Aislamiento de los diferentes tipos de enterobacterias presentes en la concha Negra (Andara tuberculosa), utilizando medios selectivos, y aplicando pruebas bioquímicas

1. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA
MICROBIOLOGIA GENERAL
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PRESENTES EN
LA CONCHA NEGRA (Anadara tuberculosa)
C.R. Cevallos-Navarrete*, A.C. Argüello-Noboa, C.A. Pérez-Zambrano, A.C. Gallegos-Calderón
Laboratorio de Microbiología General, Universidad Tecnológica Equinoccial, Occidental y Mariana de Jesús, Quito,
Ecuador.
*fl4meboy@hotmail.com
OBJETIVO
Aislar los diferentes tipos de enterobacterias presentes en el alimento, utilizando
medios selectivos, e identificar el género y especie de las bacterias encontradas,
aplicando pruebas bioquímicas.
INTRODUCCIÓN
Enterobacterias
Es la forma común de denominar a las bacterias Gram. negativas. Reciben este nombre
porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen
flagelos son móviles; el resto, inmóviles. La capacidad para fermentar la lactosa y el
tiempo empleado en hacerlo sirven para diferenciar los géneros. Los que no realizan la
fermentación son patógenos, los fermentadores, saprofitos. Hay enterobacterias que
provocan intoxicaciones alimentarias, como la salmonelosis. Los síntomas son fiebre,
diarrea y dolores abdominales. Es una intoxicación muy rápida. Las epidemias de
peste, que fueron muy importantes en la antigüedad, también son producidas por una
enterobacteria.
Clasificación científica:
Las enterobacterias constituyen la familia Enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae). Se
clasifican en cinco tribus: Escherichieas, Klebsielleas, Proteeas, Yersineas y Erwinieas.
Cada una comprende diversos géneros.
Descripción del producto:
Concha Negra
La concha negra (Anadara tuberculosa), es un molusco de 4 a 6 cm de longitud, de
color negro y con filamentos en su caparazón semejantes a pelos. Crece en los fondos
lodosos de los manglares.
La concha negra es consumible, y es uno de los mariscos más populares en Ecuador. Se
recolecta de los manglares, para su venta y distribución. Las conchas negras, son
prohibidas de recolectar en ciertas épocas del año, debido a sus periodos de

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reproducción. También debe realizarse un análisis de presencia de saxitoxinas, para
asegurar la seguridad en su consumo.
Importancia de recuento de Enterobacterias en alimentos:
Microorganismos indicadores
La presencia de determinados microorganismos en los alimentos se puede aprovechar
como un indicador potente sobre algunos aspectos fundamentales relacionados con
los mismos. Este tipo de microorganismos recibe la denominación común de
microorganismos indicadores y su investigación y cuantificación nos puede aportar
información sobre la seguridad sanitaria del alimento, su grado de alteración, su nivel
de envejecimiento, la bondad de su proceso de elaboración, etc.
La presencia de microorganismos que modifican o degradan las características
organolépticas de los productos, aunque no causen intoxicaciones, incapacitan los
alimentos para su consumo o disminuyen su vida comercial.
Enterobacterias patógenas
La presencia de Enterobacterias patógenas en los alimentos supone un grave riesgo
para los consumidores que van a ingerirlos. Debemos garantizar la ausencia de este
tipo de microorganismos en los alimentos.
• Bacillus cereus
• Clostridium botulinum
• Clostridium perfringens
• Escherichia coli
• Listeria monocytogenes
• Salmonella
• Shigella
• Staphylococcus aureus
• Yersinia enterocolitica

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MATERIALES Y MÉTODOS:
10 conchas negras fueron adquiridas en el mercado de “Santa Clara”, norte de Quito.
La muestra fue transportada, tal como fue despachada por su distribuidor, hasta el
laboratorio de microbiología de la Universidad tecnológica Equinoccial. La muestra se
mantuvo a temperatura ambiente hasta su análisis, el cual se realizó
aproximadamente 2 horas después de adquirida.
Parte 1: Enriquecimiento
Se pesaron asépticamente 25 gr de concha negra (incluyendo parte del caparazón
externo), y se los colocó en 225 gr. de TSB (Caldo de Soya Triptona), para el
enriquecimiento de las enterobacterias. Luego se procedió a incubar a 37oC, por 24
horas.
Parte 2: Aislamiento de Enterobacterias
Se inoculó el caldo en EMB (Eosina Azul de Metileno), por la técnica de estriado, para
aislar colonias de diferentes enterobacterias. Después, se incubó a 37oC durante 24
horas.
Parte 3: Purificación
Tras examinar las colonias aisladas sospechosas de enterobacterias, se procedió a
inocular de nuevo en EMB, con el fin de obtener una cepa pura de cada una de las
bacterias.
Las 2 cajas Petri se incubaron a 37oC, por 24 horas.
Al cabo de 24 horas, se pudo encontrar las 2 cajas Petri con cepas puras,
completamente aisladas. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y las
segundas de color verde brillante.
De las colonias aisladas, se realizó una tinción gram, y se procedió a observar al
microscopio.
Parte 4: Identificación
Para la identificación de las bacterias, es decir, su clasificación en género y especie, se
procedió a realizar las pruebas bioquímicas, para saber las características particulares
de sus metabolismos.

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Las pruebas bioquímicas que se utilizaron fueron: el conjunto IMViC (Indol, Rojo-
Metilo, Voges-Proskauer y Citrato), Hidrólisis de Úrea, TSI (Tres azúcares y Hierro), SIM
(Sulfuro Indol Motilidad) y LIA (Lisina Hierro). Para realizar estas pruebas, se inoculo la
bacteria en cada tubo con el diferente medio usando la técnica correspondiente.
Los tubos de ensayo con los medios inoculados, se incubaron a 37 oC por 24 horas.
Transcurrido ese tiempo, se dio lectura a los resultados de las Pruebas bioquímicas.
Para realizar algunas pruebas, se debió añadir a los tubos de ensayo con el medio, el
correspondiente reactivo revelador. (RM: Rojo metilo; VP: K(OH), Alfa-naftol; Indol:
reactivo de Kovacs).
Después de identificar los 2 tipos de bacterias, se inoculó la cepa pura de cada una en
medio TSB, y se la almacenó en la refrigeradora para futuros estudios.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Al cabo de las 24 horas de incubado el EMB inoculado con el caldo TSB, principalmente
de 2 tipos de microorganismos. Se observó que la mayoría de colonias presentaban un
color verde brillante, con brillo metálico, por lo que pudimos especular que se trataba
de colonias de E. coli, debido a que presentaba los colores y forma de colonias típicas
de esta bacteria en este medio. El resto de colonias tenían un una consistencia viscosa
y un color rosa oscuro, lo que indicaba que se trataba de microorganismos glucosa y/o
lactosa positivos, es decir, que metabolizan una o las 2 azúcares.
Tras aislar cada una de las bacterias encontradas, se pudo encontrar las 2 cajas de EMB
con cepas puras. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y las
segundas de color verde brillante.
Al observar la placa de las primeras bacterias a la que se aplicó tinción Gram. en el
microscopio, se encontró que eran Gram. negativa, y presentaban forma de bacilo.
Las segundas bacterias, por su reacción de coloración verde-claro y con brillo metálico
en el medio EMB, se especuló que se trataba de Escherichia coli, por lo que no se
realizó la tinción Gram. con esta cepa.
Después de analizar los resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas a las 2
diferentes cepas, se pudo apreciar sus características de metabolismo propias y por
tanto, las 2 bacterias fueron clasificadas en género y especie. Los resultados de las
pruebas bioquímicas se pueden apreciar en las tablas 1 y 2, y en las figuras 1 y 2.

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Prueba Bioquímica Klebsiella planticola 1ra Bacteria aislada
Producción de Indol - -
Rojo-Metilo - -
IMViC
Voges-Proskauer + -
Citrato de Simmons + +
Producción de H2S + -
Hidrólisis de Urea + +
Descarboxilación de Lisina + +
Motilidad - -
Producción de Gas + +
Producción de Ácido:
-Glucosa + +
-Sacarosa + +
-Lactosa + +
Tabla 1. Comparación de resultados de pruebas bioquímicas entre la 1ra bacteria aislada y los resultados
para Klebsiella planticola
Fig. 1. Pruebas bioquímicas de la 1ra bacteria aislada
Se comparó los resultados obtenidos de la primera bacteria aislada con la bacteria del
manual que presentaba las características similares, en este caso fue la Klebsiella
planticola. Los resultados casi indican que se trata en realidad de esta bacteria, a
excepción de la prueba de Voges-Proskauer. Esta prueba fue repetida 2 veces, sin
embargo expuso el mismo resultado que no coincidía con lo estipulado para la especie.
Se decidió pasar por alto esta variación, por 2 razones importantes: La variación en el
resultado de esta prueba, puede ser atribuida a los cambios que puede sufrir el

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microorganismo en el medio donde se desarrolla. A demás, a excepción del resultado
en el Voges-Proskauer, se observó en los demás medios de cultivo la forma típica de
colonia correspondiente al género Klebsiella sp.
Prueba Bioquímica Escherichia coli 2da Bacteria aislada
Producción de Indol + +
Rojo-Metilo + +
IMViC
Voges-Proskauer - -
Citrato de Simmons - -
Tabla 2. Comparación de resultados del conjunto de pruebas IMViC entre la 2ra bacteria aislada y los
resultados para Escherichia coli
Fig. 2. Pruebas bioquímicas del conjunto IMViC para la 2da bacteria aislada
Para la segunda bacteria aislada, solo se realizó el conjunto de pruebas IMViC, ya que
todas las características observadas, indicaban que se trataba de Escherichia coli, lo
cual se pudo ratificar con el conjunto de pruebas, ya que se observó coincidencia en
todas las 4.
CONCLUSIONES
 Los resultados del análisis de Enterobacterias, después haber sido aisladas y
sometidas a la diferentes pruebas bioquímicas, se llegó a clasificar 2 tipos
diferentes de ellas: Klebsiella plantícola y Escherichia coli.
 La E. coli es un microorganismo patógeno, y su presencia en el alimento indica
un posible riesgo de intoxicación para la persona que lo ingiera.

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 La recolección de conchas es una actividad artesanal, por ende, no suele
cumplir con las normas de control de calidad. Por ello, el consumidor final
debería tomar precauciones al adquirir el producto y al procesarlo para ser
ingerido.
 La Klebsiella planticola es una enterobacteria que se desarrolla principalmente
en las plantas de mangle. La concha negra habita en las raíces de los manglares
lo cual podría explicar la presencia del microorganismo en el alimento.
 Este microorganismo, no tiene características patógenas, sin embargo, se
debería tomar medidas de limpieza para reducirlo lo mas posible antes de que
el producto sea ingerido.
BIBLIOGRAFÍA
1. International Commission for Microbiological Specifications in Foods. Ecología microbiana
de los alimentos. Productos alimenticios. Zaragoza: Editorial Acribia, 1985; vol 2: 528-30.
2. Proyecto NC-92. Determinación cuantitativa de Enterobacterias totales en alimentos. 1992.
3. Farmer JJ, Kelly TM. Enterobacteriaceae. En Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg
HD, Shadony HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology. 5 ed. Washington, DC: American
Society of Microbiology 1991;360-83.
4. Lic. Virginia Leyva Castillo. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No.
1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, 10300, Cuba.
5. Anónimo. 2008-06-27. Características de Andara tuberculosa.
www.marn.gob.sv/uploaded/content/article/1586257920.pdf+concha+negra/+molusco&hl
=es&ct=clnk&cd=4&gl=ec.