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Esame del liquido seminale WHO 1999 WHO 2009   Loredana  Gandini Master Medicina  della  Riproduzione  Abano 25-27 / 03/ 2...
1980 1987 1992 1999 2009
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STANDARDIZZAZIONE  FASE  PRE-ANALITICA <ul><li>NORME PER LA RACCOLTA DEL L.S. </li></ul><ul><ul><li>GIORNI DI ASTINENZA </...
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STANDARDIZZAZIONE  FASE  ANALITICA Valutazione del campione
STANDARDIZZAZIONE  FASE  ANALITICA <ul><li>VALUTAZIONE  MACROSCOPICA </li></ul><ul><li>caratteristiche  reologiche </li></...
<ul><li>VOLUME </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>Aspetto </li></ul><ul><li>Fluidificazione  </li></ul><ul><li>Viscosi...
<ul><li>Volume (valore di riferimento WHO 1999  ≥ 2,0 ml) </li></ul><ul><li>Il volume dell’eiaculato si valuta in ml in un...
Volume del liquido seminale: WHO  2009 Trasferire il liquido seminale dal contenitore <ul><li>Il trasferimento del LS dal ...
STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA VALUTAZIONE  MICROSCOPICA
STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>Componente Cellulare Nemaspermica </li></ul><ul><li>Concentrazione </li></ul><ul>...
<ul><li>Concentrazione/ml </li></ul><ul><li>Concentrazione/eiaculato </li></ul><ul><li>v.r. ≥  20 x 10 6 /ml  </li></ul><u...
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Dilute semen 1+1 mit Formalin + Hoechst 33342 dye Fluorescence microscopy Leja 100 µm deep disposable chamber
STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>Lineare veloce </li></ul><ul><li>Lineare lenta </li></ul><ul><li>Discinetica o No...
WHO 1999   WHO 2009 Immotile  Grade d    IM Non-progressive  Grade c    NP Progressive      PR -slow  Grade b   optional -...
<ul><ul><li>TEST  DI  VITALITA’  </li></ul></ul><ul><ul><li>È consigliabile inserirlo nella valutazione seminale in caso d...
TEST  DI  VITALITA’
WHO 1999: old method % stained + % motile  >  100% WHO 2009: one step method % stained + % motile  <  100% <ul><li>Valutar...
STANDARDIZZAZIONE  FASE  ANALITICA <ul><li>La morfologia nemaspermica può essere valutata su un preparato a fresco utilizz...
<ul><li>Per eseguire uno “spermiocitogramma“ è necessario allestire per ogni campione più vetrini che verranno poi process...
<ul><li>Shorr </li></ul><ul><li>Colorazione  di  Papanicolau  </li></ul><ul><li>Colorazione  Diff Quik  </li></ul><ul><li>...
STANDARDIZZAZIONE  FASE  ANALITICA <ul><li>MORFOLOGIA </li></ul><ul><li>Forme  tipiche </li></ul><ul><li>Forme  atipiche <...
WHO  2009 cosa  viene  raccomandato ??? Riportare solo le forme morfologiche normali Valutare il preparato 2 volte Cambiam...
WHO  2009 Valori  di norma Valori di Riferimento
Distribuzione normale: Media e DS Distribuzione asimmetrica: Mediana e Percentili La distribuzione dei parametri seminali ...
Un approccio alternativo per descrivere dati come questi è l’uso della MEDIANA. La MEDIANA è quel valore rispetto al quale...
WHO  year   1987 1992 1999 2009 designation  normal normal reference Percentiles (non-parametric methods) 2.5 5 50 95 97.5...
Valori di Riferimento del Vol misurato in ml: descritti da  mediana  e  percentili (metodi non-parametrici) Curva asimmetr...
Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / ml Concentrazione/ml
Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / eiaculato Concentrazione/Eiac.
Valori di Riferimento della Motilità misurata in % di motilità progressiva Motilità Progressiva
Valori di Riferimento della Morfologia misurata in % di forme normali Forme  normali
WHO  year   1987 1992 1999 2009 designation  normal normal reference Percentiles (non-parametric methods) 2.5 5 50 95 97.5...
Normozoospermia   Numero totale di spermatozoi, percentuale di motilità progressiva (PR) e morfologia nella norma, al di s...
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Esame standard del liquido seminale e rivisitazione delle conclusioni raggiunte nella Consensus Conference del 2004 sulle caratteristiche seminologiche necessarie per le diverse tecniche di fecondazione assistita

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  1. 1. Esame del liquido seminale WHO 1999 WHO 2009 Loredana Gandini Master Medicina della Riproduzione Abano 25-27 / 03/ 2009
  2. 2. 1980 1987 1992 1999 2009
  3. 3. WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen Chapter 1 Introduction Part I Semen analysis Chapter 2 Standard procedures Chapter 3 Optional procedures Chapter 4 Research procedures Part II Sperm preparation Chapter 5 Sperm preparation techniques Chapter 6 Cryopreservation protocols Part III Quality Assurance Chapter 7 Quality Assurance and Control Part IV Appendices WHO 2009
  4. 4. … with some changes New Format Detailed methods - minimal cross reference to other sections Notes - explanations of methodology Comments - interpretation of results Boxes - additional explanatory material New Chapter Cryopreservation New Appendix Microscopy Reference ranges for semen parameter variables From fertile men with TTP < 12 months … much remains as in WHO 1999: Old concepts Standard - robust procedures for routine variables Optional - may be used in certain situations / by choice of institute Research - tests that are not considered routine WHO 2009
  5. 5. <ul><li>Workshop </li></ul><ul><li>Protocollo standard per la corretta esecuzione dello spermiogramma </li></ul><ul><li>7- 8 Novembre 2003 </li></ul><ul><li>Università di Roma “La Sapienza” </li></ul>
  6. 6. Workshop Protocollo standard per la corretta esecuzione dello Spermiogramma <ul><li>SOCIETA’ SCIENTIFICHE </li></ul><ul><li>Associazione Italiana di Patologia Clinica (AIPaC) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica (SIBioC) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Medicina di Laboratorio (SIMeL) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Andrologia Medica (SIAM) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Andrologia (SIA) </li></ul><ul><li>Società di Endocrinologia (SIE) </li></ul><ul><li>Società Italiana Embriologia, Riproduzione e Ricerca (SIERR) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Fisiopatologia della Riproduzione (SIFR) </li></ul><ul><li>Società Italiana di Fertilità e Sterilità (SIFES) </li></ul><ul><li>Società Italiana della Riproduzione (SidR) </li></ul>
  7. 7. STANDARDIZZAZIONE DELLE PROCEDURE PER L’ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE <ul><li>FASE PRE-ANALITICA </li></ul><ul><li>FASE ANALITICA </li></ul><ul><li>FASE POST-ANALITICA </li></ul>
  8. 8. STANDARDIZZAZIONE DELLE PROCEDURE PER L’ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE <ul><li>FASE PRE-ANALITICA </li></ul><ul><ul><li>Norme per la raccolta </li></ul></ul><ul><ul><li>Norme per la processazione </li></ul></ul>
  9. 9. STANDARDIZZAZIONE FASE PRE-ANALITICA <ul><li>NORME PER LA RACCOLTA DEL L.S. </li></ul><ul><ul><li>GIORNI DI ASTINENZA </li></ul></ul><ul><ul><li>MODALITA’ DI RACCOLTA </li></ul></ul><ul><ul><li>TIPO DI CONTENITORE </li></ul></ul><ul><ul><li>MODALITA’ DI CONSEGNA </li></ul></ul><ul><ul><li>MODALITA’ DI COMUNICAZIONE DELLE ISTRUZIONI </li></ul></ul>NO MODIFICHE
  10. 10. <ul><li>NORME PER LA PROCESSAZIONE </li></ul><ul><ul><li>Porre il contenitore in termostato a T controllata (35-37°C) per almeno 15 min. </li></ul></ul><ul><ul><li>Miscelare il campione delicatamente e valutare se è completato il processo di fluidificazione. </li></ul></ul><ul><ul><li>Trasferire il campione, mediante una pipetta, in una provetta conica trasparente e graduata. </li></ul></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE PRE-ANALITICA NO MODIFICHE
  11. 11. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA Valutazione del campione
  12. 12. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>VALUTAZIONE MACROSCOPICA </li></ul><ul><li>caratteristiche reologiche </li></ul><ul><li>VALUTAZIONE MICROSCOPICA </li></ul><ul><li>componente gametica </li></ul><ul><li>componente cellulare non nemaspermica </li></ul>
  13. 13. <ul><li>VOLUME </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>Aspetto </li></ul><ul><li>Fluidificazione </li></ul><ul><li>Viscosità </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA VALUTAZIONE MACROSCOPICA VALUTAZIONE MODIFICATA
  14. 14. <ul><li>Volume (valore di riferimento WHO 1999 ≥ 2,0 ml) </li></ul><ul><li>Il volume dell’eiaculato si valuta in ml in una provetta conica graduata. </li></ul><ul><li>Se il volume dell’eiaculato è inferiore o uguale al millilitro deve essere valutato mediante una micropipetta a volume variabile. </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA VALUTAZIONE MACROSCOPICA WHO 2009 Il volume viene valutato in modo indiretto, mediante il peso Densità del liquido seminale ( ~ 1 g/ml) (1.014 g/ml) Peso del contenitore (g) Peso del contenitore con liquido seminale (g) Calcolare la differenza di peso (g = ml ) x
  15. 15. Volume del liquido seminale: WHO 2009 Trasferire il liquido seminale dal contenitore <ul><li>Il trasferimento del LS dal contenitore mediante pipetta determina: </li></ul><ul><li>volumi più bassi </li></ul><ul><li>-0.4 a -0.9 ml (14%) </li></ul>X X X
  16. 16. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA VALUTAZIONE MICROSCOPICA
  17. 17. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>Componente Cellulare Nemaspermica </li></ul><ul><li>Concentrazione </li></ul><ul><li>Motilità </li></ul><ul><li>Morfologia </li></ul>VALUTAZIONE MICROSCOPICA
  18. 18. <ul><li>Concentrazione/ml </li></ul><ul><li>Concentrazione/eiaculato </li></ul><ul><li>v.r. ≥ 20 x 10 6 /ml </li></ul><ul><li>v.r. ≥ 40 x 10 6 /eiac. </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA (WHO, 1999) VALUTAZIONE MICROSCOPICA NUMERO SPERMATOZOI /
  19. 19. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>CONCENTRAZIONE NEMASPERMICA </li></ul><ul><li> </li></ul>Camere di conta Makler Thoma Burker Neubauer WHO 2009 Neubauer <ul><li>Fare 2 diluizioni </li></ul><ul><li>Non riempire le 2 camere con la stessa diluizione </li></ul><ul><li>Non contare la stessa camera 2 volte </li></ul><ul><ul><li>Errore di campionamento </li></ul></ul><ul><ul><li>Errore di pipettamento </li></ul></ul><ul><ul><li>Errore di diluizione </li></ul></ul>Diluizione # 2 Diluizione # 1
  20. 20. Quante cellule contare : intervallo di confidenza N spermatozoi contati 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Percentage 0 25 50 75 100 125 150 intervallo di confidenza al 95% 1.96 x %SE % Errore Standard (%SE) 10 CR 120%  0.4 – 1.6  20 - 80 CR 20% CR 28% CR 40% in 50 µl (50x10 3 ) 45 - 55  43 - 57  40 - 60  per 1x10 6 /ml 0.9 - 1.1  0.86 - 1.14  0.8 - 1.2 
  21. 21. <ul><li>In caso di assenza di spermatozoi in </li></ul><ul><li>sospensione è necessario centrifugare </li></ul><ul><li>l’eiaculato </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA VALUTAZIONE MICROSCOPICA AZOOSPERMIA FORZA CENTRIFUGA ? TEMPO ?
  22. 22. <ul><li>Sperm in the pellet of 14 “azoospermic” samples increases with </li></ul><ul><li>Centrifugation time (10 - 15 min) </li></ul><ul><li>Centrifugation force (600 – 3600 g ) </li></ul><ul><li>Lindsay et al., 1995 Lancet 345: 1642 </li></ul>Not all sperm brought down: at 3000 g for 15 min 23/25 non-azoospermic samples have sperm in supernatant
  23. 23. Dilute semen 1+1 mit Formalin + Hoechst 33342 dye Fluorescence microscopy Leja 100 µm deep disposable chamber
  24. 24. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>Lineare veloce </li></ul><ul><li>Lineare lenta </li></ul><ul><li>Discinetica o Non Lineare </li></ul><ul><li>Agitatoria in loco o In Situ </li></ul><ul><li>Immobili </li></ul><ul><li>v.r. ≥ 50% (1+2+3 = a+b secondo WHO 1999) </li></ul><ul><li>≥ 25% ( 1+2 = a secondo WHO 1999 ) </li></ul>MOTILITA’
  25. 25. WHO 1999 WHO 2009 Immotile Grade d IM Non-progressive Grade c NP Progressive PR -slow Grade b optional -fast (> 25 µm/s at 37°C) Grade a optional STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA MOTILITA’ Valutare solo : spermatozoi immobili, non-progressivi e progressivi LA VALUTAZIONE DELLA VELOCITÀ PUÒ ESSERE INACCURATA
  26. 26. <ul><ul><li>TEST DI VITALITA’ </li></ul></ul><ul><ul><li>È consigliabile inserirlo nella valutazione seminale in caso di motilità ≤ 30% </li></ul></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA
  27. 27. TEST DI VITALITA’
  28. 28. WHO 1999: old method % stained + % motile > 100% WHO 2009: one step method % stained + % motile < 100% <ul><li>Valutare la vitalità solo quando la motilità è <40% </li></ul><ul><li>Utilizzare metodo eosina-nigrosina ( one-step) </li></ul><ul><li>No falsi positivi </li></ul>TEST DI VITALITA’
  29. 29. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>La morfologia nemaspermica può essere valutata su un preparato a fresco utilizzando un obiettivo 40x. E’ necessario a questo scopo avere a disposizione un microscopio con un sistema ottico di alta qualità che consenta una precisa rilevazione delle alterazioni morfologiche delle cellule vitali. </li></ul>MORFOLOGIA
  30. 30. <ul><li>Per eseguire uno “spermiocitogramma“ è necessario allestire per ogni campione più vetrini che verranno poi processati secondo la tecnica di preparazione più appropriata e valutati al microscopio ottico con l’obiettivo 100X. </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA MORFOLOGIA
  31. 31. <ul><li>Shorr </li></ul><ul><li>Colorazione di Papanicolau </li></ul><ul><li>Colorazione Diff Quik </li></ul><ul><li>Colorazione di May-Grünwald-Giemsa </li></ul>STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA Tecniche di colorazione MORFOLOGIA
  32. 32. STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA <ul><li>MORFOLOGIA </li></ul><ul><li>Forme tipiche </li></ul><ul><li>Forme atipiche </li></ul>Testa Collo Coda v.r. ≤ 70% forme atipiche (WHO 1992)
  33. 33. WHO 2009 cosa viene raccomandato ??? Riportare solo le forme morfologiche normali Valutare il preparato 2 volte Cambiamenti nella dimensione a fresco più piccoli Forza di distorsione espansione delle teste immature Insulto osmotico perdita di residui citoplasmatici ATTENZIONE AGLI ARTEFATTI !!!
  34. 34. WHO 2009 Valori di norma Valori di Riferimento
  35. 35. Distribuzione normale: Media e DS Distribuzione asimmetrica: Mediana e Percentili La distribuzione dei parametri seminali non è simmetrica ma asimmetrica
  36. 36. Un approccio alternativo per descrivere dati come questi è l’uso della MEDIANA. La MEDIANA è quel valore rispetto al quale, metà dei valori della popolazione risultano superiori e l’altra metà inferiori Dal momento che il 50% della popolazione cade al di sotto della mediana , questa è anche chiamata 50° percentile Si possono utilizzare il 5° e il 95° o indifferentemente il 5°, 25°, 50° e il 95° percentile
  37. 37. WHO year 1987 1992 1999 2009 designation normal normal reference Percentiles (non-parametric methods) 2.5 5 50 95 97.5 Semen vol. (ml) 2.0 2.0 2.0 1.2 1.5 3.7 6.8 7.6 Total numbers (M) 40 40 40 23 39 255 802 928 Sperm conc. (M/ml) 20 20 20 9 15 73 213 259 Progr. motility (%) 50 50 50 28 32 55 72 75 Vitality (%) 50 75 75 53 58 79 91 92 Normal forms (%) 50 30 (15) 2 3 11 21 24 WHO 2009 Valori di Norma , valori di Riferimento Valori di Riferimento : 8 Paesi, 3 Continenti IN FUTURO : studiare varianti geniche Uomini giovani fertili – meno di 12 mesi dalla gravidanza
  38. 38. Valori di Riferimento del Vol misurato in ml: descritti da mediana e percentili (metodi non-parametrici) Curva asimmetrica a destra VOLUME
  39. 39. Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / ml Concentrazione/ml
  40. 40. Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / eiaculato Concentrazione/Eiac.
  41. 41. Valori di Riferimento della Motilità misurata in % di motilità progressiva Motilità Progressiva
  42. 42. Valori di Riferimento della Morfologia misurata in % di forme normali Forme normali
  43. 43. WHO year 1987 1992 1999 2009 designation normal normal reference Percentiles (non-parametric methods) 2.5 5 50 95 97.5 Semen vol. (ml) 2.0 2.0 2.0 1.2 1.5 3.7 6.8 7.6 Total numbers (M) 40 40 40 23 39 255 802 928 Sperm conc. (M/ml) 20 20 20 9 15 73 213 259 Progr. motility (%) 50 50 50 28 32 55 72 75 Vitality (%) 50 75 75 53 58 79 91 92 Normal forms (%) 50 30 (15) 2 3 11 21 24 WHO 2009 Valori di Norma , valori di Riferimento Valori di Riferimento : 8 Paesi, 3 Continenti IN FUTURO : studiare varianti geniche Uomini giovani fertili – meno di 12 mesi dalla gravidanza
  44. 44. Normozoospermia Numero totale di spermatozoi, percentuale di motilità progressiva (PR) e morfologia nella norma, al di sopra del limite di riferimento più basso Oligozoospermia Numero totale di spermatozoi al di sotto del limite di riferimento più basso Astenozoospermia Percentuale di motilità progressiva (PR) al di sotto del limite di riferimento inferiore Teratozoospermia Percentuale di spermatozoi con forme normali al di sotto del limite inferiore di riferimento WHO 2009 Nomenclatura seminale
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