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Polinucleótidos Polinucleótidos Presentation Transcript

  • Polinucleótidos
  • Polinucleótido Extremo 5’ Extremo 3’ Enlace fosfodiéster
  • 5’- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3’ 5’-CATTGCGGAATGCC-3’ 3’-GTAACGCCTTACGG-5’ Formas de representación de polinucleótidos
  • 5’ 3’ 5’ 3’ Polinucleótido en doble hélice
  • Propiedades de los polinucleótidos, 1 1. Absorción de luz UV a 260 nm % A 260, Hipocromismo T (ºC) 100 110 120 En el DNA doble hélice se da el fenómeno de hipocromismo : el DNA desnaturalizado por el calor absorbe un 20-30 % más que el DNA nativo
  • Propiedades de los polinucleótidos, 2 2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff 3. Reacción positiva de los polirribonucleótidos al orcinol 4. Reacción con agentes intercalantes (acridinas) 5. Hidrólisis completa del RNA con álcali; el DNA es resistente a álcali.
  • Rotura química de polinucleótidos - Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil sulfato (DMS) tiene lugar la metilación de purinas; por calentamiento a pH neutro se rompe el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico ; el tra- tamiento ulterior con ácido diluído rompe la cadena por el sitio apurínico. - Tratando un polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi- dínico ; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidínico.
  •  
  • Calentamiento
  •  
  • Rotura enzimática de polinucleótidos Endonucleasas : atacan enlaces fosfodiéster situados en el interior de una cadena polinucleotídica, y suelen ser específicas de cada ácido nucleico: - Ribonucleasas - Desoxirribonucleasas Exonucleasas : atacan enlaces fosfodiéster situados en los extremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelen atacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos: - Exonucleasa de bazo (rotura tipo b) - Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)
  • Rotura tipo a : Da lugar a una mezcla de 5’-nucleótidos
  • Rotura tipo b : Da lugar a una mezcla de 3’-nucleótidos
  • Endonucleasas : DNAasa I: rotura completa, tipo a DNAasa II: rotura completa, tipo b RNAasa pancreática: rompe (b) enlaces Py-X RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X Endonucleasas de restricción Exonucleasas : Exonucleasa de bazo: libera 3’-nucleótidos Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5’-nucleótidos
  • Endonucleasas de restricción, 1 : 1. Reconocen secuencias específicas, por lo general palindrómicas : 5’- ATCGTTGCCTACAATT GAATTC CCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAA CTTAAG GGTTATTGGGAA -5’ La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
  • Endonucleasas de restricción, 2 : 2. Suelen romper el polinucleótido dejando extremos cohesivos : 5’- ATCGTTGCCTACAATT GAATTC CCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAA CTTAAG GGTTATTGGGAA -5’ 5’- ATCGTTGCCTACAATT G 3’- TAGCAACGGATGTTAA CTTAA AATTC CCAATAACCCTT -3’ G GGTTATTGGGAA -5’ Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restricción
  • Endonucleasas de restricción, 3 : 3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA por un número muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula- ción experimental del mismo. EcoRI GAATTC ClaI ATCGAT HaeIII GGCC RsrII CGGATCCG Algunas endonucleasas de restricción:
  • Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción EcoRI, que es 5’-GAATTC-3’ En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y 20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar sería de 0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324 O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos
  • Separación electroforética de fragmentos de restricción del DNA. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio (un agen- te intercalante) y se observan bajo luz UV.
  • Método de Sanger para secuenciación de polinucleótidos
  •  
  • Síntesis en presencia de ddGTP
  • Síntesis en presencia de ddATP
  • Síntesis en presencia de ddCTP
  • Síntesis en presencia de ddTTP
  • A continuación, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este método sepa- ra polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado radioactiva- mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía. Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del poli- nucleótido inicial: 5’-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3’