Bases moleculares de la Insulina

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA INSTITUTO DE MEDICINA EXPERIMENTAL POSTGRADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS BASES MOLECULARES DE LA ACCIÓN DE LA INSULINA Por: Rubén Carvajal Caracas, 8 de junio de 2009

El papel de la Fosfatidil-Inositol-3-Quinasa (PI-3K) en el mecanismo de acción de la insulina. (Asano, T. y col. 2007. Biol. Pharm. Bull . 30(9) 1610-1616)

PI fosforilados por PI 3quinasa PI PI4P PI4,5P 2 PI3P PI3,4P 2 PI3,4,5P 3 PI3K PI3K PI3K

Insulina IR (a) IRS(p) en Ser y Tir Cuando dom SH2 de PI 3K reconoce Tir-P de IRS-Tir-P, se activa. 14-3-3 se une a Ser(p) e inhibe IRS-IR PI 3K (a) se transloca y cataliza PIP3 PIP3 se une y activa la enzima PDK PDK fosforila la Akt Akt (p) (a) GLUT4

Dominios proteicos de sustratos del RI

PH (Pleckstrin Homology) presente en proteínas IRS

Específico para PIP 3 (3,4,5) y PIP 2 (4,5)

PTB (Phosphotyrosine-binding domain) de proteínas IRS

Se une a tirosina fosforilada (p-Tyr)

SH2 (Src Homology) de proteínas IRS

El dominio más abundante que reconoce p-Tyr

YXXM de proteínas IRS (son fosforilables)

Son otro sitio de unión con la PI-3K

http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2001/gm012f.pdf Estructura de subunidades catalítica y reguladora de PI-3K Ambos SH2 deben estar activados Sitio de unión a la PI-3K Isoformas

Sitios de unión de IRS con la subunidad p85 de PI3K http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2001/gm012f.pdf 13 sitios de fosforilación de Tyr 4 en YXXM 12 sitios de fosforilación de Tyr 7 en YXXM 20 sitios de fosforilación de Tyr 8 en YXXM 4 Tyr fosforilables en YXXM

http://www.nature.com/nm/journal/v11/n2/fig_tab/nm0205-123_F1.html Se une a Ser-P de IRS impide interacción con IR Proteína 14-3-3 (tirosinquinasa) Fosforila los IRS unión Generan PIP3 Unión y activación Cascada de fosforilación Fosfatasa 3’ Fosfatasa 5’ 1 Músculo y T. adiposo 2 Cél. β pancreáticas PKC ⁭ AG (Translocación GLUT4) STZ FASE I FASE II PDK=piruvato dehidrogenasa AKT=serina treonina proteinquinasa (PKB) PTEN=fisfatasa and tensin homolog SHIP2=SH Inositol fosfatasa

http:// www.abcam.co.jp/index.html?pageconfig = resource&rid =10602&pid=7

Mutación receptor Leptina Resistencia a la insulina Bajan IRS-1 e IRS-2 Afectado el receptor de insulina Se afecta la activación de la PI-3K Afecta captación y transporte de glucosa Hiperinsulinemia Obesidad Señalización defectuosa de insulina Rata Zucker Diabetes tipo II

Comparación de la respuesta de la PI-3K a la acción de la insulina en ratas delgadas y obesas Músculo y T. adiposo Cél. β pancreáticas

Sin Insulina

+Con Insulina

↓ actividad IRS-p85 inducida por insulina ↓ actividad IRS-p85 inducida por insulina ↓ actividad IRS-p85 inducida por insulina, en menor proporción que en el hígado

Baja la síntesis de glucógeno Rata SD con dieta alta en grasas Reducida actividad de insulina en hígado, músculo y tej. adiposo Aumenta producción basal de glucosa Se reduce captación de glucosa Disminuye translocación de GLUT4 a la membrana

Actividad de la PI3K en hígado y músculo de ratas Sprague Dawley sometidas a dieta alta en grasas ↓ actividad IRS-p85 ↓ PI3K inducida por insulina

Sin Insulina

+Con Insulina

⁭⁭⁭ ⁭ unión IRS-p85 ⁭⁭⁭ ⁭ PI3K inducida por insulina (??)

Estreptozotocina (STZ) T-1095 inhibidor de los cotransportadores renales SGLT1/2 de Na+-glucosa nueva droga contra la diabetes tipo I PRODUCE MEJORÍA EN HIPERGLICEMIA Diabetes Tipo I inducida por Estreptozotocina (STZ) DIABETES TIPO I

Efecto del T-1095 sobre IRS y PI3K en Diabetes Tipo I inducida por STZ No produce efectos en la fase I

Efecto del T-1095 sobre la Akt (PKB) en Diabetes Tipo I inducida por STZ

http://www.nature.com/nm/journal/v11/n2/fig_tab/nm0205-123_F1.html Se une a Ser-P de IRS impide interacción con IR Proteína 14-3-3 (tirosinquinasa) Fosforila los IRS unión Generan PIP3 Unión y activación Cascada de fosforilación Fosfatasa 3’ Fosfatasa 5’ 1 Músculo y T. adiposo 2 Cél. β pancreáticas PKC ⁭ AG (Translocación GLUT4) STZ FASE I FASE II T-1095 T-1095

Modelos de regulación molecular del transporte de glucosa por la insulina durante el tráfico vesicular del GLUT4 (Larance, M. y col. 2008. Mol. Endocrinol. 22, 226-233)

12 TIPOS DE TRANSPORTADORES DE GLUCOSA (DIFERENTES TEJIDOS) GLUT4, músculo esquelético, músculo cardíaco y adipocitos. En ausencia de insulina, ~ 90% del GLUT4 se encuentra secuestrado intracelularmente en vesículas que lo almacenan (GSV). Las GSV contienen: V-SNARE Sinaptobrevina, T-SNARE Sintaxina 4 y SNAP23 Otras proteínas accesorias son: Munc18c, Synip y NSF Para el anclaje y fusión de la membrana con las GSV

GLUT

Pasos del tráfico vesicular del GLUT4 Células musculares y adipocitos

Ruta de señalización controladora del GLUT4 VAMP2 (Sinaptobrevina) Fosforilada por la Akt

Alteración en la ruta para la incorporación de glucosa

¿Se sintetizan GLUT4 nuevos en las GSV o entran a las GSV proviniendo de la superficie? ¿Cuándo adquiere el GLUT4 su capacidad de respuesta frente a la insulina? ¿Cuál es el papel de las adaptinas (GGA) provenientes del Golgi en la formación de los GLUT4? ¿Cuál es el papel del sortillin (una proteína parecida al receptor de manosa 6-fosfato) en el tráfico vesicular del GLUT4? ¿Son ubiquinados el GLUT4 y el IRAP (insuline-responsive aminopeptidasa de similar respuesta al GLUT4) durante el tráfico vesicular? ¿El GLUT4 es retenido por TUG ( Tether containing UBX domain for GLUT4) ? Interrogantes acerca de la formación de las GSV ¿Modelo estático o dinámico?

Ablación química del endosoma con HRP (Transferrin –horse-radish peroxidase) [produce derivados fluorescentes]

2) Microscopía electrónica de las estructuras túbulo-vesiculares en adipocitos

3) Estudios de proteínas insulinomiméticas, ubicadas en las vesículas de GLUT4 (por ej: aminopeptidasa IRAP)

4) Fraccionamiento bioquímico de las vesículas endosomales y las provenientes del TGN

5) Tripsinización de adipocitos maduros seguida de electroporación [electropermeabilización ]

Métodos utilizados para evidenciar las GSVs

Microscopía de reflexión de fluorescencia interna http://www.med.cornell.edu/biochem/mcgraw/insulin-regulated.html

Modelo dinámico del Recycling Pool de GLUT4

Modelo dinámico de McGraw para el tráfico vesicular de GLUT4 GLUT4 se reciclaría entre endosomas y vesículas en el estado basal y se liberarían al incrementarse el nivel de insulina

El modelo de T.E. McGraw y colaboradores http://www.med.cornell.edu/biochem/mcgraw/insulin-regulated.html

El modelo de T.E. McGraw y colaboradores http://www.med.cornell.edu/biochem/mcgraw/insulin-regulated.html La clave: pool de GLUT4 en estado basal 50% del GLUT4 se almacena en endosomas

Modelo dinámico intermediario para la translocación de GLUT4 GLUT4 se reciclaría entre endosomas y el Golgi vía vesículas y se liberarían a la MP al incrementarse el nivel de insulina

Modelo estático de translocación de GLUT4 El GLUT4 estaría acumulado en vesículas del citosol a la espera de un estímulo de ⁭ insulina para translocarse a la membrana plasmática