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  • Prolonged morphine administration alters proteinexpression in the rat myocardium Juliana Molina Carolina Madrid Tercer semestre
  • INTRODUCTION Morphine: is a potent opiate analgesic medication. agonist at μ opioid receptors coupled to G protein Acts opening voltage-dependent potassium channel and closing calcium- dependent causing hyperpolarization and reduced excitability of the neuron. Analgesia is due to changes in the perception of pain at the spinal level Miocardyum: involuntary striated muscle• Protein expression: DNA RNA ProteinMorphine can induce changes in cell metabolism that coudl eventualy modify theexpression of certain proteins, in this particular case, myocardium.
  • GENERAL OBJETIVEThe main aim of the studywas to asses thepresumed effect ofprolonged treatment withhigh dosis of morphine inmale rast on myocardialprotein expression
  • METODOLIGÍAMATERIALES• acrilamida y bis-acrilamida• SYPRO: ruby stain from molecular probes• Membrana de nitrocelulosa• Inmobilune DryStrips• Buffer de pharmalyte• Anticuerpos secundarios anti-rabbit marcados con peroxidasa de rabano• Anticuerpos primarios rabbit
  • METODOLIGÍAANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA Cámaras de Inyección intramuscular plexiglas •Grupo CON: solución salina Ratas •Grupo MOR: morfina- 3a4 Ciclo de 12 10mg/Kg por 10 dias por albinas horascamara luz/oscuridad •Naloxona: 10mg/Kg por adultas 10 dias •Naxolona + morfina: 10mg/Kg por 10 dias Agua y comida
  • METODOLIGÍAANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINASacrificio de animales Dislocación cervical- 24 horas después ultima dosis Extirpación- disección corazón Congelamiento en nitrógeno liquido y almacenado a -80°CExperimento con retiro de la dosis Animales sacrificados 3 días después de ultima dosis
  • METODOLIGÍA FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACOMuestras congeladasde ventrículo izquierdo 10 volúmenes de TMES buffer+ coctel inhibidor de proteasaCorte en pedazos y homogenización Suspensión homogenización Centrifugación Para remover tejidos y fragmentos nucleares Supernadante postnuclear (PNS)
  • METODOLIGÍA FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO PNS Aplicado a solución percoll 18% en buffer TMESCentrifugación Parte opaca parte translucida centrifugación mitocondria Membrana del plasma Fracción citosolica Dilución en buffer TME Centrifugación Resuspensión Congelado Almacén alícuotas
  • METODOLIGÍA ELECTROFORESIS E INMUNOBLOTMuestras de proteína Solubilizadas en laemmli bufferGel de poliacrilamida 10%Transferencia a membranas de nitrocelulosaBloqueo de membranas con leche descremada seca al 3%Sonda con anticuerpos Inmunoblot- análisis y cuantificación
  • METODOLIGÍAELECTROFORESIS E INMUNOBLOT inmunoblot: las proteínas de extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según tamaño por medio de SDS- PAGE poliacrilamida gel electroforesis cargado negativamente. Después las proteínas van a un filtro incubado con anticuerpos que reaccionan con la proteína especifica. El anticuerpo unido al filtro se detecta.
  • METODOLIGÍAANALISIS PROTEOMICO Precipitación de la fracción citosolica, mitocondrial, membrana Proteínas se pusieorn en gradientes lineares de pH 4-7 Se separaron con multiphor apparatus 2 equilibrios con buffer EQSeparación 2D en gel poliacrilamida 10% teñidos con SYPRO rubycuantificación de la densidad de los puntos con software PDQuestProteínas alteradas se identificaron con 4800 plus MALDI TOF/TOF análisis
  • METODOLIGÍA MISCELANEALa concentración de proteínas fue determinada por método BCALos geles proteomicos de referencia 2D se establecieron haciendo un por medio de 12replicas de cada grupo
  • RESULTADOS
  • RESULTADOS
  • RESULTADOS
  • RESULTADOS
  • RESULTADOS
  • RESULTADOS
  • DISCUSSION AUTHOR YES NO G. Ferns X J. Ikeda XGS. Murphy X JN. Peart x
  • CONCLUSIONS• Prolonged Morphine administration can caused oxidative stress and cardioprotective effect by binding with opioid receptor. The mechanism of action would be important at the time to seek for drug interactions that may increase or reduce the benefit.• the myocardium responds to oxidative stress by increasing the synthesis of several proteins with a protective role.• Morphine is used for treatment in many diseases, molecular studies provide insights into the behavior and cellular response of different tissues of the body in a prolonged administration, this knowledge allows a better approach in the treatment of patients.• Molecular studies should be made in order to find a way to induce the same protective response in the cell without the need of the constant stim from the drug. this would be really important in the treatment of some patients beacuse dosis decreases or may even disappear