MIGLIORAMENTE TECNOLOGICI NELL’ANALISI DEL PRODOTTO
VITI VINTICOLO
APPROFONDIMENTO
La cromatografia
Storia
L'invenzione de...
cromatogramma.
Selettività (α): per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono essere il più
distanti p...
Cromatografia a scambio ionico
La cromatografia a scambio ionico, o semplicemente cromatografia ionica (IC), è il tipo di
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La soppressione permette di rivelare, tramite rivelatore a conducibilità, quantità di metalli in tracce
con ottima accurat...
Cromatografia di esclusione molecolare
La cromatografia di esclusione molecolare è un processo di analisi che si utilizza ...
Cromatografia di ripartizione
Si parla di cromatografia di ripartizione, quando la fase stazionaria è un liquido che impre...
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Cromatografia di affinità
La cromatografia di affinità è una tecnica cromatografica che si basa sulle interazioni...
High-temperature liquid chromatography
La high-temperature liquid chromatography (in italiano "cromatografia liquida ad al...
base di silice, invece, non sono stabili oltre i 100 °C, benché le loro prestazioni siano migliorate con
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17 aprile approfondimento b

  1. 1. MIGLIORAMENTE TECNOLOGICI NELL’ANALISI DEL PRODOTTO VITI VINTICOLO APPROFONDIMENTO La cromatografia Storia L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico italo-russo Michail Cvet (pronunciato e a volte trascritto Tswett) nel 1906, quando riuscì, con questa tecnica, a separare la clorofilla da un estratto vegetale.[1] Cvet procedette ponendo una piccola quantità di estratto di foglie verdi alla sommità di una colonna di vetro riempita con particelle di argilla e lavando successivamente il campione. Fece poi colare, attraverso la colonna, dell'etere di petrolio. A mano a mano che l'etere di petrolio fluiva trascinando con sé il campione, questo si separava in bande di diverso colore (da qui il nome "cromatografia"), ciascuna delle quali procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità. Con il suddetto esperimento Cvet mise in evidenza la possibilità di impiegare questo sistema di frazionamento, creando le basi della moderna cromatografia. Il termine si richiama alla separazione di bande di diverso colore e viene ancor oggi utilizzato anche se raramente la separazione si basa sulla differenza cromatica. Questa tecnica è oggi infatti applicata all'analisi di sostanze anche incolori, utilizzando il trasferimento tra le fasi con procedimenti più elaborati ed apparecchiature che possono avere notevole complessità. Con il termine cromatografia oggi si indicano in genere tutte le varie tecniche separative, applicabili a miscele di sostanze e basate sulla distribuzione fra due fasi in cui si utilizza uno stesso principio, la diversa velocità con cui i differenti componenti di una miscela migrano in una fase stazionaria sotto l'influenza di una fase mobile, che ha il compito di trascinare lungo il sistema i soluti che costituiscono la miscela in esame. Quando il rivelatore posto in fondo all'apparecchio registra il passaggio di una sostanza eluita, elabora i dati su di un "cromatogramma", un grafico che rappresenta la quantità di sostanza rilevata in funzione del tempo. Ogni volta che una sostanza viene rivelata, il cromatogramma registra un picco più o meno alto a seconda della sua concentrazione. Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabile, deve avere una buona risoluzione. Per risoluzione si intende un parametro che mette in relazione l'efficienza, la selettività ed il fattore di ritenzione. Oltre che considerazioni quantitative, dal cromatogramma si possono trarre anche considerazioni qualitative in base ai diversi tempi in cui compaiono i picchi. Grandezze fondamentali Tempi di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile. Fattore di capacità (k'): è un parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col tempo morto. Matematicamente esso è determinato dal rapporto delle moli di analita presenti nella fase stazionaria (nS) e quelle presenti nella fase mobile (nM), ovvero: Con opportune sostituzioni si arriva alla formula seguente: L'equazione in questa forma risulta molto più semplice da applicare in quanto la differenza tra tempo di ritenzione e tempo morto, ed il tempo morto stesso sono direttamente ricavabili dal
  2. 2. cromatogramma. Selettività (α): per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversa devono avere tempi di ritenzione diversi. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro. Da un punto di vista matematico, la selettività è definita come il rapporto tra i fattori di capacità di due diverse sostanze (a e b) dello stesso cromatogramma, con k’A < k’B quindi: Quanto più la selettività è maggiore di 1, tanto migliore sarà la separazione cromatografica. Efficienza: avere una buona selettività non basta. Infatti, anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongono fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie vengano eluite con la stessa velocità, di modo che la banda all'interno della colonna cromatografica sia il più stretta possibile. L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna, si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici (N). Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria; sostanzialmente un piatto teorico è la più piccola fetta della colonna in cui due molecole dotate di diverso coefficiente di ripartizione hanno la possibilità di dimostrare diverse velocità di migrazione. Migliore una colonna, minore è l’altezza del piatto teorico (lo ‘spessore’ della fetta).
  3. 3. Cromatografia a scambio ionico La cromatografia a scambio ionico, o semplicemente cromatografia ionica (IC), è il tipo di cromatografia che si basa sul principio di attrazione tra gli ioni di carica opposta. Molti composti organici, come ad esempio gli amminoacidi, possono avere parti della molecola polari favorendo quindi la loro separazione tramite questo metodo. La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pKa e dal pH della soluzione. Molto importante è anche il ruolo della determinazione della concentrazione dei cationi e anioni nell'ambito dell'analisi delle acque. La cromatografia a scambio ionico permette di separare molto semplicemente gli ioni. È molto utile per la purificazione di campioni analitici poiché, ad esempio, si potrebbe aver bisogno di analizzare un anione in una matrice di cationi. Come le altre metodiche cromatografiche è inoltre in grado di effettuare determinazioni quali-quantitative La tecnica Nella cromatografia a scambio ionico la fase stazionaria è costituita da macromolecole contenenti dei siti attivi ionizzati, in cui i controioni[1] possono essere scambiati con altri aventi carica uguale, eluiti con la fase mobile. Si instaura così una sorta di competizione fra i controioni della fase stazionaria e quelli della miscela in fase di separazione, nei confronti dei siti attivi ionizzati della fase stazionaria. Durante la separazione gli ioni presenti nella fase mobile vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinità per ciascuno dei siti ionizzati della fase stazionaria. Come nella normale cromatografia, si ha una colonna cromatografica impaccata con uno speciale tipo di resina, in grado di scambiare ioni. Esistono due tipi di resine: scambiatrici anioniche e scambiatrici cationiche. Queste ultime possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente, viceversa la prima. Esempio classico di gruppo in grado di scambiare cationi è -SO3-, mentre un tipico gruppo che scambia anioni è il gruppo -NH4+. Molto importante, ai fini di determinare l'intensità dell'interazione fase fissa-analita, è il rapporto carica/massa: utilizzando infatti il modello elettrostatico è possibile spiegare i diversi tempi di ritenzione, essendo le specie ioniche aventi maggior rapporto carica/massa quelle a essere maggiormente trattenute (ad esempio Na+ esce prima rispetto a Fe3+ e lo stesso Fe3+ segue Fe2+). Pellets di resina a scambio ionico. Molti scambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene (polistirene). Il polistirene essendo un polimero lineare è solubile in numerosi solventi. Condensando invece stirene con divinilbenzene si ottengono polimeri con legami crociati e quindi insolubili: più è alto il numero di legami crociati maggiore sarà la capacità di trattenere composti ad alto peso molecolare. Alla lunga queste colonne devono essere rigenerate e di solito si usano sali in grado di creare composti più stabili con gli ioni in colonna, in modo da rigenerare la resina (di solito si usa cloruro di sodio concentrato). Altre colonne, meno pregiate, utilizzano invece la silice opportunamente modificata chimicamente. Soppressione Esistono in commercio strumentazioni in grado di attuare quella che viene definita cromatografia a scambio ionico con soppressione. Il termine soppressione si riferisce all'annullamento della conducibilità elettrica dovuta ai componenti ionici presenti nell'eluente. La soppressione è di fondamentale importanza quando si effettua ad esempio la determinazione simultanea dei cationi e degli anioni, e viene effettuata utilizzando una seconda colonna dopo quella di separazione. Questa seconda colonna sarà di scambio anionico quando si effettua la separazione di cationi e viceversa di scambio cationico quando vengono separati gli anioni. Ad esempio, utilizzando una resina a scambio anionico del tipo -NH4+OH- e un eluente tamponato con ioni HCO3- e CO32-, una colonna di soppressione a scambio cationico del tipo -SO3-H+ rilasciando lo ione idrogeno neutralizza HCO3- e CO32- producendo anidride carbonica e acqua, specie che non conducono la corrente elettrica. Nell'utilizzo pratico la soppressione sfrutta più agevolmente apposite membrane autorigeneranti, piuttosto che le classiche colonne.
  4. 4. La soppressione permette di rivelare, tramite rivelatore a conducibilità, quantità di metalli in tracce con ottima accuratezza ed è indispensabile per molte analisi ambientali.
  5. 5. Cromatografia di esclusione molecolare La cromatografia di esclusione molecolare è un processo di analisi che si utilizza per separare sostanze organiche aventi elevati pesi molecolari, soprattutto proteine e macromolecole. Il concetto che sta alla base di questa separazione è molto semplice: la "fase stazionaria" è un supporto inerte costruito appositamente con pori di dimensioni controllate. La "fase mobile" è un solvente organico o acquoso ed eluisce i soluti attraverso la colonna cromatografica. I soluti con un volume maggiore dei pori della fase stazionaria (ovvero con un peso molecolare molto elevato) usciranno dalla colonna con il fronte del solvente, i soluti che invece hanno dimensioni minori rispetto al diametro e alla superficie dei pori saranno trattenuti dalla colonna per un tempo proporzionale al peso molecolare del soluto stesso. Nella cromatografia per esclusione si individua un V0 che è il volume della fase mobile che non occupa i pori e un VP che è il volume occupato dai pori. ogni soluto ha un suo caratteristico parametro nella cromatografia per esclusione chiamato coefficiente di distribuzione K' = V A / VP dove VA indica la frazione di VP occupato dal soluto in questione. Per VA = 0 si ha K' = 0, per VA = VP, si ha K' = 1. Nell'applicazione pratica si costruisce una retta di taratura: log p.m. vs Volume e da questa retta è possibile poi risalire ai pesi molecolari dei soluti che si sta analizzando.
  6. 6. Cromatografia di ripartizione Si parla di cromatografia di ripartizione, quando la fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte, in cui le sostanze da separare si solubilizzano. Durante l'eluizione le molecole delle sostanze si dispongono (ripartiscono) dinamicamente tra le due fasi a seconda della loro affinità in esse. Scontato ma importante, le fasi (stazionaria e mobile) devono essere immiscibili fra loro. Le due tecniche che ad oggi sfruttano il principio della ripartizione sono la gascromatografia e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). Il fenomeno della ripartizione viene sfruttato per la separazione in colonna degli analiti, che a seconda delle caratteristiche chimico fisiche si legheranno più o meno stabilmente alla fase stazionaria e quindi avranno diverso tempo di ritenzione. Fase stazionaria Gli analiti che attraversano la colonna, trasportati dal gas o dal solvente devono essere "catturati" dal materiale di riempimento che costituisce la fase stazionaria. Un tempo le fasi stazionarie erano costituite da materiali organici specifici. Al giorno d'oggi le fasi stazionarie sono costituite da un solido inerte al quale viene fissato stabilmente un liquido organico specifico, che costituisce la "vera" fase nella quale avviene la ripartizione degli analiti. Questa tecnica si è dimostrata negli anni molto efficace, sia per la possibilità di preparare fasi stazionarie molto specifiche sia per la semplice rigenerazione delle colonne. Ripartizione Il gas o il solvente che trasporta l'eluito passando nella colonna (che nel caso del gascromatografia può raggiungere lunghezze di 60 m, essendo opportunamente avvolta a spirale) mette in contatto gli analiti con la fase stazionaria, nella quale a seconda delle caratteristiche chimico fisiche (affinità, polarità, peso molecolare) si scioglierà più o meno bene. La concentrazione di una sostanza ripartita tra due diverse fasi liquide obbedisce alla legge di Nernst, che stabilisce che il rapporto tra le concentrazioni del soluto nelle due fasi a contatto fra loro è una costante a temperatura costante per un dato soluto: . K rappresenta il coefficiente di ripartizione. Gli analiti che hanno peggiore affinità saranno i primi ad abbandonare la colonna e quindi raggiungere il rivelatore. Man mano che procede l'analisi si può intervenire sulle condizioni per modificare la ripartizione. Analisi isoterma e isocratica La tecnica isoterma (a temperatura costante, nella gascromatografia) o isocratica (a composizione del solvente costante, nell'HPLC) sfrutta generalmente la capacità di separazione degli analiti sulla base del peso molecolare: i più leggeri usciranno per primi, a mano a mano che il peso aumenta aumenterà anche il tempo di ritenzione degli analiti. Analisi programmata e gradiente Nel caso in cui le sostanze da separare abbiano peso molecolare molto simile la tecnica isoterma o isocratica non riuscirebbe a separare efficacemente gli analiti. In questo caso si sfrutta la diversa volatilità o la diversa solubilità in un solvente per rimuovere efficacemente gli analiti dalla fase stazionaria. Nel caso della gascromatografia si può programmare una serie di rampe d temperatura alla quale viene sottoposta la colonna, e l'analisi viene definita programmata. In HPLC si varia in modo continuo la composizione del solvente, ad esempio passando da una fase mobile polare ad apolare, per sciogliere in "gradiente" sostanze che hanno diversa polarità.
  7. 7.     Cromatografia di affinità La cromatografia di affinità è una tecnica cromatografica che si basa sulle interazioni che si formano tra una sostanza ed il relativo ligando. Utilizzando una colonna, essa è schematizzabile in tre fasi: la prima consiste nell'aggiunta della miscela contenente l'analita con formazione del legame tra ligando e composto in esame (da ciò si deduce l'importanza di conoscere le caratteristiche chimico fisiche della sostanza in esame), nella seconda fase si effettua la pulizia aggiungendo una opportuna soluzione di lavaggio che allontana le altre molecole presenti, mentre la terza fase consiste nella scissione del legame con il ligando ad opera dell'eluente, che permette di separare la sostanza interessata portandola in soluzione. La cromatografia di affinità è di utile uso pratico nella separazione delle biomolecole, sfruttando ad esempio il legame selettivo tra un enzima e il suo substrato, tra ormoni e recettori, o tra antigeni e anticorpi (in questo caso si usa il termine immunoaffinità). Fase stazionaria La fase stazionaria solida (chiamata anche matrice) deve avere le seguenti caratteristiche: contenere molti ligandi specifici per il composto; deve essere stabile; deve avere solo deboli interazioni con il composto, in modo da non comprometterne l'eluibilità; deve avere buone capacità di flusso. Fasi solide molto usate sono la cellulosa, il gel di agarosio o di agarosio-acrilammide.
  8. 8. High-temperature liquid chromatography La high-temperature liquid chromatography (in italiano "cromatografia liquida ad alta temperatura"), abbreviata in HTLC, è una variante della cromatografia liquida che sfrutta l'utilizzo di alte temperature per la separazione degli analiti. L'utilizzo di alte temperature è noto diminuire la ritenzione e quindi i tempi di analisi, dando così la possibilità di migliorare la risoluzione. Inoltre dà la possibilità di effettuare dei gradienti di temperatura invece di gradienti di eluenti. Infine, abbassa la viscosità della fase mobile: in questo modo anche l'acqua acquisisce delle proprietà simili a quelle di un solvente organico[1], rendendo possibile il suo utilizzo per una cromatografia a fase inversa; questo è particolarmente vantaggioso per questioni di semplicità, costi, rifiuti non tossici e possibilità di accoppiamento con tecniche per le quali l'uso di un solvente organico è mal sopportato (ad esempio le tecniche basate sul plasma accoppiato induttivamente) o proprio proibito (come la spettrometria di massa isotopica). Caratteristiche Le condizioni strumentali e operative, dal settaggio della temperatura alla scelta della fase stazionaria, sono un parametro particolarmente critico per ottenere buoni risultati. Temperatura Benché alcuni autori considerassero la temperatura ambiente la soglia per parlare di "alta temperatura", oggi tale soglia minima è convenzionalmente fissata a una temperatura vicina al punto di ebollizione dell'eluente, ovvero la temperatura a cui è necessario applicare un accorgimento tecnico (ad esempio un regolatore di contropressione) per evitare che l'eluente passi alla fase vapore. Tale valore è fissato intorno ai 60 °C, poiché i solventi comunenemente usati nella cromatografia in fase inversa (metanolo, THF) hanno punti di ebollizione vicino a quel valore. Il valore massimo di temperatura, invece, è quello a cui l'eluente cambia le sue proprietà diventando un fluido supercritico. Tale valore è fissato a 374 °C, temperatura critica più alta osservata (quella dell'acqua). Nonostante l'ampio range di temperatura utilizzabile, comunque, la temperatura di lavoro in HTLC è normalmente intorno ai 200 °C, per due motivi: sia perché i sistemi di riscaldamento convenzionali non sono in grado di raggiungere temperature maggiori (anche se sono noti lavori in cui si arrivava a temperature di 370 °C[2]), sia perché in queste condizioni è possibile usare le colonne senza ottenere degradazione della fase stazionaria per lungo tempo. Strumentazione Le condizioni strumentali e operative, dal settaggio della temperatura alla scelta della fase stazionaria, sono l'aspetto più critico della tecnica. Innanzitutto il sistema di riscaldamento dev'essere sufficientemente veloce e preciso per ottenere risultati accurati e riproducibili. Inoltre, è opportuno posizionare un coil di pre-riscaldamento prima della colonna, altrimenti si generano dei gradienti di temperatura dell'eluente che entra nella colonna, con conseguente allargamento (o addirittura appiattimento) dei picchi. Infine, è spesso necessario far passare il capillare dopo l'uscita dalla colonna in un bagno raffreddato, in maniera tale che la temperatura dell'eluente sia controllata; questo è importante per detector sensibili alle variazioni di temperatura dell'eluente, come quelli a indice di rifrazione, fluorescenza o UV, meno per altri dove l'eluente viene trasformato in vapore prima di essere analizzato, come la spettrometria di massa o l'ELSD. Per evitare che l'eluente liquido subisca una transizione alla fase vapore a causa della temperatura superiore al suo punto di ebollizione, è necessario applicare un regolatore di contropressione oppure un capillare di restrizione; questo non è necessario quando viene usata acqua con temperature di poco superiori ai 100 °C, dato che la sua pressione di vapore non cambia di molto in quel range. Per quanto riguarda la fase stazionaria, è necessario utilizzare dei materiali che resistano alle alte temperature senza degradarsi in tempi brevi. Per questo sono molto usate le fasi a base di ossidi metallici (es. ossido di zirconio o di ossido di titanio), di polimeri puri (es. polistirenedivinilbenzene) o di grafite, le quali riescono ad arrivare a 200 °C. Le normali fasi stazionarie a
  9. 9. base di silice, invece, non sono stabili oltre i 100 °C, benché le loro prestazioni siano migliorate con l'utilizzo di nuove tecnologie ibride (come la stabilizzazione con ponti di etilene). Analiti Poiché ad alte temperature gli analiti potrebbero degradarsi, durante l'ottimizzazione del metodo è bene verificare la loro stabilità, tenendo conto che essa dipende dalla colonna utilizzata.

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