Dna replic transc_tradu2010
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  • Si la síntesis es 50 nucleótidos por segundo, se demoraría más de un mes en sintetizar los 3,9 x 10(9), casi dos metros de DNA. Por lo tanto, la síntesis se inicia asincrónicamente en varios puntos del genoma y se unen las burbujas de replicación al toparse.

Dna replic transc_tradu2010 Dna replic transc_tradu2010 Presentation Transcript

  • Clase: DNA, RNA y proteínas Curso: Biología Celular y Genética I 1er Año Odontología Dra. Ruby Valdivia A.
    • Estructura y conformación del DNA
    • Dogma central de la biología molecular celular
    • Replicación del DNA
    • Técnicas de análisis del DNA:
    • a) Basadas en replicación: Secuenciación del DNA
    • b) Basadas en enzimas de corte palindrómico: Mapas de restricción.
    • c) Basadas en separación por tamaño de fragmentos de DNA en campo eléctrico: Electroforesis
    • 5. T ranscripción del DNA .
    • 6. Procesamiento de los RNA
    • 7. Traducción de la información y síntesis de proteínas.
  • Estructura y conformación del DNA Linus Pauling: triple helix con fosfatos en el centro y bases hacia fuera. Era imposible mantener las tres hélices unidas. James Watson: doble helix con bases apiladas en el centro. Los puentes de hidrógeno estabilizan la doble hélice. Evidencias: 1950, E. Chargaff 1952: M. Wilkins, R. Franklin y R. Gosling
  • El dogma central de la biología Ribozimas Transcriptasa Reversa DOGMA CENTRAL DNA RNA Proteínas
  • La Transcriptasa Reversa David Baltimore Howard Temin
  • Quiebre del Dogma
    • Libre de células se agregó NTP , T marcado y se comprobó que la síntesis era de DNA, que necesitaba una proteína, y que el templado era RNA, porque
    • Agregó RNAsa= intacto DNA
    • Agregó DNAsa= se destruye DNa
    • Agregó tripsina antes de la síntesis y no se producía DNA, ni RNA.
    • Agregó RNAsa antes de la síntesis y no se producía ni DNA ni RNA.
    • Conclusión existe una enzima que sintetiza DNA a partir de RNA, la llamamos DNA pol dependiente de RNA, pero se conoce ahora como: “TRANSCRIPTASA REVERSA”
  • El virus logra usar la célula eucarionte para replicarse y reproducirse
  • Síntesis de DNA a partir de RNA mediante la Transcritasa Reversa, eliminación del RNA patrón y síntesis de la hebra complementaria de DNA para obtener la doble hebra y luego activar sus propios genes para producir nuevos virus. 1) Patrón RNA usado para síntesis de una hebra de DNA por T. Reversa 2) Patrón RNA es eliminado por RNAsa 3) La hebra de DNA nueva, se usa para copiar la hebra complementaria 4) Se transcriben los genes de este DNA del virus y se producen virus.
  • ¿Cuál es el modelo de Replicación del DNA? ¿Cuál es el mecanismo de replicación? a) ¿Conservativo? Las hebras antiguas se complementan y las nuevas se complementan. b)¿Semicoservativo? Las hebras antiguas y las nuevas se mezclan complementariamente.
  • Experimento de Mat Meselson y Frank Stahl 1) Se creció bacterias en 15 N 2) Se guardó una parte tubo 1 y el resto se transfirió a 14 N (normal, liviano) para replicación del DNA. 3) Se tomó muestras cada vez que se duplicaba la población de bacterias (tubo 2 y 3) y un tubo 4 control con muestras crecidas sólo en 14 N. 4) Se centrifugó para separar las fracciones de DNA liviano y pesado
  • Replicación semiconservativa Tubo 1. bacterias crecidas con 15 N Tubo 2. bacterias duplicadas 1 vez con 14 N Tubo 3. bacterias duplicadas 2 veces con 14 N Tubo 4. bacterias control crecidas con 14 N Resultado Explicación Tubo 2: 1 hebra vieja y 1 copia nueva juntas (1 banda intermedia, entre liviana y pesada) Tubo 3: Ya tiene 2 replicaciones, por lo que 1 hebra se copia sobre 1 vieja y la otra sobre la nueva, observando 2 bandas: la mezclada y la totalmente nueva (liviana) Todo DNA Templado Marcado con 15 N 1 banda pesada Todo DNA Templado Marcado con 14 N 1 banda liviana
  • Experimento de Arthur Kornberg: DNA polimerasa En un tubo con DNA agregó la enzima DNA polimerasa, los 4 nucleótidos, incluyendo los TTP radioactivos. Resultado: Nuevo DNA marcado indica que el DNA se autoreplica. Al digerir con DNasa el DNA templado: No hay síntesis de DNA Al no agregar uno de los 4 nucleótidos: No hay síntesis de DNA Conclusiones: Se requiere DNA templado intacto, 4 tipos de nucleótidos y enzima DNApolimerasa. Timina radioactiva Hebra Nueva Timina Radioactiva Hebra Nueva
  • El genoma eucarionte y su replicación
    • El genoma de eucariontes es hasta 100 x más largo que el de procariontes.
    • Está empaquetado en varios cromosomas que deben ser copiados.
    • Cada cromosoma tiene telómeros (en sus extremos).
    • Los cromosomas tienen niveles de empaquetamiento en asociación con proteínas: hebra de nucleosomas (10 nm), solenoide de 30 nm (6 nucleosomas); vueltas de solenoides de 300 nm. (interfase).
  • Consideraciones generales
    • Para alcanzar a replicar durante la fase “S”, debe:
    • Poseer varios sitios de inicio (Múltiples Orígenes de Replicación)
    • Poseer proteínas que regulen la unión y actividad de polimerasas durante el ciclo celular.
    • Poseer enzimas o mecanismo de replicación de telómeros.
    • Coordinar la síntesis de histonas y la reorganización de la cromatina en las hebras nuevas y patrón.
  • Orígenes de Replicación
    • En eucariontes inferiores, levaduras por ejemplo, existen secuencias del DNA que determinan el Ori, pero en organismos superiores no se ha podido encontrar una secuencia que determine el punto donde se formará una burbuja de replicación y se inician a distintos tiempos en S.
    • Por lo tanto, se dice que los Ori, en eucariontes sup. son:
    • Múltiples
    • Inespecíficos
    • Asincrónicos
    • Bidireccionales
  • Con Licencia para Replicar el DNA En Bacterias, Proteínas regulan el sitio de inicio ÚNICO por reconocimiento de secuencia rica en Adeninas y timinas. En eucariontes: El control no está dado por sitio, sino por factores que dan licencia para Iniciar, RLF (Replicación-Licencia-Factor) presentes sólo en post M y G1.
  • Modelo de replicación y la doble hélice J. Watson y F. Crick: modelo de replicación del DNA
  • Proceso de Obtención de Licencia replicativa
    • Terminada la Mitosis:
    • Se obtienen Proteínas Iniciadoras ORC + ATP, que se unen al DNA y sólo marcan el origen de replicación. Si no pasa por mitosis, no se adquiere este ORC.
    • Al inicio de G1:
    • Factores de carga de helicasas (Cdc6P y Cdt1), se unen y actúan como la Dna-C (ATPasa que lleva la helicasa al DNA en bacterias).
    • 3. En medio de G1:
    • Se unen las MCM (HELICASAS=DnaB), Son hexámeros con actividad ATPasa, inhibida mientras tenga unida DnaC.
    • LISTO:
    • ¡ Con LICENCIA para replicar!!!!
    • = COMPLEJO PRE-REPLICATIVO.
    Licenciado G1- medio Pre-licencia G1-temprano
  • Obtención del Complejo Replicativo Enzimas SSB (unión a simple hebra), se unen a las hebras y estabilizan la hebra abierta. Se unen las enzimas Primasas (DnaG) que sintetizan el iniciador con 10 nucleótidos de RNA cada 200 bases de DNA (aprox) en la hebra atrasada. Las helicasas unen Primasas. HELICASAS+PRIMASAS= PRIMOSOMA Se unen 2 unidades de holoenzima DNApolimerasa, una holoenzima por hebra. Helicasas + Primasas + DNApolimerasa III = REPLISOMA Ahora está listo !!!! con licencia, materia prima y máquina para REPLICAR. Complejo pre-Replicativo REPLISOMA
  • Las DNA polimerasas DNA polimerasas: DNA pol delta (en líder) DNA pol epsilon (en atrasada) En mamíferos: 50 n/segundo Todas las DNApol trabajan sólo en sentido 5’  3’ ,es decir: la nueva hebra crece por el extremo 3’. La DNApol necesita: a) el extremo 3’ para agregar nucleotidos. b) bases apareadas. La DNApol está capacitada para: a) Síntesis de DNA b) Actividad exonucleásica:Auto-corrección, eliminando las bases mal apareadas. (edita) Hebras de DNA Patrón o molde DNA polimerasa Horquilla de replicación DNA polimerasa DNA ligasa Hebra Líder o conductora Hebra atrasada 3’ 5’ 5’
  • DNApol III y DNApol I Procariontes Tiene 2 subunidades: Dimérica La deslizadora la mantiene unida al DNA hasta que termina la síntesis. Es la principal replicadora. Replica ambas hebras. Tiene actividad exonucleásica 3’  5’ de reparación. Tiene 1 unidad: Monomérica Se desprende fácilmente del DNA Cumple dos funciones, elimina el corto partidor de RNA (exonucleasa) y lo reemplaza por DNA. Velocidad es 250-1,000 nucleotides/segundo Velocidad es 20 nucleótidos /seg 10 a 20 moléculas por célula. Es procesativa, porque pocas unidades se mantienen trabajando hasta terminar. 400 moléculas por célula. Es distributiva, porque se despega después de cada síntesis de 10 nucleótidos (partidor), y se necesita más.
  • Otras proteínas y detalles en el proceso de replicación de EUCARIONTES
    • Las Toposisomerasas desenredan el DNA (lo cortan reversiblemente):
    • Cada 10 pb el DNA tiene una vuelta, por lo tanto, al abrirse el DNA se presiona a medida que avanza sobre el Complejo de replicación. Las Topoisomerasas deben cortar la hebra para desenrollarla y rápidamente unirla, para que siga avanzando la replicación. El corte requiere ATP, pero la re-unión del enlace fosfodiester es espontáneo, no requiere ATP, porque usa la energía acumulada en la tirosina de la Topo unida al fosfato.
    • Exonucleasa que elimina iniciador de RNA y lo reemplaza por DNA.
    • La DNA ligasa une los segmentos de la hebra atrasada.
    Los nucleosomas están cada 200 pb, coincidentemente los fragmentos de Okasaki en eucariontes son de 200 pb de largo. Los nucleosomas se mezclan nuevos y viejos en las dos hebras del DNA.
  • ¿Término de la síntesis de DNA? El extremo 3’ TTAGGGG no replicado se pliega, (aprox. 100 n) “T-loop”.
  • Los telómeros Los telómeros son los extremos de los cromosomas eucariontes. Ricos en TTAGGGG TTAGGGG Extremo del cromosoma
  • La Telomerasa es una enzima que agrega secuencia repetitiva al extremo de los cromosomas La telomerasa posee una actividad de: a) Primasa: tiene trozo de RNA: AAUCCC b) Transcriptasa Reversa: sintetiza DNA extendiendo el 3’ usando su propio molde de RNA varias veces como templado independiente de la otra hebra. Cromosoma Síntesis de DNA
  • Replicación del DNA y secuenciación Frederic Sanger
  • Resultado de secuenciación con ddA
  • Lectura de secuenciación
  • Enzimas de restricción Corte G AATTC Corte
  • Electroforesis de DNA cortado
  • Mapas de restricción
  • RNA y su función 1) Hacer crecer bacterias en isótopos radioactivos pesados C y N para marcar así todo el RNA y proteínas de las bacterias. 2) Se infectan con fagos. 3) Se transfieren de inmediato a solución con 32 P, que marcará sólo el nuevo ácido nucleico. 4) Se aisla el RNA y los ribosomas bacterianos por fraccionamiento en centrifugación.
  • Resultados separación fracciones Ribosomas Completo s ensamblados en banda pesada También se encontró 32P en el fondo del tubo (RNAs en citoplasma) 32 P 32 P Unidades separadas de Ribosomas en banda liviana, menor peso En banda pesada se detectó 32P (RNA) 32 P 32 P
  • El RNA de transferencia y el mRNA Conclusión: la macromolécula mediadora entre DNA y proteínas es un mRNA asociado a ribosomas. También se encuentra mRNA libre en el citoplasma.
  • Transcripción
    • En los eucariotes hay tres tipos de RNApol:
      • RNApol I transcribe rRNA
      • RNApol II transcribe mRNA
      • RNApol III transcribe tRNA
    • Moléculas libres de RNApol colisionan aleatoriamente con el DNA
    • Se une fuertemente con una secuencia específica: el promotor
    • El promotor incluye un sitio de reconocimiento (unión entre RNA pol y DNA) y un sitio de iniciación para la síntesis del RNA
    Más detalles en clase de regulación de la expresión génica
  • Elementos de la transcripción
    • Secuencias conservadas en diversos genes
    • Procariotes
      • Caja pribnow (5-8 nucleótidos río arriba)
      • Caja AAA 25 nucleótidos río arriba
    • Eucariotes
      • caja TATA a -10 y otra a -35
    • Factores asociados a la RNApol que le permiten reconocer y dar inicio a la transcripción
    • Procariotes
      • Factor Sigma
    • Eucariotes
      • Factores de transcripción: proteínas reguladoras de la expresión génica
  • Complejo de Reconocimiento del Promotor TFIID y RNApol
    • Para iniciar la transcripción se requiere:
    • Varias proteinas específicas de unión unidos a elementos enhancer del DNA. (DBD)
    • El complejo de reconocimiento del promotor: TFIID ( constituido por muchas proteinas, TBP: Tata Binding Protein, TAFs: Factores de unión a TBP, etc.)
    • La holoenzima RNApolimerasa II (tiene 9 subunidades) unida a la secuencia iniciadora de transcripción (rica en pirimidinas: INR) ubicada en el -1 del gen que se transcribirá.
    RNA pol II de levadura DBD POL II TAF TBP
  •  
    • La RNApol se une al promotor
    • Abre la doble hélice del DNA
    • Expone los nucleótidos
    • La cadena 3’ 5’ sirve como molde
    • Apareamiento bases complementarias con NTP errantes
    • Unión por la RNApol de los NTP entre sí
  •  
    • Elongación de la cadena de RNA por desplazamiento de la RNApol
    • Formación de una hélice corta de RNA/DNA
    • Reenrollamiento del DNA por detrás del sitio de polimerización de la RNApol
    • Encuentro con la señal de terminación
    • Liberación de la RNApol
  • Secuencias consenso
    • Secuencias relacionadas con el inicio de la transcripción:
      • Cajas río arriba
      • Promotores (fuertes y débiles)
    • Secuencias relacionadas con la terminación de la transcripción:
      • secuencias ricas en adenina
      • seguidas por secuencia palindrómica
      • zona rica en C-G
      • factor rho (bacterias)
  • Modificaciones postranscripcionales
    • Adición de un cap en el extremo 5’ (metilguanosina unida al fosfato)
      • En bacterias hay secuencia de iniciación específica, y el ribosoma se une al AUG más cercano: mRNA son Policistrónicos
    • Adición de +- 200 residuos adenílicos o poliA en el extremo 3’
    • Splicing
  •  
  • Splicing
    • En células de eucariotes los transcritos son alterados por splicing (corte y empalme)
    • Eliminación de secuencias intrónicas
    • Conservación de exones
  • Características de los tRNA
    • Unen por uno de sus extremos (anticodón) a un codón y por otro al aminoácido específico para este codón
    • Permite que los aminoácidos se alineen según la secuencia de DNA
    • Activa el aminoácido generando una unión carboxílica rica en energía y produciendo el enlace peptídico
    • Forma del tRNA “cruce de carreteras en forma de trébol”
  •  
    • Las enzimas llamadas aminoacil tRNA sintetasas acoplan cada aminoácido a su grupo de moléculas de tRNA apropiada
    • Existe una enzima diferente para cada aminoácido
    • Los aminoácidos se van añadiendo al extremo carboxilo terminal de una cadena polipeptídica en crecimiento
  • Traducción de la información
    • La información almacenada en el RNA se transfiere a moléculas específicas de proteínas
  • La síntesis proteica está catalizada sobre el ribosoma
    • Los ribosomas son grandes complejos de RNA y proteínas
    • Poseen una subunidad pequeña y otra grande
    • El ribosoma tiene 3 lugares de unión al RNA
    • Lugar de unión para el mRNA
    • Lugar P: une al tRNA unido al extremo de la cadena polipeptídica en crecimiento
    • Lugar A: une al tRNA entrante unido al aminoácido
  • Traducción del mensaje en ribosomas http://tidepool.st.usm.edu/crswr/protsynthmov.html
    • tRNA sintetasa une los aminoácidos a los tRNA
    • con el anticodón respectivo
    tRNA cargado con su aa Enzima tRNA sintetasa
  • Se une el mRNA a la subunidad menor mRNA Ribosoma subunidad menor Ribosoma subunidad mayor tRNA con leucina tRNA con metionina
  • Se une la subunidad mayor y se inicia la síntesis del péptido
  • El mRNA se mueve mRNA Péptido siendo sintetizado tRNA liberados sin su aa tRNA libres con su aa
  • Codón de término, libera el péptido
  • Fin de la Traducción Se une un factor de término (una proteína) Factor de término Péptido formado (proteína) mRNA se libera Se separan las subunidades del ribosoma
  • Inicio de la síntesis
    • La subunidad menor se une al mRNA
    • Se une un tRNA iniciador a la subunidad menor
    • Se une la subunidad mayor
    • Todas las proteínas comienzan con metionina, que puede ser eliminada por una peptidasa
  • Elongación de la cadena polipeptídica
    • Unión de una tRNA al codón del mRNA en el sitio A del ribosoma
    • El extremo carboxilo de la cadena polipeptídica se desacopla del tRNA del lugar P y se une a través de un enlace peptídico al aminoácido del tRNA del lugar A (peptidil transferasa)
    • Catálisis mediada por la molécula mayor de rRNA de la subunidad mayor
    • Término de la síntesis
    • El nuevo peptidil tRNA se transloca al lugar P cuando el mRNA se desplaza en el ribosoma (energía aportada por hidrólisis de un GTP)
    • 1 ciclo es 1/20 segundo
    • Cuando se alcanza uno de los tres codones de terminación la cadena proteica se libera del ribosoma
    • UAA, UAG, UGA unen el factor de liberación
    • El ribosoma se libera del tRNA y se disocia
  • La fidelidad de la síntesis de proteínas está aumentada por 2 procesos independientes de corrección de edición
    • tRNA sintetasa posee un sitio de reconocimiento del aminoácido y si hay un error lo libera por hidrólisis
    • El factor de elongación se une al tRNA, y cuando hay reconocimiento codón-anticodón hidroliza al GTP que lleva asociado y recién puede incorporarse el aminoácido a la cadena polipeptídica en crecimiento. Este retraso permite que los tRNA incorrectos abandonen el ribosoma.