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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PRESENTES EN LA CONCHA NEGRA (ANDARA TUBERCULOSA)
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PRESENTES EN LA CONCHA NEGRA (ANDARA TUBERCULOSA)

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Aislamiento de los diferentes tipos de enterobacterias presentes en la concha Negra (Andara tuberculosa), utilizando medios selectivos, y aplicando pruebas bioquímicas

Aislamiento de los diferentes tipos de enterobacterias presentes en la concha Negra (Andara tuberculosa), utilizando medios selectivos, y aplicando pruebas bioquímicas


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  • 1. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERAL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PRESENTES EN LA CONCHA NEGRA (Anadara tuberculosa) C.R. Cevallos-Navarrete*, A.C. Argüello-Noboa, C.A. Pérez-Zambrano, A.C. Gallegos-Calderón Laboratorio de Microbiología General, Universidad Tecnológica Equinoccial, Occidental y Mariana de Jesús, Quito, Ecuador. *fl4meboy@hotmail.comOBJETIVOAislar los diferentes tipos de enterobacterias presentes en el alimento, utilizandomedios selectivos, e identificar el género y especie de las bacterias encontradas,aplicando pruebas bioquímicas.INTRODUCCIÓNEnterobacteriasEs la forma común de denominar a las bacterias Gram. negativas. Reciben este nombreporque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseenflagelos son móviles; el resto, inmóviles. La capacidad para fermentar la lactosa y eltiempo empleado en hacerlo sirven para diferenciar los géneros. Los que no realizan lafermentación son patógenos, los fermentadores, saprofitos. Hay enterobacterias queprovocan intoxicaciones alimentarias, como la salmonelosis. Los síntomas son fiebre,diarrea y dolores abdominales. Es una intoxicación muy rápida. Las epidemias depeste, que fueron muy importantes en la antigüedad, también son producidas por unaenterobacteria.Clasificación científica:Las enterobacterias constituyen la familia Enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae). Seclasifican en cinco tribus: Escherichieas, Klebsielleas, Proteeas, Yersineas y Erwinieas.Cada una comprende diversos géneros.Descripción del producto:Concha NegraLa concha negra (Anadara tuberculosa), es un molusco de 4 a 6 cm de longitud, decolor negro y con filamentos en su caparazón semejantes a pelos. Crece en los fondoslodosos de los manglares.La concha negra es consumible, y es uno de los mariscos más populares en Ecuador. Serecolecta de los manglares, para su venta y distribución. Las conchas negras, sonprohibidas de recolectar en ciertas épocas del año, debido a sus periodos de
  • 2. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERALreproducción. También debe realizarse un análisis de presencia de saxitoxinas, paraasegurar la seguridad en su consumo.Importancia de recuento de Enterobacterias en alimentos:Microorganismos indicadoresLa presencia de determinados microorganismos en los alimentos se puede aprovecharcomo un indicador potente sobre algunos aspectos fundamentales relacionados conlos mismos. Este tipo de microorganismos recibe la denominación común demicroorganismos indicadores y su investigación y cuantificación nos puede aportarinformación sobre la seguridad sanitaria del alimento, su grado de alteración, su nivelde envejecimiento, la bondad de su proceso de elaboración, etc.La presencia de microorganismos que modifican o degradan las característicasorganolépticas de los productos, aunque no causen intoxicaciones, incapacitan losalimentos para su consumo o disminuyen su vida comercial.Enterobacterias patógenasLa presencia de Enterobacterias patógenas en los alimentos supone un grave riesgopara los consumidores que van a ingerirlos. Debemos garantizar la ausencia de estetipo de microorganismos en los alimentos.• Bacillus cereus• Clostridium botulinum• Clostridium perfringens• Escherichia coli• Listeria monocytogenes• Salmonella• Shigella• Staphylococcus aureus• Yersinia enterocolitica
  • 3. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERALMATERIALES Y MÉTODOS:10 conchas negras fueron adquiridas en el mercado de “Santa Clara”, norte de Quito.La muestra fue transportada, tal como fue despachada por su distribuidor, hasta ellaboratorio de microbiología de la Universidad tecnológica Equinoccial. La muestra semantuvo a temperatura ambiente hasta su análisis, el cual se realizóaproximadamente 2 horas después de adquirida.Parte 1: EnriquecimientoSe pesaron asépticamente 25 gr de concha negra (incluyendo parte del caparazónexterno), y se los colocó en 225 gr. de TSB (Caldo de Soya Triptona), para elenriquecimiento de las enterobacterias. Luego se procedió a incubar a 37oC, por 24horas.Parte 2: Aislamiento de EnterobacteriasSe inoculó el caldo en EMB (Eosina Azul de Metileno), por la técnica de estriado, paraaislar colonias de diferentes enterobacterias. Después, se incubó a 37oC durante 24horas.Parte 3: PurificaciónTras examinar las colonias aisladas sospechosas de enterobacterias, se procedió ainocular de nuevo en EMB, con el fin de obtener una cepa pura de cada una de lasbacterias.Las 2 cajas Petri se incubaron a 37oC, por 24 horas.Al cabo de 24 horas, se pudo encontrar las 2 cajas Petri con cepas puras,completamente aisladas. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y lassegundas de color verde brillante.De las colonias aisladas, se realizó una tinción gram, y se procedió a observar almicroscopio.Parte 4: IdentificaciónPara la identificación de las bacterias, es decir, su clasificación en género y especie, seprocedió a realizar las pruebas bioquímicas, para saber las características particularesde sus metabolismos.
  • 4. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERALLas pruebas bioquímicas que se utilizaron fueron: el conjunto IMViC (Indol, Rojo-Metilo, Voges-Proskauer y Citrato), Hidrólisis de Úrea, TSI (Tres azúcares y Hierro), SIM(Sulfuro Indol Motilidad) y LIA (Lisina Hierro). Para realizar estas pruebas, se inoculo labacteria en cada tubo con el diferente medio usando la técnica correspondiente.Los tubos de ensayo con los medios inoculados, se incubaron a 37 oC por 24 horas.Transcurrido ese tiempo, se dio lectura a los resultados de las Pruebas bioquímicas.Para realizar algunas pruebas, se debió añadir a los tubos de ensayo con el medio, elcorrespondiente reactivo revelador. (RM: Rojo metilo; VP: K(OH), Alfa-naftol; Indol:reactivo de Kovacs).Después de identificar los 2 tipos de bacterias, se inoculó la cepa pura de cada una enmedio TSB, y se la almacenó en la refrigeradora para futuros estudios.RESULTADOS Y DISCUSIÓN:Al cabo de las 24 horas de incubado el EMB inoculado con el caldo TSB, principalmentede 2 tipos de microorganismos. Se observó que la mayoría de colonias presentaban uncolor verde brillante, con brillo metálico, por lo que pudimos especular que se tratabade colonias de E. coli, debido a que presentaba los colores y forma de colonias típicasde esta bacteria en este medio. El resto de colonias tenían un una consistencia viscosay un color rosa oscuro, lo que indicaba que se trataba de microorganismos glucosa y/olactosa positivos, es decir, que metabolizan una o las 2 azúcares.Tras aislar cada una de las bacterias encontradas, se pudo encontrar las 2 cajas de EMBcon cepas puras. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y lassegundas de color verde brillante.Al observar la placa de las primeras bacterias a la que se aplicó tinción Gram. en elmicroscopio, se encontró que eran Gram. negativa, y presentaban forma de bacilo.Las segundas bacterias, por su reacción de coloración verde-claro y con brillo metálicoen el medio EMB, se especuló que se trataba de Escherichia coli, por lo que no serealizó la tinción Gram. con esta cepa.Después de analizar los resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas a las 2diferentes cepas, se pudo apreciar sus características de metabolismo propias y portanto, las 2 bacterias fueron clasificadas en género y especie. Los resultados de laspruebas bioquímicas se pueden apreciar en las tablas 1 y 2, y en las figuras 1 y 2.
  • 5. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERAL Prueba Bioquímica Klebsiella planticola 1ra Bacteria aislada Producción de Indol - - Rojo-Metilo - -IMViC Voges-Proskauer + - Citrato de Simmons + + Producción de H2S + - Hidrólisis de Urea + + Descarboxilación de Lisina + + Motilidad - - Producción de Gas + + Producción de Ácido: -Glucosa + + -Sacarosa + + -Lactosa + + Tabla 1. Comparación de resultados de pruebas bioquímicas entre la 1ra bacteria aislada y los resultados para Klebsiella planticola Fig. 1. Pruebas bioquímicas de la 1ra bacteria aislada Se comparó los resultados obtenidos de la primera bacteria aislada con la bacteria del manual que presentaba las características similares, en este caso fue la Klebsiella planticola. Los resultados casi indican que se trata en realidad de esta bacteria, a excepción de la prueba de Voges-Proskauer. Esta prueba fue repetida 2 veces, sin embargo expuso el mismo resultado que no coincidía con lo estipulado para la especie. Se decidió pasar por alto esta variación, por 2 razones importantes: La variación en el resultado de esta prueba, puede ser atribuida a los cambios que puede sufrir el
  • 6. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERAL microorganismo en el medio donde se desarrolla. A demás, a excepción del resultado en el Voges-Proskauer, se observó en los demás medios de cultivo la forma típica de colonia correspondiente al género Klebsiella sp. Prueba Bioquímica Escherichia coli 2da Bacteria aislada Producción de Indol + + Rojo-Metilo + +IMViC Voges-Proskauer - - Citrato de Simmons - - Tabla 2. Comparación de resultados del conjunto de pruebas IMViC entre la 2ra bacteria aislada y los resultados para Escherichia coli Fig. 2. Pruebas bioquímicas del conjunto IMViC para la 2da bacteria aislada Para la segunda bacteria aislada, solo se realizó el conjunto de pruebas IMViC, ya que todas las características observadas, indicaban que se trataba de Escherichia coli, lo cual se pudo ratificar con el conjunto de pruebas, ya que se observó coincidencia en todas las 4. CONCLUSIONES  Los resultados del análisis de Enterobacterias, después haber sido aisladas y sometidas a la diferentes pruebas bioquímicas, se llegó a clasificar 2 tipos diferentes de ellas: Klebsiella plantícola y Escherichia coli.  La E. coli es un microorganismo patógeno, y su presencia en el alimento indica un posible riesgo de intoxicación para la persona que lo ingiera.
  • 7. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERAL  La recolección de conchas es una actividad artesanal, por ende, no suele cumplir con las normas de control de calidad. Por ello, el consumidor final debería tomar precauciones al adquirir el producto y al procesarlo para ser ingerido.  La Klebsiella planticola es una enterobacteria que se desarrolla principalmente en las plantas de mangle. La concha negra habita en las raíces de los manglares lo cual podría explicar la presencia del microorganismo en el alimento.  Este microorganismo, no tiene características patógenas, sin embargo, se debería tomar medidas de limpieza para reducirlo lo mas posible antes de que el producto sea ingerido.BIBLIOGRAFÍA1. International Commission for Microbiological Specifications in Foods. Ecología microbiana de los alimentos. Productos alimenticios. Zaragoza: Editorial Acribia, 1985; vol 2: 528-30.2. Proyecto NC-92. Determinación cuantitativa de Enterobacterias totales en alimentos. 1992.3. Farmer JJ, Kelly TM. Enterobacteriaceae. En Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadony HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology. 5 ed. Washington, DC: American Society of Microbiology 1991;360-83.4. Lic. Virginia Leyva Castillo. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, 10300, Cuba.5. Anónimo. 2008-06-27. Características de Andara tuberculosa. www.marn.gob.sv/uploaded/content/article/1586257920.pdf+concha+negra/+molusco&hl =es&ct=clnk&cd=4&gl=ec.