è determinata dal rapporto tra i tempi che esso trascorre nelle due fasi e quindi dal suo rapporto di distribuzione. La distribuzione per ciascun componente X lungo la colonna può essere espressa dal seguente equilibrio: Ogni componente della miscela si ripartisce tra le due fasi con un diverso coefficiente di ripartizione (Kd), e i diversi componenti si separano mediante migrazione differenziale. Il coefficiente di ripartizione è dato dal rapporto tra la concentrazione che una certa molecola ha nella fase A e la concentrazione che essa ha nella fase B: Kd = CACB Il componente che si associa più fortemente con la fase stazionaria è quello che si muove più lentamente nella direzione del flusso della fase mobile. Le forze che sono alla base di questi fenomeni sono le stesse che danno luogo a interazioni attrattive tra le molecole: interazioni elettrostatiche, ione-dipolo e dipolo-dipolo, legami idrogeno, forze di van der Waals. Il tempo impiegato da ciascuna sostanza per uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione (TR); è tanto maggiore quanto più elevata è l’affinità della sostanza per la fase stazionaria e può essere sfruttato per identificare un componente della miscela. Il tempo morto (tM) è invece il tempo che impiega la fase mobile per passare attraverso la colonna ovvero il tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile. La relazione tra la costante e i parametri del picco è espressa dall’equazione fondamentale della cromatografia: VR= VM+ KdVS dove 48
  • 50. VR= volume di ritenzione di una data sostanza VM= volume morto (o volume della fase mobile) VS = volume della fase stazionaria Quest’ultima variabile, a differenza di VR e VM , non è misurabile facilmente per cui rende difficile il calcolo di Kd a partire dal cromatogramma. Si preferisce quindi fare riferimento al fattore di ritenzione (K) espresso come rapporto delle moli di analita presenti nella fase stazionaria (nS) e quelle presenti nella fase mobile (nM), ovvero: k = nS/nM Si può dimostrare che questo parametro è determinabile da valori del cromatogramma secondo la relazione: K= tR-tM / tM Con opportune sostituzioni si arriva alla formula seguente: K = t’R / tM L'equazione in questa forma risulta molto più semplice da applicare in quanto la differenza tra tempo di ritenzione e tempo morto, ed il tempo morto stesso sono direttamente ricavabili dal cromatogramma. Anch’esso dipende dalla temperatura e dalla coppia delle fasi in uso ma anche 49
  • 51. dalle caratteristiche dell’impaccamento e dallo spessore della fase stazionaria. Figura 3.1: Efficacia della separazione su colonna cromatografica tra una coppia di composti Buone separazioni si hanno se la prima sostanza eluita ha K superiore a 1.Quando esso è minore di 1, l’eluizione è così veloce che la determinazione accurata del tempo di ritenzione è molto difficile. Invece elevati fattori di ritenzione (maggiore di 20), fanno sì che l'eluizione richieda un tempo molto lungo e si potrebbe verificare un’eccessiva dispersione (picchi troppo appiattiti). Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabile, deve avere una buona risoluzione. Per risoluzione si intende un parametro che mette in relazione l'efficienza, la selettività ed il fattore di ritenzione.  Selettività (α): indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse con velocità tali che escano separate dalla colonna. Per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono quindi essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversa devono avere tempi di ritenzione diversi. Da un punto di vista matematico, la 50
  • 52. selettività è definita come il rapporto tra i fattori di ritenzione di due diverse sostanze (A e B) dello stesso cromatogramma, con kA < kB. La selettività verso due sostanze di un sistema cromatografico viene espressa quindi dal cosiddetto fattore di separazione : α= KBKA = tRB-tMtRA-tM La selettività dipende dal meccanismo della separazione cromatografica ma non dalle caratteristiche costruttive e deve essere maggiore di 1,2. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro. Avere una buona selettività non basta. Infatti, anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongano fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie vengano eluite con la stessa velocità, in modo che la banda all'interno della colonna cromatografica sia più stretta possibile. La capacità di formare picchi molto stretti è data dall’ efficienza della colonna. La larghezza alla base del picco (wb), che in genere è diversa per ogni specie chimica in un dato sistema cromatografico, dipende proprio da questo fattore. L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna, si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici (N). Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria; sostanzialmente un piatto teorico è la più piccola “fetta” della colonna in cui due molecole dotate di diverso coefficiente di ripartizione hanno la possibilità di dimostrare diverse velocità di migrazione. L’efficienza di una separazione dipende quindi da quanti piatti teorici sono presenti nella colonna: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul cromatogramma. Il numero dei piatti teorici di una colonna cromatografica è ricavabile da: N = 16 (tR/wb)2 mentre facendo riferimento al tempo di ritenzione corretto, si definisce il numero dei piatti effettivi : Neff = 16 (t’R/wb)2 E’ importante precisare che N non è un parametro caratteristico per una data colonna, poiché dipende anche dalla sostanza eluita. 51
  • 53. A parità di lunghezza una colonna sarà più efficiente se l’altezza equivalente al piatto teorico è minore e quindi aumenta il numero dei piatti teorici: Heff = L/Neff dove L è la lunghezza della colonna. 52
  • 54. 3.3 HPLC L’HPLC (High Performance Liquid Chromatography) cromatografia liquida ad alta prestazione o cromatografia liquida ad alta pressione (High Pressure Liquid Chromatography), è uno strumento analitico derivato dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi. Figura 3.2: Schema di un HPLC Il campione da analizzare è iniettato, utilizzando una siringa, attraverso un apposito iniettore detto “loop”; nella fase di iniezione, la valvola viene girata, piazzando il loop carico all’interno del circuito dove passa l’eluente, cosicché il campione raggiunge rapidamente la testa della colonna dove è "spinto" nella fase stazionaria dalla fase mobile. Può essere presente anche una pre-colonna che permette di eseguire una filtrazione per evitare di danneggiare la fase stazionaria della colonna. La pre-colonna più piccola è posta in serie, contiene lo stesso tipo di fase stazionaria della colonna ma con una dimensione delle particelle più grande, allo scopo di eliminare le impurezze grossolane e le particelle insolubili contenute nel campione da analizzare. La colonna, la cui lunghezza varia solitamente da 10 a 30 cm e il diametro interno da 4 a 10 mm, contiene la fase stazionaria all’interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall’eluente. 53
  • 55. La forza che permette all’eluente di scorrere nella colonna è data dalla pressione, molto alta (dell’ordine di centinaia di atm), che è applicata da una pompa in testa alla colonna e forza la fase mobile a scorrere all’interno della fase stazionaria. La separazione dei componenti avviene tramite interazioni che si creano fra i costituenti della miscela e le due fasi. Nel caso in cui si opera in isocratica, ossia usando un eluente la cui composizione non vari durante l'analisi, é sufficiente una sola pompa, mentre nel caso in cui si opera a gradiente, è necessario usare due pompe per mescolare i solventi ed inviarli alla colonna ad un valore controllato di pressione. Le condizioni operative, in questo caso, verranno programmate in anticipo mediante il software dello strumento. Dopo la pompa è posto un flussometro che permette di regolare la quantità di eluente che, nelle condizioni d’esercizio scelte, sarà immesso nella colonna. L’intero sistema opera a pressioni molto elevate e i materiali sono tali da sopportare senza problemi le condizioni di utilizzo. Alla fine della colonna è applicato un rilevatore e un calcolatore che permettono una analisi del materiale in uscita dalla colonna. I rilevatori possono essere di diverso tipo a seconda delle proprietà chimiche che si intendono sfruttare nell’analisi. L’utilizzo di un rilevatore rispetto ad un altro, può facilitare l’isolamento e il dosaggio di un prodotto chimico. Quando il rivelatore registra il passaggio di una sostanza eluita, elabora i dati registrando i risultati su un cromatogramma che presenterà un picco più o meno alto a seconda della concentrazione della sostanza. Oltre che considerazioni quantitative, dal cromatogramma si possono trarre anche considerazioni qualitative in base ai diversi RT in cui compaiono i picchi, poiché ogni molecola ha un tempo di ritenzione differente. 54
  • 56. CAPITOLO 4: SCOPO DEL LAVORO Lo studio è stato effettuato nel periodo di tirocinio svolto presso il laboratorio Riccalab di Riccagioia S.C.P.A., Centro di Ricerca Formazione e Servizi della Vite e del Vino. Questo laboratorio lavora da molti anni nel settore enologico ed è accreditato alla norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005; è autorizzato dal ministero delle politiche agricole ad emettere certificati chimici sui vini destinati alla DOC e all’esportazione. La maggior parte dei vini analizzati e avviati alla DOC dal 1992 ad oggi provengono dall’Oltrepò Pavese. Le analisi condotte sui parametri di base dei vini: Titolo alcolometrico, Glucosio, Fruttosio, Estratto secco non riduttore, Acidità totale e volatile, Anidride solforosa totale, hanno dimostrato che durante questi anni ci sono state evoluzioni delle caratteristiche chimiche dei due vini oggetto del presente studio, Bonarda e Barbera. Tuttavia si può notare che, nel periodo compreso tra il 1992 e il 2004, i due vini hanno avuto un andamento analogo a dimostrazione di quanto i due vini siano sovrapponibili a livello commerciale. Da sempre infatti questi due vini si sono collocati nella stessa fascia di mercato. A titolo di esempio è mostrato un grafico dell’andamento del titolo alcolometrico presente nei vini analizzati in questo intervallo di tempo. Figura 4.1: grafico dei Vini Bonarda analizzati dal 1992 al 2004. Sull’asse delle ascisse è rappresentato il grado alcolometrico e sull’asse delle ordinate la percentuale dei campioni analizzati. 55
  • 57. Figura 4.2: grafico dei Vini Barbera analizzati dal 1992 al 2004. Sull’asse delle ascisse è rappresentato il grado alcolometrico e sull’asse delle ordinate la percentuale dei campioni analizzati. L’osservazione diretta delle centinaia di vini analizzati in laboratorio, ha permesso di evidenziare che il parametro sensoriale del colore mostra differenze in quanto il Bonarda ha una colorazione tendente al rosso porpora, il Barbera mostra una colorazione tendente al rosso rubino intenso, limpido e brillante. Questo è indice di differenze nella composizione chimica, probabilmente nella composizione di polifenoli e antociani. L’analisi delle differenze in questo campo è stata condotta nel lavoro di tesi “ Vini rossi DOC dell’Oltrepò pavese: studio del colore” di Vincenzo Zaccaria, dove si affronta un’analisi statistica multivariata sui parametri chimici di base per le analisi Doc, sull’analisi colorimetriche e sull’analisi di alcuni metalli. Per avere ulteriori informazioni riguardo questo argomento e cercare di perfezionare le valutazioni date in precedenza, nel presente lavoro abbiamo effettuato analisi più dettagliate in HPLC dei due vini (Method OIV-MA-AS315-11 -Type II method) con lo scopo di individuare tra polifenoli e antociani possibili analogie o differenze. Inizialmente il confronto è stato effettuato tra vini Bonarda e Barbera commerciali, successivamente questi sono stati confrontati con dei vini Bonarda ottenuti in cantine sperimentali solamente 56
  • 58. utilizzando uva Croatina e con i Barbera in purezza ottenuti da sola uva Barbera. Ciò ha permesso di escludere contributi non quantificabili provenienti da altre tipologie di uva ammesse in quote minori. 57
  • 59. 4.1 MATERIALI E METODI In questo studio sono stati analizzati in totale 108 campioni di vino Bonarda e Barbera DOC provenienti da diverse zone dell’Oltrepò Pavese. Lo studio è stato compiuto eseguendo un’analisi cromatografica condotta impiegando un sistema HPLC MERK HITACHI serie L, modulare, con pompa L-600 e detector UV-VISIBILE L-4200, fornita di integratore D-2500. La separazione cromatografica è stata condotta su colonna Purospher Star RP-18 encapped 5µm, mediante eluizione in gradiente, come riportato in tabella 1, e utilizzando una fase mobile binaria costituita da acido formico al 10% e da aceto nitrile in soluzioni acquose. Tutti i campioni presi in esame nella sperimentazione sono stati eluiti nelle stesse condizioni di temperatura e pressione, utilizzando la stessa fase eluente e un detector UV-VISIBILE impostato a 278nm per l’analisi dei principali polifenoli e a 516nm per l’analisi dei principali antociani. Sono stati analizzati: - N° 7 campioni di Bonarda in purezza analizzati a una lunghezza d’onda di 516 nm e 278nm; - N° 1 campione di Barbera in purezza analizzato a una lunghezza d’onda di 516 nm e 278nm; - N° 28 campioni di Bonarda DOC dell’Oltrepò Pavese analizzati ad una lunghezza d’onda di 516nm e 278nm; - N° 30 campioni di Barbera DOC dell’Oltrepò Pavese analizza ad una lunghezza d’onda di 278nm di cui solo 16 analizzati anche a 516nm; Il metodo d’analisi che si è scelto di seguire è quello contemplato nel COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS-OIV dedicato all’analisi delle principali antocianine presenti nei vini rossi (Method OIV-MA-AS315-11 -Type II method). Tale metodo prevede l’analisi a 516nm delle antocianine, ma utilizzando le stesse condizioni operative è stata ripetuta la cromatografia a una lunghezza d’onda di 278nm per evidenziare l’eventuale presenza di polifenoli, rilevabili e separabili con la colonna Purospher Star RP-18 encapped 5µm . 58
  • 60. 4.2 PROCEDURA 4.2.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE I vini sono stati filtrati, utilizzando un filtro di carta, e iniettati nell’iniettore dello strumento. 4.2.2 ANALISI Le analisi in HPLC sono state effettuate nelle seguenti condizioni:  Loop di iniezione a volume fisso: 20 µl  Flusso: 0,8 mlminuto  Temperatura: ambiente  Run time: 45 minuti  Post time: 5 minuti  Detection: mediante detector UV-VISIBILE a 516nm e 278nm tempo (minuti) 0 15 30 35 41 Solvente A % 94 70 50 40 94 Solvente B % 6 30 50 60 6 Tabella 1 : programma di eluizione in gradiente  Soluzione A : miscela di acqua, acido formico e aceto nitrile in proporzione 87:10:3 (vv)  Soluzione B : miscela di acqua, acido formico e aceto nitrile in proporzione 40:10:50 (vv) 59
  • 61. 4.2.3 LA COLONNA CROMATOGRAFICA La colonna utilizzata per le analisi è una Purospher Star RP-18 encapped 5µm. Le colonne HPLC sono realizzate in modo da resistere alle pressioni molto alte a cui sono sottoposte e inoltre devono permettere un’eluizione accettabile nel tempo. Di seguito è riportata la scheda illustrativa della colonna che è stata utilizzata per le analisi. ® Specification of Purospher STAR RP-18 endcapped Sorbent characteristics High purity silica with polymeric C18 modification and endcapping Metal content Na, Ca, Mg, Al: 1 ppm; Fe: 3 ppm Particle shape Spherical Particle size 2 µm, 3 μm and 5 μm Pore size 120 Å (12 nm) Pore volume 1.1 mL/g Spec. surface area 330 m²/g Carbon load 17 % C Coverage of the surface 3 μmol/m² pH range pH 1.5 - 10.5 Efficiency 5 μm: > 90.000 N/m; 3 μm: > 130.000 N/m, 2 µm > 180.000 N/m Shipping eluent Acetonitrile/Water Fig 4.3: Scheda illustrativa della colonna fornita da Merkmillipore 60
  • 62. Le piccole dimensioni delle particelle consentono un equilibrio più rapido dei soluti tra fase stazionaria e fase mobile, abbassando l’altezza del piatto teorico e quindi aumentando la risoluzione. La rigidità delle particelle è invece essenziale per resistere alle alte pressioni utilizzate. 61
  • 63. 4.2.4 STANDARD Ove disponibili, sono stati utilizzati standard per l’analisi dei composti chimici da riconoscere. Per la rilevazione di Acido Gallico e Catechina sono stati utilizzati standard già presenti in laboratorio. E’ stato possibile eseguire delle curve di taratura, sia per Acido Gallico che per la Catechina, e i picchi presenti sul cromatogramma sono stati identificati registrando i tempi di ritenzione degli standard e dei relativi prodotti. La curva di taratura ricavata con uno standard interno ha permesso di determinare la concentrazione di Acido Gallico nei vini. Nelle prove effettuate non è stato possibile identificare e dosare i picchi relativi alla Catechina poiché erano presenti in pochi campioni e in concentrazioni minime. Per la rilevazione di Malvidina, Peonidina e Cianidina, non avendo la possibilità di utilizzare degli standard, sono state utilizzati i dati sperimentali riportati nella tesi: ”Vino spumante cruasè DOCG: studio dei fenomeni di adsorbimento degli antociani da parte dei lieviti vinari” di Alessandra Baldi, effettuando un confronto per il riconoscimento dei picchi corrispondenti agli antociani citati e osservando i tempi di ritenzione riportati nel lavoro di tesi, dal momento che si sono utilizzate la stessa procedura analitica e le stesse condizioni strumentali nei due elaborati e che i lavori sperimentali si sono svolti entrambi in un periodo di tempo di pochi mesi. 62
  • 64. 4.2.5 CURVE DI TARATURA Le curve di taratura di Malvidina, Peonidina e Cianidina calcolate in un precedente lavoro di tesi svolto nelle stesse condizioni operative ed utilizzate come riferimento nel presente lavoro sono le seguenti:  Malvidina 2500000 y = 43015x + 64837 R² = 0,9819 2000000 1500000 Serie1 Lineare (Serie1) 1000000 500000 0 0 10 20 30 40 50 60 Figura 4.4: Curva di taratura della Malvidina. Sull’asse delle ascisse è rappresentata la concentrazione dello standard in mg/l; sull’asse delle ordinate sono rappresentate le aree dei picchi. Il grafico sopra riportato evidenzia una retta di equazione y=43015x+64837 e coefficiente di correlazione R2 = 0,9819. E’ stata ottenuta utilizzando una soluzione Standard alle seguenti concentrazioni: - 5 mg/l - 10 mg/l - 25 mg/l - 50 mg/l 63
  • 65.  Peonidina 1600000 y = 54558x - 1630 R² = 0,9998 1400000 1200000 1000000 800000 Serie1 600000 Lineare (Serie1) 400000 200000 0 -200000 0 5 10 15 20 25 30 Figura 4.5: Curva di taratura della Peonidina. Sull’asse delle ascisse è rappresentata la concentrazione dello standard in mg/l; sull’asse delle ordinate sono rappresentate le aree dei picchi. Il grafico riporta una retta di equazione y=54558x-1630 e coefficiente di correlazione R2=0,9998. E’ stata ottenuta utilizzando una soluzione Standard alle seguenti concentrazioni: - 25 mg/l - 2,5 mg/l - 1,67 mg/l - 0,25 mg/l 64
  • 66.  Cianidina 700000 y = 56852x + 3447,2 R² = 0,9956 600000 500000 400000 Serie1 300000 Lineare (Serie1) 200000 100000 0 0 2 4 6 8 10 12 Figura 4.6: Curva di taratura della Cianidina. Sull’asse delle ascisse è rappresentata la concentrazione dello standard in mg/l; sull’asse delle ordinate sono rappresentate le aree dei picchi. La curva di taratura della Cianidina è determinata dall’equazione y=5685x+ 3447,2 e coefficiente di correlazione R2 = 0,9998. E’ stata ottenuta utilizzando una soluzione Standard alle seguenti concentrazioni: - 10 mg/l - 2 mg/l - 1 mg/l - 0,1 mg/l 65
  • 67.  Acido Gallico E’ stata effettuata una curva di taratura utilizzando uno standard di Acido Gallico in tre concentazioni note differenti: - 10 mg/l - 20mg/l - 100mg/l L’equazione della curva di taratura è : y=38822x-15400 e mostra un coefficiente di correlazione R2 =1 standard acido gallico 4500000 y = 388322x - 15400 R² = 1 4000000 3500000 3000000 standard acido gallico 2500000 2000000 Lineare (standard acido gallico) 1500000 1000000 500000 0 0 5 10 15 Figura 4.7: Curva di taratura dello standard di Acido Gallico. Sull’asse delle ascisse è rappresentata la concentrazione e sull’asse delle ordinate le aree dei picchi. 66
  • 68.  Catechina Per la curva di taratura della Catechina sono state utilizzate delle concentrazioni note crescenti dello standard: - 10mg/l - 20mg/l - 50mg/l L’equazione della retta è: y=86925+3346 e il coefficiente di correlazione R2 = 1 standard catechina 5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 y = 86925x + 3346 R² = 1 standard catechina Lineare (standard catechina) 0 20 40 60 Figura 4.8: curva di taratura dello standard di Catechina. Sull’asse delle ascisse è rappresentata la concentrazione e sull’asse delle ordinate le aree dei picchi. 67
  • 69. CAPITOLO 5: RISULTATI E CONCLUSIONE 5.1 CROMATOGRAFIA CON DETECTOR A λ=516nm Per le analisi cromatografiche è stato applicato il metodo ufficiale per quanto riguarda le impostazioni strumentali, adattando i tempi di ritenzione degli antociani a quelli effettivi, misurati sulla colonna utilizzata nel corso della sperimentazione, mediante confronto con standard di Cianidina, Peonidina e Malvidina, già utilizzate nella tesi: ”Vino spumante cruasè DOCG: studio dei fenomeni di adsorbimento degli antociani da parte dei lieviti vinari” di Alessandra Baldi. Dal confronto dei tempi di ritenzione relativi allo standard della Cianidina, è stato possibile identificare sul cromatogramma di ogni vino preso in esame, il picco corrispondente al suddetto composto. Inoltre, utilizzando l’equazione della curva di taratura ottenuta analizzando lo standard in concentrazioni differenti, è stato possibile calcolare la concentrazione di Cianidina presente in ogni campione analizzato. npr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Area Cianidina (mAU/min) Bonarda commerciali 78246 2326 3650 470356 147418 160036 168126 173708 1892 1510 35297 11501 6022 9910 22390 170963 8964 3282 2003 Conc. (mg/l) Cianidina Bonarda commerciali Area Cianidina (mAU/min) Barbera commerciali 1,37 0,03 0,05 8,26 2,58 2,80 2,95 3,04 0,02 0,02 0,61 0,19 0,09 0,16 0,38 3,00 0,15 0,05 0,02 688811 126343 242737 5956 25193 12123 26162 6091 8729 7116 17311 5373 22219 14514 34016 Conc. (mg/l) Cianidina Barbera commerciali 12,05 2,16 4,20 0,04 0,38 0,15 0,39 0,04 0,09 0,06 0,24 0,03 0,33 0,19 0,53 Area Cianidina (mAU/mim) Bonarda puro 30893 37696 24214 73127 72585 25455 Conc. (mg/l) Cianidina Bonarda puro 0,53 0,65 0,41 1,28 1,27 0,44 Area Cianidina (mAU/min) Barbera Puro 9776 Conc. (mg/l) Cianidina Barbera Puro 0,11 Tabella 1: Aree dei picchi corrispondenti alla Cianidina e relative concentrazioni in mg/l presenti nei campioni di Barbera Doc e Bonarda Doc analizzati. 68
  • 70. Nel seguente Istogramma di frequenza sono stati rappresentati sull’asse delle ascisse gli intervalli di concentrazione di Cianidina e sull’asse delle ordinate le percentuali riscontrate nei vini analizzati. % campioni analizzati cianidina 100 50 % bonarda commerciale 0 da 0 a 1 % barbera commerciale da 1 a 2 da 2 a 3 da 3 a 4 % bonarda puro da 4 a 5 >5 concentrazione cianidina (mg/l) Figura 5.1: Concentrazione Cianidina nei campioni analizzati. Come si evince dal grafico, il 63% dei vini Bonarda Doc commerciali, l’80% dei vini Barbera Doc commerciali e il 67% dei vini Bonarda in purezza presentano delle concentrazioni inferiori a 1mg/l di Cianidina. Purtroppo non è stato possibile calcolare la concentrazione di questo composto in tutti i campioni analizzati in quanto assente o presente in tracce trascurabili. 69
  • 71. La seguente Tabella mostra le aree dei picchi, presenti nel cromatogramma, corrispondenti alla Peonidina e le relative concentrazioni che è stato possibile calcolare nei vini analizzati. npr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Area Peonidina (mAU/min) Bonarda commerciali 1213 138529 2637 4328 10944 6906 6352 5940 9051 232466 65636 2285472 1896364 24213 262442 290244 119683 Conc. (mg/l) Peonidina Bonarda commerciali 0,05 2,56 0,07 0,10 0,23 0,15 0,14 0,13 0,19 4,29 1,23 41,92 34,78 0,47 4,84 5,34 2,22 Area Peonidina (mAU/min) Barbera commerciali Conc. (mg/l) Peonidina Barbera commerciali 51402 6260 242445 39712 18728 99321 79286 494021 269640 191053 10982 0,97 0,14 4,47 0,75 0,37 1,85 1,48 9,08 4,97 3,53 0,23 Area Peonidina (mAU/min) Bonarda puro 102462 68148 221805 129505 233994 259285 Conc. (mg/l) Peonidina Bonarda puro 1,90 1,27 4,09 2,40 4,31 4,78 Area Peonidina (mAU/min) Barbera Puro 92010 Conc. (mg/l) Peonidina Barbera Puro 1,71 Tabella 2: Aree dei picchi corrispondenti alla Peonidina e relative concentrazioni in mg/l presenti nei campioni di Barbera Doc e Bonarda Doc analizzati 70
  • 72. Nella figura 5.3 è possibile notare invece che per quanto riguarda la concentrazione di Peonidina il 27 % dei vini Bonarda in purezza presentano delle concentrazioni di Peonidina comprese tra 4-5 mg/l e solo il 18% dei Barbera commerciali e l’11% dei Bonarda commerciali hanno concentrazione di Peonidina comprese nell’intervallo suddetto. Concentrazioni inferiori a 1mg/l si trovano invece nelle due tipologie di vini commerciali analizzati, in particolare nel 52% di Bonarda e nel 45% di Barbera. % campioni analizzati peonidina 60 40 % bonarda commerciale 20 % barbera commerciale 0 da 0 a 1 % bonarda puro da 1 a 2 da 2 a 3 da 3 a 4 da 4 a 5 >5 concentrazione peonidina (mgl) Figura 5.3: Concentrazione Peonidina nei campioni analizzati Anche nel caso della Peonidina non è stato possibile riscontrare in tutti i vini analizzati la sua presenza. 71
  • 73. La seguente Tabella mostra le aree dei picchi, presenti nel cromatogramma derivato dall’analisi dei vini, corrispondenti alla Malvidina e le relative concentrazioni che è stato possibile calcolare nei vini analizzati. npr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Area Malvidina (mAU/min) Bonarda commerciali 474666 247032 3256340 986334 1200196 1122202 1240671 469241 79389 574051 473710 117927 78419 154141 106481 139032 138111 3306621 448671 421302 430951 248431 373450 119261 Conc. (mg/l) Malvidina Bonarda commerciali Area Malvidina (mAU/min) Barbera commerciali Conc. (mg/l) Malvidina Barbera commerciali 9,53 4,24 74,20 21,42 26,39 24,58 27,34 9,40 0,34 11,84 9,51 1,23 0,32 2,08 0,97 1,72 1,70 75,36 8,92 8,29 8,51 4,27 7,17 1,27 2675933 2106266 152189 130681 76828 152037 102644 146215 140059 147777 144390 573300 60,70 47,46 2,03 1,53 0,28 2,03 0,88 1,89 1,75 1,93 1,85 11,82 Area Malvidina (mAU/min) Bonarda puro 163765 191988 287046 669692 233994 282244 Conc.(mg/l) Malvidina Bonarda puro 2,30 2,96 5,17 14,06 3,93 5,05 Area Malvidina (mAU/min) Barbera Puro 86177 Conc. (mg/l) Malvidina Barbera Puro 0,49 Tabella 3: Aree dei picchi corrispondenti alla Malvidina e relative concentrazioni in mg/l presenti nei campioni di Barbera Doc e Bonarda Doc analizzati 72
  • 74. Per quanto riguarda la concentrazione di Malvidina in figura 5.4 è possibile notare invece che : il 50% dei vini Bonarda in purezza presentano delle concentrazioni di Malvidina maggiori di 5 mg/l e solo il 25% dei Barbera commerciali e il 58% dei Bonarda commerciali hanno concentrazione di Malvidina comprese nell’intervallo suddetto. Concentrazioni comprese nell’intervallo 3-4 mg/l sono riscontrabili solo nel 16% dei Bonarda in purezza analizzati. Concentrazioni inferiori a 3 mg/l si riscontrano maggiormente nei vini commerciali, in modo particolare il 41% dei vini Barbera hanno concentrazioni di Malvidina comprese tra 1-2 mg/l. % campioni analizzati malvidina 60 40 20 0 da 0 a 1 % bonarda commerciale da 1 a 2 % barbera commerciale da 2 a 3 da 3 a 4 % bonarda puro da 4 a 5 >5 concentrazione malvidina (mg/l) Fig. 5.4: Concentrazione Malvidina nei campioni analizzati 73
  • 75. Nelle figure seguenti sono riportati i cromatogrammi ottenuti dall’analisi a 516nm di Barbera e Bonarda commerciali e di Bonarda in purezza. m A U Minuti Figura 5.5: Cromatogramma di un vino Barbera commerciale 74
  • 76. m A U Minuti Figura 5.6: Cromatogramma di un vino Bonarda commerciale 75
  • 77. m A U Minuti Figura 5.7: Cromatogramma di un vino Bonarda in purezza 76
  • 78. 5.2 CROMATOGRAFIA CON DETECTOR A λ=278nm Gli stessi vini già analizzati per cromatografia liquida, con detector UV-VISIBILE a 516nm sono stati analizzati utilizzando una lunghezza d’onda di 278nm, sfruttando così le capacità di separazione della colonna e l’effetto selettivo di una lunghezza d’onda ultravioletta, alla quale gli antociani, colorati, non mostrano assorbimento. I cromatogrammi ottenuti con λ = 278 nm hanno mostrato molti meno picchi rispetto agli omologhi ottenuti con λ = 516 nm. Per la maggior parte non è stato possibile identificare la struttura del composto, ma è stato chiaramente identificato l’acido gallico, presente in tutti i vini analizzati. Dal confronto dei tempi di ritenzione relativi allo standard dell’acido gallico, è stato possibile identificare sul cromatogramma di ogni vino preso in esame, il picco corrispondente al suddetto composto. Inoltre, utilizzando l’equazione della curva di taratura ottenuta analizzando lo standard in concentrazioni differenti, è stato possibile calcolare la concentrazione di acido gallico presente in ogni campione analizzato. npr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Area Ac. Gallico (mAU/min) Bonarda commerciali 2869925 2341589 2651513 6023913 1557423 2172128 2465825 2822008 2717888 2846850 2663168 3598093 1977145 3767306 2306522 10389093 2830478 2150983 2893000 3135410 3837523 3188920 5982869 2440865 3576723 4241124 2960009 3830619 Conc. (mg/l) Ac.Gallico Bonarda commerciali 7,43 6,07 6,87 15,55 4,05 5,63 6,39 7,31 7,04 7,37 6,90 9,31 5,13 9,74 5,98 26,79 7,33 5,58 7,49 8,11 9,92 8,25 15,44 6,32 9,25 10,96 7,66 9,90 Area Ac. Gallico (mAU/min) Barbera commerciali 5314289 2967784 2227838 1732725 4901814 2923636 3895249 2920509 3104018 1202210 2779540 1923889 3279145 3224071 13854781 4769101 2989797 3386837 3303375 3308442 2960489 2924869 3103376 3409105 2460678 2753381 4037440 2760563 3071606 4508906 Conc. (mg/l) Ac. Gallico Barbera commerciali 13,72 7,68 5,77 4,50 12,66 7,56 10,07 7,56 8,03 3,13 7,19 4,99 8,48 8,34 35,71 12,32 7,73 8,76 8,54 8,55 7,66 7,57 8,03 8,81 6,37 7,13 10,43 7,14 7,94 11,65 Area Ac.Gallico (mAU/min) Bonarda puro 3919284 2075789 2599904 2197464 3222886 11412472 4067829 Conc.(mg/l) Ac.Gallico (mAU/min) Bonarda puro 10,13 5,39 6,73 5,70 8,34 29,43 10,52 Area Ac.Gallico (mAU/min) Barbera Puro 1806962 Conc.(mg/l) Ac.Gallico Barbera Puro 4,692915 Tabella 4: Aree dei picchi corrispondenti all’acido gallico e relative concentrazioni in mg/l presenti nei campioni di Barbera Doc e Bonarda Doc analizzati 77
  • 79. Nel seguente Istogramma di frequenza sono stati rappresentati sull’asse delle ascisse gli intervalli di concentrazione di acido gallico e sull’asse delle ordinate le percentuali riscontrate nei vini analizzati. % campioni analizzati Acido gallico 80 60 40 % Bonarda puro 20 0 da 0 a 6 % Bonarda commerciale da 7 a 12 da 13 a 18 % Barbera commerciale da 19 a 24 da 25 a 30 da 30 a 36 concentrazione ac. gallico (mg/l) Figura 5.8: Concentrazione Acido Gallico nei campioni analizzati Come si evince dal grafico, solo il 14% dei vini Bonarda Doc in purezza presentano delle concentrazioni superiori a 25 mgl di Acido Gallico differenziandosi così dai vini Bonarda e Barbera commerciali. Il 76% dei vini Barbera e il 53% dei vini Bonarda commerciali analizzati presenta invece una concentrazione di Acido Gallico che varia nell’intervallo da 7 a 12 mgl. E’ stato quindi effettuato il calcolo del t-test per campioni indipendenti che permette di discriminare le tipologie di vino per quanto riguarda i valori di concentrazione di Acido Gallico nei campioni analizzati. L’unico test risultato statisticamente significativo, nel quale è stato riscontrato un valore di p value < 0,05, è quello tra Bonarda in purezza e Bonarda commerciale. Per quanto riguarda la Catechina, non è stato possibile fare un riscontro grafico né calcolare la concentrazione, in quanto solo una piccolissima percentuale dei vini analizzati presentavano nel cromatogramma il picco corrispondente a quello dello standard utilizzato. 78
  • 80. Nelle figure seguenti sono riportati, a titolo di esempio, tre cromatogrammi ottenuti dall’analisi del detector impostato a 278nm dei vini Barbera commerciali, Bonarda commerciali e Bonarda in purezza. m A U Minuti Figura 5.9: Cromatogramma di un vino Barbera commerciale 79
  • 81. m A U Minuti Figura 5.10: Cromatogramma di un vino Bonarda commerciale 80
  • 82. m A U Minuti Figura 5.11: Cromatogramma di un vino Bonarda in purezza 81
  • 83. 5.3 CONCLUSIONI I risultati ottenuti da questa tesi sono stati significativi e hanno confermato, relativamente al settore oggetto di studio, i dati precedentemente ottenuti dall’analisi comparata di vini bonarda e barbera: il vino Bonarda ha caratteristiche particolari rispetto al Barbera, ma il prodotto commerciale, probabilmente per esigenze di mercato, viene proposto in un modo molto uniformato, privando cioè i due prodotti della tipicità che è invece un valore aggiunto. A tali conclusioni si può giungere mediante tutte e tre le vie proposte per l’analisi del prodotto. I risultati ottenuti saranno quindi presi in esame separatamente per ciascuna tipologia di prove. A. Analisi in HPLC secondo “Method OIV-MA-AS315-11 -Type II method”, con λ=516 per la determinazione semiquantitativa degli antociani di Bonarda e Barbera. Sono stati analizzati tre antociani: Cianidina, Peonidina e Malvidina. I risultati riportati nelle tabelle al capitolo 5, hanno messo in evidenza un comportamento differente per questi antociani e consentono di affermare che : a. nel caso della Cianidina, il vino Bonarda ottenuto da Croatina in purezza, presenta valori bassi di concentrazione (fino a 2 mg/l) nella maggior parte dei campioni, mentre per i vini Bonarda commerciali e Barbera commerciali le concentrazioni hanno un andamento quasi parallelo, con due picchi di concentrazione per cui la maggior parte dei vino o raggiunge valori bassi di Cianidina o si attesta su valori intorno a 4 mg/l; b. nel caso della Peonidina, si nota un’analogia nelle concentrazioni di questo composto nei vini Bonarda commerciali e Barbera commerciali che presentano di preferenza basse concentrazioni di Peonidina, al contrario di quanto si osserva nei vini vinificati da Croatina in purezza che tendono a presentare alte concentrazioni. Una cospicua fascia di Bonarda commerciali tuttavia sembra più ricca di quello che ci si potrebbe attendere ammettendo la teoria della analogia ormai accettata tra il Barbera e il Bonarda. Questo aspetto può tuttavia essere riconducibile a differenti operazioni di cantina (macerazione sulle bucce del mosto durante la prima fase delle fermentazione) e introduce perciò una variabile in più nella valutazione delle caratteristiche dei due vini. c. Anche nel caso della malvidina, si notano parziali analogie tra i vini commerciali e ancora una volta, il vino Bonarda ottenuto da vinificazione di uva Croatina in purezza presenta una curva di concentrazione particolare, che per i valori di concentrazione più elevati si avvicina a quella dell’omologo commerciale, mentre per i valori bassi di concentrazione sembra che ci siano analogie tra i prodotti commerciali. 82
  • 84. Trarre conclusioni da queste analisi e dalle loro elaborazioni è difficile, anche perché non è valutabile il contributo in antociani che deriva dalle operazioni di macerazione, ma sicuramente si può affermare che il vino Bonarda ha caratteristiche particolari che al più compaiono in maniera più sfumata nel suo omologo commerciale. B. Analisi in HPLC secondo “Method OIV-MA-AS315-11 -Type II method”, con λ=278 per la determinazione semiquantitativa degli antociani di Bonarda e Barbera. L’analisi delle curve di concentrazione dell’Acido Gallico, costruite per i tre vini, mostra ancora forti analogie tra i prodotti appartenenti al circuito commerciale. In particolare il 76% dei vini Barbera e il 53% dei vini Bonarda commerciali analizzati presenta una concentrazione di Acido Gallico che varia nell’intervallo da 7 a 12 mgl. E’ interessante osservare invece che solo il 14% dei vini Bonarda Doc in purezza presentano delle concentrazioni superiori a 25 mgl di Acido Gallico differenziandosi così dai vini Bonarda e Barbera commerciali. Questa ricerca, quindi si conclude con la certezza che la chimica analitica dispone degli strumenti necessari per definire e valorizzare i vini Barbera e Bonarda; ciò porterà risvolti positivi alla conoscenza del prodotto e una valorizzazione del suo mercato. Sono già in atto delle collaborazioni con la Ditta Perkin Elmer, che si occupa di strumenti e tecnologie di ultima generazione, per cercare di approfondire meglio questo lavoro di ricerca. 83
  • 85. Ministero delle politiche agricole alimentari e forestali DIPARTIMENTO DELLE POLITICHE COMPETITIVE DEL MONDO RURALE E DELLA QUALITÀ DIREZIONE GENERALE DELLO SVILUPPO AGROALIMENTARE E DELLAQUALITÀ SAQ IX Decreto 3 agosto 2010 concernente la modifica del disciplinare di produzione della Denominazione di Origine Controllata dei vini “Oltrepò Pavese”. … omissis … Disciplinare di produzione dei vini a Denominazione di Origine Controllata “OLTREPÒ PAVESE” Articolo 1. La Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” é riservata ai vini che rispondono alle condizioni ed ai requisiti stabiliti dal presente disciplinare di produzione per le seguenti tipologie: 1) Rosso; 2) Rosso riserva; 3) Rosato; 4) Rosato frizzante; 5) Bianco; 6) Barbera; 7) Barbera frizzante; 8) Barbera riserva; […] Articolo 2. Base ampelografia I vini di cui all’art. 1 devono essere ottenuti dalle uve prodotte dai vigneti aventi, nell’ambito aziendale, la seguente composizione ampelografica: 1) Rosso; 2) Rosso riserva; 3) Rosato; 4) Rosato frizzante: - Barbera: dal 25% al 65%; - Croatina: dal 25% al 65%; - Uva rara, Ughetta (Vespolina) e Pinot nero: fino a un massimo del 45%; - altri vitigni a bacca rossa, non aromatici, idonei alla coltivazione per la provincia di Pavia: congiuntamente o disgiuntamente, fino a un massimo del 15%. 5) Bianco: - Riesling e/o Riesling italico: minimo 60%; - Pinot nero o altri vitigni a bacca bianca, non aromatici, idonei alla coltivazione per la provincia di Pavia: massimo 40%. 6) Barbera; 84
  • 86. 7) Barbera frizzante; 8) Barbera riserva: - Barbera: dall’85% al 100%; - altri vitigni a bacca rossa, non aromatici, idonei alla coltivazione per la provincia di Pavia: congiuntamente o disgiuntamente, fino a un massimo del 15%. Articolo 3. Zona di produzione delle uve La zona di produzione delle uve destinate alla produzione dei vini “Oltrepò Pavese” di cui all’art. 1 comprende la fascia vitivinicola collinare dell’“Oltrepò Pavese” per gli interi territori dei seguenti comuni in provincia di Pavia: Borgo Priolo, Borgoratto Mormorolo, Bosnasco, Calvignano, Canevino, Canneto Pavese, Castana, Cecima, Godiasco, Golferenzo, Lirio, Montalto Pavese, Montecalvo Versiggia, Montescano, Montù Beccaria, Mornico Losana, Oliva Gessi, Pietra de’ Giorgi, Rocca de’ Giorgi, Rocca Susella, Rovescala, Ruino, San Damiano al Colle, Santa Maria della Versa, Torrazza Coste, Volpara, Zenevredo e per parte dei territori di questi altri comuni: Broni, Casteggio, Cigognola, Codevilla, Corvino San Quirico, Fortunago, Montebello della Battaglia, Montesegale, Ponte Nizza, Redavalle, Retorbido, Rivanazzano, Santa Giuletta, Stradella, Torricella Verzate. Tale zona è così delimitata:parte dai km 136+150 della strada statale n. 10, la linea di delimitazione scende verso sud seguendo la strada provinciale Bressana-Salice Terme, sino al bivio di Rivanazzano. Qui si devia verso ovest lungo la strada che da Rivanazzano porta alla Cascina Spagnola, per piegare a quota 139 verso sud e raggiungere il confine provinciale e regionale Pavia-Alessandria, che segue fino a Serra del Monte. Da questo punto la linea di delimitazione raggiunge Casa Carlucci e prosegue in direzione sud, lungo il confine che divide i comuni di Ponte Nizza e Bagnaria fino al torrente Staffora, includendo San Ponzo Semola. Di qui la linea di delimitazione segue la statale Voghera-Varzi-Penice fino all’abitato di Ponte Nizza, indi devia a est-nord-est seguendo la provinciale di fondo valle per Val di Nizza. Prosegue quindi in direzione nord lungo il confine comunale tra ponte Nizza, Val di Nizza e Montesegale sino al Rio Albaredo e con esso raggiunge il torrente Ardivestra, con il quale si identifica risalendo verso est a raggiungere la Cascina della Signora. Da questo punto la linea di delimitazione prosegue in direzione nord seguendo la strada provinciale Godiasco-Borgoratto Mormorolo, a incontrare il confine dei comuni Fortunago e Ruino. Prosegue sul confine comunale meridionale di Ruino a raggiungere il confine provinciale tra Pavia-Piacenza. La delimitazione orientale del comprensorio é costituita dal confine provinciale Pavia-Piacenza sino al suo incontro con la strada statale n. 10, per raggiungere la strada provinciale Bressana-Salice Terme che incrocia al km 136+150 del comprensorio, punto di partenza della delimitazione. Articolo 4. Norme per la viticoltura 4.1) Condizioni naturali dell’ambiente Le condizioni ambientali e di coltura dei vigneti destinati alla produzione dei vini a Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” devono essere quelle tradizionali della zona di produzione e, comunque, atte a conferire alle uve e ai vini le specifiche tradizionali caratteristiche di qualità.I vigneti devono essere posti su terreni di natura calcarea o calcareoargillosa e su pendici collinari ben soleggiate escludendo comunque i fondovalle e i terreni di pianura.I sesti di impianto, le forme di allevamento e i sistemi di potatura devono essere quelli generalmente usati o comunque atti a non modificare le caratteristiche delle uve e del vino. 4.2) Densità di impianto Per i nuovi impianti ed i reimpianti la densità dei ceppi per ettaro non può essere inferiore a 4.000, per la cultivar Croatina la densità di ceppi per ettaro non può essere inferiore a 3.200. 85
  • 87. 4.3) Sesti d’impianto e forme d’allevamento I sesti d’impianto e le forme di allevamento (controspalliera) e i sistemi di potatura devono essere quelli di tipo tradizionale e, comunque, i vigneti devono essere governati in modo da non modificare le caratteristiche dell’uva, del mosto e del vino. Per i vigneti esistenti alla data di pubblicazione del presente disciplinare sono consentite le forme di allevamento già usate nella zona, con esclusione delle forme di allevamento espanse. 4.4) Irrigazione É consentita l’irrigazione di soccorso. 4.5) Rese ad ettaro e gradazione minima naturale Le produzioni massime di uva per ettaro in coltura specializzata dei vigneti destinati alla produzione dei vini a Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” ed i titoli alcolometrici volumici naturali minimi devono essere i seguenti: Tipologia 1) Rosso 2) Rosso riserva 3) Rosato 4) Rosato frizzante 5) Bianco 6) Barbera 7) Barbera frizzante 8) Barbera riserva Resa massima(t/ha) 11,00 11,00 11,00 11,00 12,00 12,00 12,00 12,00 Titolo alc. vol. nat. min.(%vol) 11,00 12,00 10,00 10,00 10,50 11,00 11,00 12,00 […] Anche in annate eccezionalmente favorevoli, la resa uva ad ettaro dovrà essere riportata nei limiti di cui sopra purché la produzione globale non superi del 20% i limiti medesimi, ferma restando la resa uva/vino per i quantitativi di cui trattasi. Oltre detto limite del 20% decade il diritto alla Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” per tutta la partita. La Regione Lombardia, sentito il parere del Consorzio di Tutela, annualmente, con proprio decreto, tenuto conto delle condizioni ambientali di coltivazione, può fissare produzioni massime per ettaro inferiori a quelle stabilite dal presente disciplinare di produzione, o limitare, per talune zone geografiche, l’utilizzo delle menzioni aggiuntive di cui all’art. 1, dandone immediata comunicazione al Ministero delle politiche agricole alimentari e forestali - Comitato nazionale per la tutela e la valorizzazione delle denominazioni di origine e delle indicazioni geografiche tipiche dei vini. Articolo 5. Norme per la vinificazione 5.1) Zona di vinificazione Le operazioni di vinificazione devono essere effettuate nella zona di produzione delimitata dall’art. 3. Tenuto conto delle situazioni tradizionali di produzione é consentito che tali operazioni siano effettuate nell’intero territorio della provincia di Pavia, nonché nelle frazioni di Vicobarone e Casa Bella nel comune di Ziano Piacentino in provincia di Piacenza. È consentito, inoltre, che si effettuino nell’intero territorio della Lombardia e del Piemonte le operazioni di vinificazione ai fini della spumantizzazione per la produzione dell’ “Oltrepò Pavese” 86
  • 88. delle seguenti tipologie: Moscato, Malvasia, Riesling, Pinot nero, Cortese, Chardonnay, Sauvignon e per la produzione di “Oltrepò Pavese” Moscato liquoroso. Sono altresì ammesse per l’intero territorio delle Regioni Lombardia e Piemonte le operazioni atte all’elaborazione delle tipologie di vini frizzanti previste dal presente disciplinare. 5.2) Resa massima uva/vino Le rese massime dell’uva in vino devono essere le seguenti: Tipologia Resa uva/vino 1) Rosso 70% 2) Rosso riserva 70% 3) Rosato 70% 4) Rosato frizzante 70% 5) Bianco 70% 6) Barbera 70% 7) Barbera frizzante 70% 8) Barbera riserva 70% […] Qualora la resa uva/vino superi i limiti sopra riportati, ma non oltre il 5%, l’eccedenza non avrà diritto alla denominazione di origine controllata; oltre tale limite decade il diritto alla denominazione di origine per tutta la partita. Le uve destinate alla produzione delle tipologie spumante: Cortese, Riesling, Moscato, Malvasia, Chardonnay e Pinot nero dovranno essere indicate all’atto della denuncia annuale delle medesime. 5.3) Modalità di vinificazione e di elaborazione Nella vinificazione sono ammesse soltanto le pratiche enologiche corrispondenti agli usi locali, leali e costanti, atte a conferire ai vini le loro rispettive caratteristiche. In particolare é ammessa la vinificazione congiunta o disgiunta delle uve che concorrono alla denominazione “Oltrepò Pavese”. Nel caso della vinificazione disgiunta il coacervo dei vini, facenti parte della medesima partita, deve avvenire nella cantina del vinificatore entro il periodo di completo affinamento e comunque prima della richiesta della certificazione della relativa partita prevista dalla vigente normativa o prima della eventuale commercializzazione, all’interno della zona contemplata dall’art. 5.1, come vino atto a “Oltrepò Pavese”. Nella preparazione dei vini spumanti “Oltrepò Pavese”, Riesling, Cortese, Chardonnay, Moscato, Malvasia, Sauvignon, Pinot nero (vinificato in bianco) e Pinot nero (vinificato in rosato) deve essere usata la tradizionale tecnica di rifermentazione in autoclave (metodo charmat detto localmente metodo Martinotti). 5.4) Invecchiamento La denominazione “Oltrepò Pavese” Rosso riserva, Barbera riserva e Riesling riserva é riservata ai vini sottoposti a un periodo di invecchiamento di almeno ventiquattro mesi a partire dal 1° novembre dell’anno di produzione delle uve. 5.5) Immissione al consumo Il vino “Oltrepò Pavese” Moscato passito non può essere immesso al consumo prima del 1° giugno dell’anno successivo alla vendemmia 5.6) Vini passiti e liquorosi 87
  • 89. Il vino “Oltrepò Pavese” Moscato liquoroso, nei due tipi dolce e secco o dry, deve essere prodotto partendo da mosto o da vino Moscato, di cui al presente disciplinare. Per il raggiungimento del titolo alcolometrico volumico previsto al consumo, al Moscato liquoroso é ammessa l’aggiunta, prima, durante e dopo la fermentazione, di alcol di origine vinica, acquavite di vino, mosto concentrato. È consentita la produzione di “Oltrepò Pavese” Moscato passito partendo dalle uve Moscato di cui all’art. 2, dopo essere state sottoposte ad un periodo di appassimento che può protrarsi fino al 30 marzo dell’anno successivo a quello della vendemmia e la vinificazione non deve essere anteriore al 15 ottobre dell’anno di produzione delle uve. Tale procedimento deve assicurare, al termine del periodo di appassimento, un contenuto zuccherino non inferiore al 23%. Articolo 6. Caratteristiche dei vini al consumo I vini a Denominazione di Origine Controllata di “Oltrepò Pavese” devono rispondere, all’atto dell’immissione al consumo, alle seguenti caratteristiche: 1) “Oltrepò Pavese” Rosso: - colore: rosso rubino intenso; - odore: vinoso intenso; - sapore: pieno, leggermente tannico, di corpo; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 11,50% vol; -acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 20,0 g/l. 2) “Oltrepò Pavese” Rosso riserva: - colore: rosso rubino con riflessi aranciati; - odore: profumo intenso, etereo; - sapore: asciutto, corposo, armonico; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 12,50% vol; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 22,0 g/l. 3) “Oltrepò Pavese” Rosato: - colore: rosato, tendente al cerasuolo tenue; - odore: leggermente vinoso, caratteristico; - sapore: asciutto, armonico; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 10,50% vol; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 17,0 g/l. 4) “Oltrepò Pavese” Rosato frizzante: - colore: rosato, tendente al cerasuolo tenue; - odore: leggermente vinoso, caratteristico; - sapore: vivace, asciutto, armonico; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 10,50% vol, di cui almeno 10,00% effettivo; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 17,0 g/l. 5) “Oltrepò Pavese” Bianco: - colore: giallo paglierino, più o meno intenso; 88
  • 90. - odore: intenso,caratteristico; - sapore: asciutto, gradevole, di gusto fresco e armonico; - titolo alcolometrico volumico complessivo minimo: 12,00% vol; - acidità totale minima: 4,5g/l; - estratto non riduttore minimo: 16,0 g/l. 6) “Oltrepò Pavese” Barbera: - colore: rosso rubino intenso, limpido, brillante; - odore: vinoso, dopo invecchiamento, profumo caratteristico; - sapore: sapido, di corpo, leggermente tannico; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 11,00% vol; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 20,0 g/l. 7) “Oltrepò Pavese” Barbera frizzante: - colore: rosso rubino intenso, limpido, brillante; - odore: vinoso, profumo caratteristico; - sapore: sapido, di corpo; - spuma: vivace, evanescente; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 11,00% vol, di cui almeno 10,50% effettivo; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 20,0 g/l. 8) “Oltrepò Pavese” Barbera riserva: - colore: rosso rubino intenso, con riflessi granati; - odore: vinoso, profumo caratteristico; - sapore: sapido, di corpo; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 12,50% vol; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 24,0 g/l. […] Articolo 7. Qualificazione, etichettatura, designazione e presentazione 7.1) Qualificazioni Alla Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” è vietata l’aggiunta di qualsiasi menzione diversa da quelle previste dal presente disciplinare ivi compresi gli aggettivi superiore, extra, fine, scelto, selezionato, vecchio, e similari. È tuttavia consentito l’uso di indicazioni che facciano riferimento a nomi o ragioni sociali o marchi privati, purché non abbiano significato laudativo e non siano tali da trarre in inganno il consumatore. 7.2) Etichettatura Sulle bottiglie o altri recipienti contenenti vini “Oltrepò Pavese” deve essere riportata l’indicazione dell’annata di vendemmia da cui il vino deriva. Tale indicazione è facoltativa per le tipologie spumate, frizzante e liquoroso. 7.3) Caratteri e posizioni in etichetta Le menzioni facoltative, escluse i marchi e i nomi aziendali, possono essere riportate nell’etichettatura soltanto in caratteri tipografici non più grandi o evidenti di quelli utilizzati per la denominazione di origine del vino, salvo le norme generali più restrittive. 89
  • 91. Nella tipologia “Oltrepò Pavese” Pinot nero spumante è consentito per la tipologia rosato l’uso in etichetta del termine rosé. Nella designazione dei vini di cui all’art. 1, la menzione specifica tradizionale “Denominazione di Origine Controllata” deve essere riportata immediatamente al di sotto della denominazione “Oltrepò Pavese”. Il nome di vitigno e le menzioni tradizionali o di colore previste dal presente disciplinare, per le relative tipologie, devono essere indicate nella designazione al di sotto della menzione specifica tradizionale “denominazione di origine controllata”. 7.4) Marchio collettivo La Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” è contraddistinta obbligatoriamente dal un marchio collettivo espresso nella forma grafica e letterale allegata al presente disciplinare, in abbinamento inscindibile con la denominazione. L’utilizzo del marchio collettivo è curato direttamente dal Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese che deve distribuirlo anche ai non associati, alle medesime condizioni di utilizzo riservate ai propri associati. Articolo 8. Confezionamento I vini a Denominazione di Origine Controllata “Oltrepò Pavese” di cui all’art. 1 possono essere immessi al consumo in contenitori di qualunque capacità previsti dalla legge, ad esclusione delle tipologie Bianco, Rosso, Rosso riserva, Barbera Riserva e Riesling riserva, che devono essere immessi al consumo soltanto in bottiglie di vetro di forma tradizionale e di capacità non superiore a litri 5.Per la tappatura dei vini spumanti é obbligatorio il tappo di sughero a fungo munito del tradizionale ancoraggio a gabbietta, ad eccezione dei recipienti di volume nominale uguale o inferiore a ml 200 per i quali sono consentite le chiusure ammesse dalla vigente normativa in materia.Inoltre per i vini spumanti a richiesta delle ditte interessate o del Consorzio di Tutela può essere consentito con specifica autorizzazione del Ministero delle politiche agricole, alimentari e forestali l’utilizzo dei contenitori di capacità di litri 6-9 e superiori. 90
  • 92. Ministero delle politiche agricole alimentari e forestali DIPARTIMENTO DELLE POLITICHE COMPETITIVE DEL MONDO RURALE E DELLA QUALITÀ DIREZIONE GENERALE DELLO SVILUPPO AGROALIMENTARE E DELLAQUALITÀ SAQ IX Decreto 3 agosto 2010 concernente il riconoscimento del disciplinare di produzione della Denominazione di Origine Controllata dei vini “Bonarda dell’Oltrepò Pavese”. … omissis … Disciplinare di produzione dei vini a Denominazione di Origine Controllata “BONARDA DELL’OLTREPÒ PAVESE” Articolo 1. La Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” è riservata ai vini, anche nella tipologia “frizzante”, che rispondono alle condizioni ed ai requisiti stabiliti dal presente disciplinare di produzione. Articolo 2. Base ampelografica I vini di cui all’art. 1 devono essere ottenuti dalle uve prodotte dai vigneti aventi, nell’ambito aziendale, la seguente composizione ampelografia: - Croatina: dall’85% al 100%; - Barbera, Ughetta (Vespolina), Uva rara: congiuntamente o disgiuntamente, fino a un massimo del 15%. Articolo 3. Zona di produzione delle uve La zona di produzione delle uve destinate alla produzione dei vini “Bonarda dell’Oltrepò Pavese" comprende la fascia vitivinicola collinare dell’“Oltrepò Pavese” per gli interi territori dei seguenti comuni in provincia di Pavia: Borgo Priolo, Borgoratto Mormorolo, Bosnasco, Calvignano, Canevino, Canneto Pavese, Castana, Cecima, Godiasco, Golferenzo, Lirio, Montalto Pavese, Montecalvo Versiggia, Montescano, Montù Beccaria, Mornico Losana, Oliva Gessi, Pietra de’ Giorgi, Rocca de’ Giorgi, Rocca Susella, Rovescala, Ruino, San Damiano al Colle, Santa Maria della Versa, Torrazza Coste, Volpara, Zenevredo e per parte dei territori di questi altri comuni: Broni, Casteggio, Cigognola, Codevilla, Corvino San Quirico, Fortunago, Montebello della Battaglia, Montesegale, Ponte Nizza, Redavalle, Retorbido, Rivanazzano, Santa Giuletta, Stradella, Torricella Verzate. Tale zona è così delimitata: parte dai km 136+150 della strada statale n. 10, la linea di delimitazione scende verso sud seguendo la strada provinciale Bressana-Salice Terme, sino al bivio di Rivanazzano. Qui si devia verso ovest lungo la strada che da Rivanazzano porta alla Cascina Spagnola, per piegare a quota 139 verso sud e raggiungere il confine provinciale e regionale Pavia-Alessandria, che segue fino a Serra del Monte. Da questo punto la linea di delimitazione raggiunge Casa Carlucci e prosegue in direzione sud, lungo il confine che divide i comuni di Ponte Nizza e Bagnaria fino al torrente Staffora, includendo San Ponzo Semola. Di qui la 91
  • 93. linea di delimitazione segue la statale Voghera-Varzi-Penice fino all’abitato di Ponte Nizza, indi devia a est-nord-est seguendo la provinciale di fondo valle per Val di Nizza. Prosegue quindi in direzione nord lungo il confine comunale tra ponte Nizza, Val di Nizza e Montesegale sino al Rio Albaredo e con esso raggiunge il torrente Ardivestra, con il quale si identifica risalendo verso est a raggiungere la Cascina della Signora. Da questo punto la linea di delimitazione prosegue in direzione nord seguendo la strada provinciale Godiasco-Borgoratto Mormorolo, a incontrare il confine dei comuni Fortunago e Ruino. Prosegue sul confine comunale meridionale di Ruino a raggiungere il confine provinciale tra Pavia-Piacenza. La delimitazione orientale del comprensorio é costituita dal confine provinciale Pavia-Piacenza sino al suo incontro con la strada statale n. 10, per raggiungere la strada provinciale Bressana-Salice Terme che incrocia al km 136+150 del comprensorio, punto di partenza della delimitazione. Articolo 4. Norme per la viticoltura 4.1) Condizioni naturali dell’ambiente Le condizioni ambientali e di coltura dei vigneti destinati alla produzione dei vini a Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” devono essere quelle tradizionali della zona di produzione e, comunque, atte a conferire alle uve e ai vini le specifiche tradizionali caratteristiche di qualità. I vigneti devono essere posti su terreni di natura calcarea o calcareo-argillosa e su pendici collinari ben soleggiate escludendo comunque i fondovalle e i terreni di pianura. I sesti di impianto, le forme di allevamento e i sistemi di potatura devono essere quelli generalmente usati o comunque atti a non modificare le caratteristiche delle uve e del vino. 4.2) Densità di impianto Per i nuovi impianti ed i reimpianti la densità dei ceppi per ettaro non può essere inferiore a 3.200. 4.3) Sesti d’impianto e forme d’allevamento I sesti d’impianto, le forme di allevamento (controspalliera) e i sistemi di potatura devono essere quelli di tipo tradizionale e, comunque, i vigneti devono essere governati in modo da non modificare le caratteristiche dell’uva, del mosto e del vino. Per i vigneti esistenti alla data di pubblicazione del presente disciplinare sono consentite le forme di allevamento già usate nella zona, con esclusione delle forme di allevamento espanse. 4.4) Irrigazione É consentita l’irrigazione di soccorso. 4.5) Rese ad ettaro e gradazione minima naturale Le produzioni massime di uva per ettaro in coltura specializzata dei vigneti destinati alla produzione dei vini a denominazione di origine controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” ed i titoli alcolometrici volumici naturali minimi devono essere i seguenti: Tipologia Produzione massima (t/ha) Titolo alc. vol. nat. min.(%Vol.) 1. Bonarda 12,50 10,50 2. Bonarda frizzante 12,50 10,50 Anche in annate eccezionalmente favorevoli, la resa uva ad ettaro dovrà essere riportata nei limiti di cui sopra purché la produzione globale non superi del 20% i limiti medesimi, ferma restando la resa uva/vino per i quantitativi di cui trattasi. Oltre detto limite del 20% decade il diritto alla Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” per tutta la partita. 92
  • 94. La Regione Lombardia, sentito il parere del Consorzio di Tutela annualmente, con proprio decreto, tenuto conto delle condizioni ambientali di coltivazione, può fissare produzioni massime per ettaro inferiori a quelle stabilite dal presente disciplinare di produzione, o limitare, per talune zone geografiche, l’utilizzo delle menzioni aggiuntive, dandone immediata comunicazione al Ministero delle politiche agricole alimentari e forestali - Comitato nazionale per la tutela e la valorizzazione delle denominazioni di origine e delle indicazioni geografiche tipiche dei vini. Articolo 5. Norme per la vinificazione 5.1) Zona di vinificazione Le operazioni di vinificazione devono essere effettuate nella zona di produzione delimitata dall’art. 3. Tenuto conto delle situazioni tradizionali di produzione é consentito che tali operazioni siano effettuate nell’intero territorio della provincia di Pavia, nonché nelle frazioni di Vicobarone e Casa Bella nel comune di Ziano Piacentino in provincia di Piacenza. Sono altresì ammesse per l’intero territorio delle Regioni Lombardia e Piemonte le operazioni atte all’elaborazione delle tipologie di vini frizzanti previste dal presente disciplinare. 5.2) Resa massima uva/vino Le rese massime dell’uva in vino devono essere le seguenti: Tipologia Resa uva/vino 1. Bonarda 70% 2. Bonarda frizzante 70% Qualora la resa uva/vino superi i limiti sopra riportati, ma non oltre il 5%, l’eccedenza non avrà diritto alla denominazione di origine controllata; oltre tale limite decade il diritto alla denominazione di origine per tutta la partita. 5.3) Modalità di vinificazione e di elaborazione Nella vinificazione sono ammesse soltanto le pratiche enologiche corrispondenti agli usi locali, leali e costanti, atte a conferire ai vini le loro rispettive caratteristiche. In particolare é ammessa la vinificazione congiunta o disgiunta delle uve che concorrono alla denominazione “Bonarda dell’Oltrepò Pavese”. Nel caso della vinificazione disgiunta, il coacervo dei vini, facenti parte della medesima partita, deve avvenire nella cantina del vinificatore entro il periodo di completo affinamento e comunque prima della richiesta della certificazione della relativa partita prevista dalla vigente normativa o prima della eventuale commercializzazione, all’ interno della zona contemplata dall’art. 5.1, come vino atto a “Bonarda dell’Oltrepò Pavese”. Articolo 6. Caratteristiche dei vini al consumo I vini a Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” devono rispondere, all’atto dell’immissione al consumo, alle seguenti caratteristiche: 1) “Bonarda dell’Oltrepò Pavese”: - colore: rosso rubino intenso; - odore: profumo intenso e gradevole; - sapore: secco, abboccato, amabile talvolta vivace, leggermente tannico; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 12,00% vol; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 20,0 g/l. 2) “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” frizzante: 93
  • 95. - colore: rosso rubino intenso; - odore: profumo intenso e gradevole; - sapore: secco o abboccato o amabile, leggermente tannico, fresco; - spuma: vivace, evanescente; - titolo alcolometrico volumico totale minimo: 11,00% vol, di cui almeno 9,00% effettivo; - acidità totale minima: 4,5 g/l; - estratto non riduttore minimo: 20,0 g/l. In relazione all’eventuale conservazione in recipienti di legno, il sapore dei vini può rilevare lieve sentore di legno. E’ facoltà del Ministro delle politiche agricole alimentari e forestali, con proprio decreto, modificare per i vini di cui sopra i limiti indicati per l’acidità totale e l’estratto non riduttore. Articolo 7. Qualificazione, etichettatura, designazione e presentazione 7.1) Qualificazioni Alla Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese”, anche nella tipologia frizzante, è vietata l’aggiunta di qualsiasi menzione diversa da quelle previste dal presente disciplinare ivi compresi gli aggettivi superiore, extra, fine, scelto, selezionato, vecchio, riserva e similari. E’ tuttavia consentito l’uso di indicazioni che facciano riferimento a nomi o ragioni sociali o marchi privati, purché non abbiano significato laudativo e non siano tali da trarre in inganno il consumatore. 7.2) Etichettatura Sulle bottiglie o altri recipienti contenenti “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” deve essere riportata l’indicazione dell’annata di vendemmia da cui il vino deriva. Tale indicazione è facoltativa per la tipologia frizzante. 7.3) Caratteri e posizioni in etichetta La denominazione “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” deve essere indicata nella designazione del prodotto in maniera consecutiva, anche su più righe, seguita immediatamente al di sotto dalla menzione specifica tradizionale “denominazione di origine controllata”. Le menzioni facoltative, escluse i marchi e i nomi aziendali, possono essere riportate nell’etichettatura soltanto in caratteri tipografici non più grandi o evidenti di quelli utilizzati per la denominazione di origine del vino, salvo le norme generali più restrittive. E’ altresì consentito l’uso della menzione tradizionale “vivace” per i vini che si presentano effervescenti a causa dell’anidride carbonica in essi contenuta, risultato di un processo di fermentazione esclusivo e naturale, secondo quanto previsto dalla vigente normativa comunitaria. 7.4) Marchio collettivo La Denominazione di Origine Controllata “Bonarda Oltrepò Pavese” è contraddistinta obbligatoriamente dal un marchio collettivo espresso nella forma grafica e letterale allegata al presente disciplinare, in abbinamento inscindibile con la denominazione. L’utilizzo del marchio collettivo è curato direttamente dal Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese che deve distribuirlo anche ai non associati, alle medesime condizioni di utilizzo riservate ai propri associati. Articolo 8. Confezionamento I vini a Denominazione di Origine Controllata “Bonarda dell’Oltrepò Pavese” di cui all’art. 1 devono essere immessi al consumo in bottiglie di vetro di capacità non superiore a litri 1,5. 94
  • 96. 95
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  • 106. BIBLIOGRAFIA Alcalde-Eon C., Escribano-Bailon M. T., Santos-Buelga C., Rivas-Gonzalo J. C., Identification of dimeric anthocyanins and new oligomeric pigments in red wine by means of HPLC-DADESI/MSn. J. Mass Spectrom., 42: 735–748. (2007). Antonaros A., La grande storia del vino, Pendragon. (2000). Brochet F. and Dubourdieu D., The color of odors. Brain and Language ,79: 309–320. (2001). Brown J. E., Khodr H., Hider R. C., Rice-Evans C. A., Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties. J. Biochem., 330: 11731178. (1998). Burns J., Gardner P.T., O’Neil J., Crawford S., Morecroft I., McPhail D.B., Lister C., Matthews D., Maclean M.R., Lean M.E.J., Duthie G.G., Crozier A., Relationship among antioxidant activity, vasodilation capacity and phenolic content of red wines. J. Agric. Food Chem., 48: 220-230. (2000). Casassa L. F., Larsen R. C., Beaver C. W., Mireles M. S., Keller M., Riley W. R., Smithyman R., Harbertson J. F, Impact of Extended Maceration and Regulated Deficit Irrigation (RDI) in Cabernet Sauvignon Wines: Characterization of Proanthocyanidin Distribution, Anthocyanin Extraction, and Chromatic Properties. J. Agric. and food chem., 61(26): 6446-57. (2013). Cellino A., Barbera. Studio per la caratterizzazione del territorio, delle uve e dei vini dell’area di produzione del Barbera d’Asti. Quad. Regione Piemonte. (2001). Cheynier V., Due as-Paton M., Salas E., Maury C., Souquet J.M., Sarni-Manchado P., Fulcrand H., Structure and properties of wine pigments and tannins. Am. J. Enol. Vitic., 57: 298−305. (2006). Cimino F., Sulfaro V., Trombetta D., Saija A., Tomaino A., Radical-scavenging capacity of several Italina red wines. Food Chem., 103: 75-81. (2007). Di Stefano R., Metodi chimici nella caratterizzazione varietale. Valutazioni attraverso lo studio dei composti volatili liberi e legati. Annali dell’Ist. Sper. Enol. Asti, 27: 33-53. (1996a). Di Stefano R., Metodi chimici nella caratterizzazione varietale. Riv. Vitic. Enol., 49(1): 51-56. (1996b). Dufour C. and Bayonove C. L., Interactions between Wine Polyphenols and Aroma Substances. An insight at the Molecular Level. J. Agric. Food Chem., 47(2): 678–684. (1999). 105
  • 107. Fernández-Pachón M.S., Vollaño D., García-Parrilla M.C., Troncoso A.M., Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition. Anal. Chim. Acta, 513: 113-118. (2004). Frankel E.N., Bosanek C.A., Meyer A.S., Silliman K., Kirk L. L., Commercial Grape Juices Inhibit the in Vitro Oxidation of Human Low-Density Lipoproteins. J. Agric. Food Chem, 46: 834-838. (1998). Frankel E. N., Kanner J., German J. B., Parks E., Kinsella J. E., Inhibition of oxidation of human lowdensity lipoprotein by phenolic substances in red wine. Lancet, 341: 454-457. (1993). Frankel E.N., Kanner J., German J.B., Parks E., Kinsella J. E., Inhibition of oxidation of human low density lipoproteins by phenolic substances in red wine. Lancet, 43: 454-457. (1993). Fregoni M., Fregoni C., Ferrarini R., Spagnolli F., Chimica viticolo enologica, Edizioni Reda. (2006). Hahlbrock K., Scheel D., Physiology and Molecular Biology of Phenylpropanoid Metabolism. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 40: 347–69. (1989). Halliwell B., Gutteridge J. M. C., Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: overview. Methods Enzymol, 186: 1-85. (1990). Hermosìn Gutièrrez I., Lorenzo E.S.-P., Espinosa A.V., Phenolic composition and magnitude of copigmentation in young and shortly aged red wines made from the cultivars, Cabernet Sauvignon, Cencibel and Syrah. Food Chem, 92(2): 269-283. (2005). Ioku K., Tsushida T., Takei Y., Nakatani N., Terao J., Antioxidant activity of quercetin and quercetin monoglucosides in solution and phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta, 1234: 99-104. (1995). Jackson R.S., Wine Science. Principles, Practice, Perception. Elsevier Science & Technology Books. (2000). Jackson R.S., Wine tasting. Elsevier Food Science & Technology I.S. (2002). Jaillon O., Aury J-M., Noel B., Policriti A., Clepet C., Casagrande A., The grapevine genome sequence suggest ancestral Hexaploidization in major angiosperm Phila. Nature, 449: 464-467. (2007). 106
  • 108. Jayaraman A., Van Buren J. P., Browning of galacturonic acid in a model system stimulation fruit beverages and white wine. J. Agric. Food Chem., 20: 122–124. (1972). Lanati D., Scienza A., Marchi D., De vino, lezioni di enotecnologia. Edizioni Enosis Meraviglia. (2002). Li F., Jin Z., Qu W., Zhao D., Ma F., Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression in transigenic tobacco. Plant Physiol Biochem., 44(7-9): 455-61. (2006). Maffi L., Storia di un territorio rurale. Vigne e vini nell'Oltrepò Pavese. Ambiente, società, economia. Geostoria del territorio. (2010). Margalit Y., Elementi di chimica del vino. Eno-One. (2005). Martini F.H., Timmons J.M., Tallisch R.B., Anatomia umana. Edises. (2010). Paronetto L., Polifenoli e tecnica enologica. Edizioni Edagricole (1979). Pastor del Rio J. L., Kennedy J.A., Development of proanthocyanidins in Vitis vinifera L. cv Pinot noir grapes and extraction into wine. Am. J. Enol. Vitic., 57(2): 125-132. (2006). Pèrez-Magarino S., Gonzales-San Josè M.L., Polyphenols and colour variabilità of red wines made from grapes harvested at different ripeness grade. J. Agric. Food Chem, 98: 197-208. (2006). Peynaud E., Enologia e tecnica del vino. Edizioni AEB. (1985). Pocock K.F., Waters E.J., The effect of mechanical harvesting and transport of grapes, and juice oxidation, on the protein stability of wines. Aust. J. Grape Wine Res., 4(3): 136-139. (1998). Ribérerau-Gayon P., Glories Y., Maujean A., Dubourdieu D., Trattato di enologia – Chimica del vino, stabilizzazioni e trattamenti. Edizioni Ed. agricole. (2003). Rice-Evans C., Miller N.J., Bolwell P.G., Bramley P.M., Pridham J.B., The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids. Free Rad. Res., 22: 375-383. (1995). Salah N., Miller N.J., Paganga G.G., Tijburg L., Rice-Evans C.A., Polyphenolic flavonols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants. Arch. Biochem. Biophys, 322: 339-346. (1995). Sciancalepore V., Industrie agrarie. Olearia, enologica, lattiero-casearia. Utet. (1998). 107
  • 109. Sefe K.M., Lefort F., Grando M.S., Scott K.D., Steinkellern H., Thomas M.R., Microsatellite markers for grapevine: a state of the art. In: K.A. Roubelakis-Angelakis (ed) Molecular biology and biotechnology of grapevine. Kluwer Academic Publishers, Amsterdam, NL, 433-463. (2001). Singletary K.W., Tansbury M.J., Giusti M., Van Breemen R.B., Wallig M., Rimando A., Inhibition of Mammary Tumorigenesis by Concord Grape Juice Constituents. J. Agric. Food Chem, 51: 72807286. (2003). Singleton V. L., Oxygen with phenols and related reactions in must, wines and model systems, observations and practical impli cations. Am. J. Enol. Vitic., 38: 69–77. (1987). Soleas G. J., Diamandis E. P., Goldberg D. M., Wine as a biological fluid: history, production, and role in disease prevention. J. Clin. Lab. Anal., 11: 287-313. (1997). Somma G., Vini. Conoscere e riconoscere i vini, i vitigni, le uve e le cantine migliori d’italia, DeAgostini. (2008). Stevenson T., The sotheby’s wine encyclopedia. DK. (2005). Taverne Y. J., Bogers A. J, Duncker D. J., Merkus D., Reactive oxygen species and the cardiovascular system. Article ID 862423, 2013: 1-15. (2013). Tseng K.C., Cang H.M., Wu J.S.-B., Degradation Kinetics of antocyanins in ethanolic solution. J. Food Process Preserv., 30: 503-514. (2006). Wang J., Ho L., Zhao Z., Seror I., Humala N., Dickstein D.L., Thiyagarajan M., Percival S.S., Talcott S.T., Pasinetti G.M., Moderate consumption of Cabernet sauvignon attenuates a neuropathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. J. FASEB, 20: 2315-2320. (2006). Yilmaz Y, Toledo RT., Major flavonoids in grape seeds and skins: antioxidant capacity of catechin, epicatechin, and gallic acid. J. Agric. Food Chem., 58(2):255-60. (2004). 108
  • 110. 109
  • 111. 110
  • 112. 111