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Ras mutations in cutaneous squamous cell carcinomas 2
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  • 1. RAS Mutations in Cutaneous Squamous- Cell Carcinomas in Patients Treated with BRAF InhibitorsFei Su, Ph.D., Amaya Viros, M.D., Carla Milagre, Ph.D., Kerstin Trunzer, Ph.D., Gideon Bollag, Ph.D., Olivia Spleiss, Ph.D., Jorge S. Reis-Filho,M.D., Ph.D., Kong, M.S., Richard C. Koya, M.D., Ph.D., Keith T. Flaherty, M.D., Paul B. Chapman, M.D., Min Jung Kim, Ph.D., Robert Hayward,B.S., Matthew Martin, Ph.D., Hong Yang, M.S., Qiongqing Wang, Ph.D., Holly Hilton, Ph.D., Julie S. Hang, M.S., Johannes Noe, Ph.D., MaryouLambros, Ph.D., Felipe Geyer, M.D., Nathalie Dhomen, Ph.D., Ion Niculescu-Duvaz, Ph.D., Alfonso Zambon, Ph.D., Dan Niculescu-Duvaz,Ph.D., Natasha Preece, B.A., Lídia Robert, M.D., Nicholas J. Otte, B.A., Stephen Mok, B.A., Damien Kee, M.B., B.S., Yan Ma, Ph.D., ChaoZhang, Ph.D., Gaston Habets, Ph.D., Elizabeth A. Burton, Ph.D., Bernice Wong, B.S., Hoa Nguyen, B.A., Mark Kockx, M.D., Ph.D., Luc Andries,Ph.D., Brian Lestini, M.D., Keith B. Nolop, M.D., Richard J. Lee, M.D., Andrew K. Joe, M.D., James L. Troy, M.D., Rene Gonzalez, M.D.,Thomas E. Hutson, M.D., Igor Puzanov, M.D., Bartosz Chmielowski, M.D., Ph.D., Caroline J. Springer, Ph.D., Grant A. McArthur, M.B., B.S.,Ph.D., Jeffrey A. Sosman, M.D., Roger S. Lo, M.D., Ph.D., Antoni Ribas, M.D., Ph.D., and Richard Marais, Ph.D. Catalina Bermúdez González Camila Cruz Cano Third semester Molecular biology Universidad Pontificia Bolivariana Medellín, 2012
  • 2. IntroductionCancer• It begins when cells in a part of the body begin to grow uncontrollably and become cancerous due to an alteration in the DNA of type:TranslocationLocatedAmplificationDeletionGain or loss of a chromosome
  • 3. • In cancer cells disobey all repair mechanisms and control, so the cell continues to grow and form new abnormal cells• These mechanisms include:The regulation of signal transductionCell differentiationApoptosisThe repair of DNAThe cell cycle progressionAngiogenesisThe cell adhesion
  • 4. • There are three types of mutant genes Tumor suppressor DNA replicati Oncogenes genes on Genes • Genes are mutated that • They are responsible • When the repair promote cell division for stopping cell division system is defective as • Involved in cell growth and induce apoptosis a result of acquired or regulation • When these genes are inherited mutation mutated cells divide uncontrollably.
  • 5. • Causes:Result of the interaction of genetic factors with: Physical Carcinogens • Ultraviolet radiation • Ionizing radiation Chemical Carcinogens • Snuff • Aflatoxins • Arsenic Biological Carcinogens • Infections caused by bacteria • Infections caused by viruses • Infections caused by parasites
  • 6. • Risk factorsConsumption of snuffOverweight or obesePhysical inactivityConsumption of alcoholic beveragesHPV infections and HBVAir pollution in citiesThe smoke generated by burning solid fuels.
  • 7. • Treatment Chemotherapy Radiation therapy Biological therapy • With an antineoplast • Use of ionizing • Immunotherapy ic drug whose radiation on the function is to tumor, • Hormone therapy prevent the destroying the reproduction of malignant cells and cancer preventing their Surgery cells causing an alter growth and ation in reproduction becaus the nucleic acid e they synthesis, cell can damage repair division or protein in an efficient synthesis manner • Cytostatic or • Also acts on normal cytotoxic drugs tissue • Low specificity
  • 8. Cutaneous Squamous-Cell Carcinomas
  • 9. • Skin cancer is the most common, are diagnosed each year about 3.5million cases Cancer No melanoma (Keratinocytes Melanoma carcinoma) Squamous Basal cells cells
  • 10. • Melanoma: They originate from melanocytes (pigment-producing cells)• Keratinocytes carcinoma:Basal cell carcinoma:Arise in sun-exposed areas, especially the head and neckIt tends to be slow growing.After treatment, basal cell carcinoma can recur in the same area of ​skin.
  • 11. Squamous cell carcinoma:Appears in body areas exposed to sunlight, such as the face, ears, lips and backs of handsIt is often more aggressive than basal cell cancerIt can spread to the fatty tissues under the skin and lymph nodes basalIt starts as a red area with surface crusting, scaling, not cure.May become nodular, hard and sometimes present a warty surface.
  • 12. • Risk factorsExposure to UV lightWhite skinAge greaterMale sexExposure to chemicalsExposure to radiationReduced immunity
  • 13. RAS• Monomeric G protein coupled to the cell membrane by prenylation and has a regulating activity GTP- hydrolase, which alternates between two structural conformations:Activated form: Ras protein is attached to GTP, called RAS- GTPInactivated form: RAS protein is attached to GDP, called RAS- GDP.• Ras protein is activated by different factors guanine nucleotide exchange, which are also activated by mitogenic signals• The RAS protein is inactivated by GTPase- activating proteins that increase the ability to hydrolyze GTP
  • 14. • Activates numerous signal transduction pathways, but is especially important for mitogen- activated protein kinase (MAPK), which also through signal transduction protein kinases activate other genes and regulatory proteins.• When the gene is mutated acts constitutively, binding GTP and giving continuous signal for cell growth.
  • 15. BRAF• Protein family of the RAF protein• Has an activity of kinase serine-threonine• Involved in the MAPK pathway (primary route of cell proliferation) and active in the beginning of the cAMP cascade to phosphorylate MEK protein and send the signs of growth.• The oncogenic form lose regulatory sequences of the amino terminus and isconstitutively active, preventing proliferation is turned off
  • 16. The mutation of genes encoding these regulatoryproteins of the division, growth and apoptosis willgenerate a hyperactivation of these,generating permanent stimuli and give riseto abnormal growth of cells that will form a tumor
  • 17. General objective• Identify which is the incidence of use of BRAF inhibitors as anticancer in the development of cutaneous squamous cell carcinomas by- RAS Mutations
  • 18. Materiales y métodos• PacientesParticipantes de un estudio de dosisen escala con Vemurafenib en fase Se quiere1, 2 y 3 (según ) determinar aque reciben dosis de 720 a 960 mg que dosis sedos veces al día de forma oral. dan los efectos. Porque es laCon melanoma metastásico con una mutación quemutación en BRAF V600 se quiere inhibir
  • 19. • PCRSe extrajo ADN de muestras de tumor y se amplificó con PCR para secuenciarlo para: HRAS Exones 1 y 2 NRAS Exones 1 y 2 KRAS Exones 1 y 2 CDKN2A Exone 2Esto fue seguido por Sequencing SangerCon el uso de un examen investigacional AmpliChip p53 se analizaron sustituciones o delecciones de una sola base en 2 exones de TP53.Se evaluó la fosforilación de ERK mediante un análisis inmunohistoquímico
  • 20. El objetivo del PCR es obtener varias copias de un fragmento de DNA específico.Se fundamenta en la propiedad de las DNA polimerasasSe alteran ciclos de temperaturas altas y bajas para separar las hebras recién formadas de DNA entre cada replicación y se deja que se vuelvan a unir las polimerasas para una nueva replicación
  • 21. • Análisis celulares entre mutantes HRAS e inhibidores BRAFCélulas delcarcinoma conB9 de HRASmutanteCélulas A431 T Vector vacío(ATCC) r Vemurafenib a Sembradas en agar PLX4720 (análogo) n Plásmido con s con: HRAS Q61L Dimetilsulfóxido fCélulas NH13T3 e Vector vacío(ATCC) r i Después de la exposición fue d analizada la proliferación celular Plásmido con mediante ensayos MTT o MTS a HRAS Q61L s
  • 22. • Análisis de expresión del gen VemurafenibCélulas B9 después de sembradas en PLX4720 (análogo)Fueron incubadas 16 horas DimetilsulfóxidoSe cosecharon y se aisló el RNA y se midió la expresión génica usando Affymetrix Mouse 420 2.0Los genes que respondieron al Vemurafenib y al PLX4720 se identificaron por que cambiaron factores con relación a los que fueron sembrados con Dimetilsulfóxido (control)Los patrones de genes de las células B9 se compararon con los genes de vía MAPK de 5 líneas celulares de personas con melanoma y se confirmaron con PCR
  • 23. • RatonesDos estados del carcinoma6 ratones por grupoSe usaron Inhibidor BRAF: PLX4720Inhibidos MEK: PD184352Por sonda oral 25 mg/Kg/ día en 200 ul deDimetilsulfóxido
  • 24. RESULTADOS• Como parte del análisis dermatopatológico de pacientes tratados con vemurafenib: 21 confirmaron muestras de carcinoma escamocelular o keratoacantoma.
  • 25. FIGURA 1• A continuación se presenta fotografías y fotomicrografías de lesiones de piel sin melanoma en pacientes tratados con vemurafenib.
  • 26. EXPLICACIÓN FIGURA 1• 22 lesiones (63%) fueron caracterizadas como keratoacantomas y 13 (37%) fueron confirmados como carcinoma escamocelular.
  • 27. • Esta imagen muestra una lesión con las características clínicas de keratoacantoma observada el día 98 después de que el paciente comenzara a consumir vemurafenib en una dosis de 960mg dos veces al día.• La imagen inferior es una sección de la lesión obtenida de la piel del torso del mismo paciente sin mutación RAS reportado como carcinoma escamocelular del subtipo keratocantoma.
  • 28. • Esta imagen muestra la apariencia clínica e histopatología de un keratoacantoma de el menton de un paciente con HRAS Q61R .
  • 29. FIGURA 2• Muestras de la mutación y del análisis de señalización de la MAPK en carcinoma cutaneo escamocelular o keratoacantomas.
  • 30. EXPLICACIÓN FIGURA 2• La fosforilacion del ERK fue evaluada en 10 muestras con carcinoma escamocalular cutáneo o keratoacantomas y se encontró que el epitelio circundante fue normal.• En 4 muestras con suficiente epitelio circundante normal se realizo análisis de mutación de RAS y ninguna mutación fue detectada.
  • 31. EXPLICACIÓN FIGURA 2• La tinción para pERK la cual fue realizada en 3 de las 4 muestras fue mas común en las células con lesiones que en aquellas de contorneado epitelial normal.
  • 32. FIGURA 2 A• Tinción inmunohistoquimica para pERK (café) de muestras de piel adyacente normal (izquierda) y de células de carcinoma escamocelular (derecha).Este paciente (al igual que el siguiente) fue tratado con vemurafenib. Este paciente tiene la mutación KRAS G12.• Este tipo de lesiones aparecieron 87 días después de que la terapia con vemurafenib había comenzado
  • 33. FIGURA 2 B• Este paciente también tiene la mutación KRAS G12.• Las lesiones del carcinoma escamo-celular aparecieron 51 días después de que hubiese empezado la terapia con vemurafenib.
  • 34. FIGURA 3•
  • 35. Muestra la estimulación de el crecimiento delas células B9 en el agar después de laexposición a vemurafenib o PLX4720Muestra la expresión diferencial de la regulación de MAPK y el rendimiento delos genes después de la exposición a vemurafenib o PLX4720 durante toda lanoche en comparación con la expresión génica de 5 líneas celulares demelanoma usadas como referencia.Lo rojo indica la alta expresión y lo verde indica la baja expresión en las célulasno tratadas.Muestra el resultado del análisis de westernblot de las células NIH3T3 transfectadas conun control vector o con un HRASQ61 mutadoy tratada con diferentes concentraciones devemurafenib.
  • 36. FIGURA 3 A
  • 37. • La investigación sobre los efectos de los inhibidores del BRAF en las mutaciones de HRAS en carcinomas escamo celulares fueron usados en la línea celular B9 las cuales albergaban la mutación HRASQ61L.• Al exponerse las células a vemurafenib y a su análogo PLX4720 se estimulo su proliferación en el agar. Para analizar el mecanismo subyacente se comparó la expresión génica de las células B9 antes y después de que fueran expuestas a vemurafenib o PLX4720.
  • 38. • Para estos 9 genes el cambioFIGURA 3B en las células B9 fue opuesto a el cambio en la parte del gen observada en las células humanas con melanoma BRAFV600E. • Esto sugiere que la proliferación estimulada por los resultados de los inhibidores del BRAF paradójicamente aumentan el efecto transcripcional de la vía MAPK en células con HRAS mutante.
  • 39. FIGURA 3C• Muestra el resultado del análisis de western blot de las células NIH3T3 transfectadas con un control vector o con un HRASQ61 mutado y tratada con diferentes concentraciones de vemurafenib.
  • 40. FIGURA 4
  • 41. FIGURA 4 A• La figura A muestra el numero de tumores palpables que surgieron en ratones tratados con el carcinógeno 7,12 dimethyl benz anthrace (DMBA), el promotor de tumores 12º- tetradecanoylphorbol 13-acetato (TPA), el inhibidor del BRAF PLX4720 (25 mg por kg por día). Cada cohorte consistió en 6 ratones y la respuesta en la formación de tumores en cada uno
  • 42. FIGURA 4 B• Esta imagen muestra los resultados de 90 días después que fueran tratados con 4 diferentes régimenes.
  • 43. Aceleración del crecimiento de los tumores de piel no-melanomas en ratones con inhibición del BRAF• Con un modelo invivo los efectos de la inhibición del BRAF en carcinoma de células escamosas y keratoacantomas, se usaron las dos capas de piel del modelo de ratón de carcinogénesis en los cuales la aplicación tópica de del carcinógeno 7,12 dimethylbenz- anthracene (DMBA) induce la mutación de la HRAS Q61L en ratones con keratinocitos. Subsecuentemente la aplicación de un promotor de tumores 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13- acetate (TPA) induce luego las lesiones.
  • 44. • En ratones que recibieron DMBA y TPA con PLX4720, la apariencia de esas lesiones fue marcadamente acelerada, como se comparo con lso ratones que se les dio DMBA y TPA solo
  • 45. DISCUSSIONRESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT SAYSDavies H Bignell GR RAS was the first oncogene discovered in which point mutations led to cellular transformation.Malumbres M. Barbacid RAS mutations aloneM. typically result in cellular senescence in conjuntion with other events that alter control of the cell cycle and apoptosis, they induce celular transformation
  • 46. RESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT SAYSPoulikakos PI, Zhang C, “Our data indicates thatBollag G, Shokat KM, RAS mutations areRosen N. present in approximately 60% of cases in patients treated with vemurafenib, suggesting that preexisting mutations may confer a predisposition to the development of squamus-cell carcinomas or keratoacanthomas…”
  • 47. RESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT SAYSNazarian R, Shi H, Recent study haveWang Q et al. shown that vemurafenib resistance can be mediated by receptor tirosine kinases such as the platelet-derived growth factor an insuline growth factor 1 receptors. Mutation o r amplification of receptor tyrosine kinases may account for the development of cutaneous squamus-cell carcinomas and keratoacanthomas.
  • 48. CONCLUSIONS• This study can show us that vemurafenib stimulates proliferation in cells with mutated HRASQ61L through paradoxical activation of the MAPK pathway.• This kind of drug development a clinical toxicity that is the opposite of what would be expected from a targeted oncogen inhibitor.
  • 49. • Is important to the advanced study of the possible side effects of anticancer drugs and when dealing with genetic modifications that alter the dynamics of cellular regulation because they can affect other tissues.• The PCR is a technique widely used in the area of science that should be exploited as it compromises reliable results at the genetic level that can be used for high incidence diseasessuch as cancer
  • 50. Catalina Bermúdez González