1. Sara Zapata García
Manuela Zapata López
Carolina Cartagena Durango
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
PALABRAS CLAVES
Bacterias aerobias, microorganismos, medios de cultivo, métodos de inoculación.
RESUMEN
Las bacterias están presentes en los diferentes ecosistemas, pero para su
crecimiento requieren de condiciones óptimas las cuales les permitan vivir. En esta
práctica se llevó a cabo el cultivo y el aislamiento de diferentes bacterias, para
ello se empleó distintos medios de cultivo cada uno de ellos con propiedades
desiguales, por otra parte para llevar a fin dicha siembra se realizaron diferentes
métodos de cultivo.
Todo esto se realizó con la finalidad de identificar las particularidades de
crecimiento de algunos microorganismos dependiendo del medio de cultivo, los
medios de cultivo se dividen dependiendo del propósito, en este caso era para
observar que bacterias pueden crecer en los diferentes agares.
Se contempló el desarrollo de E. Coli el agar nutritivo sembrado con el método
francés. En el agar eosina azul de metileno el cual es un agar selectivo crecieron
S. Aureus y E. Coli pero no germinó la bacteria B. Cereus. Por otra parte en el
agar manitol sal solo se observó la proliferación de S. Cilius pero no se
desarrollaron B. Cereus ni E. Coli. En comparación con los otros medios de

2. cultivo en el agar sangre crecieron las tres bacterias S. Aureus, B. Cereus y E.
Coli.
MARCO TEORICO
Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que
pueda confundirse morfológicamente es necesario usar medios de cultivos, ya que
nos permiten diferenciar las características del crecimiento de las bacterias y
establecer su identidad según el medio de cultivo que se use.1
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales como el
agua, el suelo, aire, el hombre y otros seres vivos, alimentos, entre otros.
Haciendo parte de los diferentes ecosistemas. Por esto se deben usar los medios
de cultivo adecuados que se asemejen al ambiente si queremos posibilitar el
crecimiento de la bacteria.1
Un medio de cultivo está diseñado para posibilitar el desarrollo y nutrición de las
bacterias por esto cuenta con una cantidad de sustancias como: carbono, agua,
azufre, fosforo, nitrógeno, potasio, sodio, magnesio, entre otros. También su
crecimiento depende de muchos factores entre ellos: un pH preferiblemente
neutro, humedad, oxigeno, temperatura, presión osmótica, todo esto en
condiciones adecuadas.2
Los medios de cultivo se clasifican dependiendo de las características que se
necesiten para su óptimo desarrollo los cuales según su consistencia pueden ser:



Líquidos: no contienen agar y favorecen el crecimiento bacteriano ya que las
bacterias poseen una gran libertad de movimiento y al difundirse por todo el
medio encuentran su componente nutritivo y requerimiento de oxigeno más
óptimo con gran facilidad, por ejemplo: las aerobias estrictas crecen en los
primeros 10-15mm de la superficie del medio, las microaerofilas ligeramente
por la superficie del medio, las anaerobias estrictas en los 10-20mm del fondo
y las facultativas por todo el medio.
Solidos: su concentración de agar es de 1.5% a 2%, en estos las bacterias
crecen con mayor dificultad, ya que los nutrientes pueden agotarse fácilmente,
se utilizan para ver colonias, aislar microorganismos, características de
crecimiento, color, tamaño, taxonomía, entre otros.
semi-solido: su concentración de agar es de 0.5% y se utiliza para estudiar el
movimiento y algunas propiedades bioquímicas.2
También según su aplicación se usa:

3. 




Simples: son apropiados para la mayoría de microorganismos ya que poseen
requisitos nutricionales mínimos para desarrollarse.
Enriquecidos: permiten el crecimiento de bacterias difíciles de cultivar, puesto
que se añade ciertos componentes muy ricos en nutrientes.
Selectivos: estos medios contienen componentes que inhiben el crecimiento
de algunas bacterias cuyo crecimiento no interesa, permitiendo así aislar una
determinada especie.
Diferenciales: en este se les adiciona sustancias para el crecimiento de
determinadas bacterias y al actuar sobre dichas sustancias adquieren un color
que las diferencia de otras colonias.
Enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen la multiplicación de
bacterias cuando la muestra obtenida es pobre.2
De acuerdo con su aplicación los componentes usuales de los medios de cultivo
son:




Extracto de carne: constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales
orgánicas y otros nutrientes.
Peptonas: son proteínas degradadas, ricas en nitrógeno y carbono.
Cloruro de sodio: importante para proporcionar un adecuado equilibrio
osmótico.
Tampones estabilizadores del pH: necesarios para contrarrestar las
variaciones del pH debido a los productos del metabolismo bacteriano.2
Nutrientes para medios de enriquecimiento:



Extracto de levadura: rico en vitaminas del complejo B, proteínas y ácidos
nucleicos.
Extracto de glóbulos rojos: suministra los factores X (hemina) y V (difosfopiridin-adenin-nucleotido o coenzima I) imprescindibles para el crecimiento
bacteriano de algunos microorganismo.
Infusión de hígado o corazón y cerebro: son infusiones ricas en
aminoácidos azufrados que reducen el potencial de óxido reducción.2
Agentes reductores:
Se adicionan tioglicolato sódico, cisteína, ácido ascórbico a los medios de cultivo
para promover la anaerobiosis.2
Agentes selectivos:

4. 




Colorantes: el cristal violeta, azul de metileno, el verde brillante y otras
sustancias usadas por su efecto toxico sobre las Gram positivas.
Cloruro sódico a altas concentraciones.
Bilis o Sales biliares
Antibióticos
Cicloheximida o actidiona: se añade para impedir el crecimiento de hongos
ambientales en los medios de cultivo.2
Azucares:
Se puede adicionar para fines nutritivos o para investigar la actividad metabólica.2
Indicadores de pH:
Es esencial para detectar variaciones en la acidez o alcalinidad del medio
causadas por el metabolismo bacteriano.
Los medios de cultivo usados en el laboratorio fueron:



Agar nutritivo: está compuesto de extracto de carne, peptona, ClNa, agar y
agua destilada. Se usa como medio de cultivo general para la mayor parte de
los microorganismos y como base para la preparación de medios selectivos y
enriquecidos.2
Agar sangre: compuesto por extracto de carne, peptona, ClNa, sangre, agra y
agua destilada. Lleva como base el agar nutritivo y se le adiciona sangre
desfibrinada en una porción del 5-10%, principalmente sangre de conejo,
carnero y caballo ya que ofrecen buenas reacciones hemolíticas. No se usa
sangre humana procedente de banco puesto que contiene citrato que puede
inhibir el crecimiento de algunos microorganismos y glucosa que falsea las
reacciones de hemolisis, aparte de anticuerpos y agentes antimicrobianos.
Aquí crecen la mayoría de bacterias patógenas y algunas levaduras. Este
medio es adecuado para el cultivo y aislamiento de microorganismos
exigentes, también para estudiar la actividad hemolica.2
La hemolisis puede ser de 3 tipos: α hemolisis: clarificación parcial de la
sangre en una colonia, que produce un cambio de color gris verdoso o
pardusco en el medio; β hemolisis: zona de clarificación completa de la sangre
alrededor de las colonias debido una lisis completa de eritrocitos que produce
una eliminación de la sangre del medio debajo de las colonias y a su alrededor;
γ hemolisis: sin lisis o cambio de color en los eritrocitos.3
Agar MacConkey: está compuesto por peptona, lactosa, ClNa, sales biliares,
cristal violeta, rojo neutro, agar y agua destilada. Los medios usados para el

5. 


aislamiento selectivo de enterobacterias se caracterizan por contener lactosa y
un indicador de cambio de pH que detecta la actividad fermentadora sobre este
azúcar. Además estos medios de cultivos llevan sustancias inhibidoras de
Gram positivos. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores.
El indicador vira a rojo ladrillo en medio acido. Las bacterias que fermentan la
lactosa producen colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una
zona opaca debida a la precipitación de sales biliares; las no fermentadoras
dan colonias incoloras más o menos transparentes.2
Agar EMB (Eosina azul de metileno): compuesto por peptona, fosfato
dipotásico, lactosa, eosina azul de metileno, agar y agua destilada. Su uso es
prácticamente el mismo del agar MacConkey. El azul de metileno actúa como
indicador e inhibidor al mismo tiempo. Las colonias fermentadoras de lactosa
presentan un tono violeta más o menos intenso. Por ejemplo Escherichia Coli
origina colonias muy oscuras, frecuentemente con brillo verde metálico que
facilita su detección en aguas contaminadas con materias fecales. 2
Agar AMS (Manitol sal): es un medio de cultivo altamente selectivo, pues
tiene una alta concentración de cloruro de sodio que impide el crecimiento de
la mayoría de las bacterias, sin embargo tolera los estafilococos. Además el
cultivo contiene manitol como único carbohidrato y rojo fenol como indicador
del pH, cuyo ámbito de viraje esta entre pH 8,4 (rojo) y pH 6,8 (amarillo).
Cuando hay producción de ácido a causa de la fermentación de manitol, las
colonias aparecen rodeadas de un halo amarillo; el medio permanecerá sin
cambio de color o acentuara a rojo medio si las bacterias no fermentan el
manitol.4
Caldo nutritivo: es un medio líquido compuesto por una infusión de carne,
ClNa, peptona, extracto de levadura y también fosfato disódico. Es usado como
base para otros caldos que puedan contener más nutrientes. 5
METODOLOGÍA
Para este laboratorio se utilizaron cepas de Gram positivas y cepas de Gram
negativas, se implementaron medios de cultivo como lo fue el agar nutritivo que es
en medio simple, el caldo nutritivo, el agar EMB que es un medio selectivo,
también el agar AS que es un medio enriquecido, el agar AMS que es un medio
diferencial y otros materiales como mecheros, asas y agujas de inoculación, cinta
de enmascarar.

6. Se realizó el procedimiento en 3 tipos de cultivo, en cultivo en placa de agar, en
cultivo en agar inclinado y cultivo en caldo nutritivo.
En el cultivo en placa de agar se utilizan varios métodos de siembra por estrías en
superficie entre las cuales tenemos el francés y el clásico de los cuales teníamos
como objetivo conseguir colonias separadas para lograr un mejor análisis
En el método francés flameamos el asa y tomamos la muestra de E. coli y la
pusimos en la caja de petri con el inoculo extendiendo el cultivo haciendo líneas
paralelas, después flameamos de nuevo el asa e hicimos otras líneas paralelas de
forma vertical y después volvimos a flamear e hicimos las líneas de forma
horizontal hasta que cubrir toda al caja.
En el método clásico utilizamos barias cepas por lo cual marcamos en la cinta de
enmascarar los nombres de dichas bacterias, en el cual también se utilizó un asa
flameado pero a diferencia del anterior este se esparcía por la caja de petri en
forma de zig-zag hasta cubrirla.
En el cultivo de agar inclinado lo primero que hicimos fue rotular los tubos y
ponerles los datos necesarios para la observación que se hizo al día siguiente.
Luego de flamear el asa se tomó una muestra del cultivo teniendo cuidado en el
remover el tapón y mantenerlo en la zona estéril ya luego se tomó el tubo en el
que se iba a inocular el cual se flameo la boca para introducir la porción de cultivo
haciendo una estría en la superficie en línea recta. Ya para terminar se flamearon
las asas. Esquema 1
Esquema 1
Esquema 2

7. En el cultivo en caldo nutritivo realizamos los mismos pasos del anterior pero en
este caso la muestra de cultivo la sumergimos y la agitamos con el asa ene l
medio líquido Esquema 2.
RESULTADOS Y DISCUSION
1. CULTIVO EN CAJA PETRI DE
AGAR NUTRITIVO
METODO: Francés
BACTERIA: Sherichia coli
CONSITENCIA: Solido
El agar nutritivo es un medio de cultivo
simple
utilizado
para
propósitos
generales como para el aislamiento y
recuento de microorganismos con
escasos requerimientos nutricionales.6
Se aconseja como medio de cultivo
general para la mayor parte de los
microorganismos y como base para la
preparación
de
otros
medios
7
enriquecidos y selectivos.
El método utilizado fue el francés. En la imagen 1 se pueden observar algunas
colonias separadas.
El crecimiento de la Scherichia coli, se puede decir fue porque este cultivo no es
selectivo por tanto la mayoría de las bacterias crecen en él.
La bacteria cultivada presento las siguientes características:

8. Forma
Puntiforme
Color
Blanco
Transparentoso
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Forma
Circular
Color
Blanco
Transparentoso
Borde
Entero
Elevación
Convexa
2. CULTIVO EN AGAR-SANGRE
Método: Clásico
Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.
Imagen 2
En el agar sangre crecen la mayoría de bacterias
y levaduras, ya que es un medio enriquecido de
nutrientes que se usa principalmente para
microorganismos exigentes.8
Como se observa en la imagen 2 las bacterias
Staphylococcus aurerus, Bacillus cereus y
Scherichia coli, sembradas en este cultivo
formaron colonias.
Staphylococcus aurerus
Se observaron colonias grandes con las siguientes características:
Forma
Ameboide
Color
Amarillo opaco
Borde
Ondulado
Elevación
Convexa
Es una colonia Beta hemolítica, porque se
puede observar un halo transparente
alrededor de la colonia.
Tanto la S. aureus y B. cereus son colonias
B-hemoliticas, pues poseen enzimas

9. llamadas hemolisinas que hacen lisis de los globulos rojos.8
Scherichia coli
La colonia de Scherichia coli presentó las siguientes características:
Forma
Puntiforme
Forma
Circular
Color
Gris apagado
Color
Gris apagado
Borde
Entero
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Elevación
Convexa
Es una colonia gamma hemolítica porque la E. coli no es capaz de realizar
hemolisis.9
3. CULTIVO EN AGAR EMB (EOSINA AZUL DE METILENO)
Método: Clásico
Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.
Imagen 3
Scherichia coli
Esta bacteria en agar EMB presenta un brillo
verde con negro producido por miembros que
fermentan ávidamente lactosa.
La colonia de Scherichia coli presentó las
siguientes características:

10. Forma
Puntiforme
Forma
Circular
Color
Verde brillante
Color
Verde brillante
Borde
Entero
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Elevación
Convexa
Las bacterias Staphylococcus aureus y Bacillus cereus no muestran crecimiento,
porque son bacterias Gram positivas, y en este medio de cultivo solo crecen
bacterias Gram negativas.9
4. CULTIVO EN AGAR MANITOL SAL
Método: Clásico
Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.
Imagen 4
Ninguna bacteria mostro crecimiento. (Imagen
4)
La S. aureus es una bacteria capaz de crecer
en este medio pues los estafilococos crecen en
altas concentraciones de sal y la S. aureus
posee coagulasa que fermenta el manitol y se
visualiza como colonias amarillas rodeadas de
una zona del mismo color. Pero en este cultivo
no crecio, se concluye que fue por falta de
tiempo ya que La American Public Health
Association (A.P.H.A) recomienda la incubación
durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis.10

11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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