CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN   1. Định nghĩa       Protein là những đại phân tử được tạo thành từ các đơn phân axít amin...
keratin, colagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầucó nhiều nếp gấp β hơn.   ...
Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nêncấu trúc bậc bốn của protein. Các chu...
nói chung. Calcithonin có tác dụng hạ thấp nồng độ canxi trong                    trao đổi chất                           ...
-   Bước 2: Tổng hợp chuỗi poly peptit: Tại mã mở đầu AUG, riboxom tiếp xúc vớimARN, aa mở đầu-tARN tiến vào riboxom khớp ...
Hiện nay nhân loại đang đứng trước vấn đề bùng nổ dân số, mỗi năm tăng khoảng gần100 triệu người. Năm 1996 có 5,7 tỉ người...
Axit amin     Lúa mỳ Trứng       Spirulina   S. cerevisiae    Candida     Pseudomonas                                  max...
hóa hết lượng protein có trong thức ăn. Hầu hết các loại thức ăn đều thiếu 1 hay nhiều loại axitamin nên thông thường tron...
Protein vi sinh vật được xem là nguồn protein hấp dẫn do chứa khá đầy đủ và cân đốithành phần các axit amin cũng như hàm l...
- Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật       + Với các chất có phân tử lượng thấp thì VSV có thể đồng hóa trực tiếp       + Vớ...
Nguồn nitrat VSV cũng không thể đồng hóa được mà phải trải qua quá trình biến đổidưới tác dụng của enzym nitratreductase đ...
Nấm mốc                       7-10                    33-37                40-43Nấm men                       0,5-5       ...
-     Khi sử dụng cánh khuấy, oxi tiếp xúc với màng tế bào do đó cần sục khí sao cho áp            suất bên ngoài lớn hơn ...
+ Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo. Hàm lượng protein trong tảo gần với quy      định protein tiêu chuẩn. Lượng...
- Sinh khối nấm men chứa khoảng 20-25% chất khô, trong đó cacbon chiếm 45-50%, nitơ      7-10%, hydro 5-7%, oxy 25-30%, cá...
- Tốc độ sinh trưởng nhanh         - Sử dụng được nhiều loại cơ chất         - pH luôn giữ ở 5-7 để tránh nguy cơ nhiễm cá...
- Phân lập: Để chọn được giồng VSV thuần chủng bước đầu phải tiến hành phân lập từ tựnhiên như đất, nước, không khí, các m...
Giống được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng ở điều kiện tối ưu để thu được VSVđang ở giai đoạn phát triển logarit ho...
- Giữ các chủng lạnh đông phải quy định thời gian cấy truyền. Ở -15 đến -20 oC: 6 tháng,ở -30oC: 6 – 9 tháng, ở -40oC: 1 n...
2.1.1. Chuẩn bị môi trường       - Phải phù hợp với sự phát triển và yêu cầu sinh lý của chủng VSV. Môi trường phải cóđầy ...
* Phòng nuôi: Sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn mạnh như CaCl 2, ... đặc biệt cácphương pháp có khả năng bay hơi nh...
để phên lọc bị ẩm, nếu ẩm sẽ bị bết khối lọc dẫn đến phá hỏng phên lọc tạo ra những dòng chảy.Vì vậy nếu xảy ra hiện tượng...
+ Ưu điểm: Hiệu suất cao, ít tốn diện tích, dễ cơ giới hóa, ít tốn nhân công.       + Nhược điểm: Đòi hỏi đầu tư thiết bị ...
dưỡng pH, nhiệt độ, nồng độ chất tan. VSV đưa vào lên men phải ở giai đoạn lũy tiến của phanhân giống. Đồng thời kéo dài g...
- Giám sát quá trình tạo bọt: Nếu lượng bọt tăng thể tích hiệu dụng của thiết bị giảm gâytràn làm tổn hao và bịt kín hệ th...
- Kết tủa protein trong pha lỏng và tách kết tủa khỏi pha lỏng       + Kết tủa nhờ muối: là phương pháp thông thường nhất ...
hiện nhờ một màng bán thấm hoặc màng lọc phân tử. Dung dịch protein được phân làm 2 pha,một pha không đi qua màng lọc chứa...
nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi làsắc ký trao đổi ion âm, thì tươ...
- Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắcký cột có khả năng phân tách protein...
cả về số lượng và chất lượng. Nấm men bánh mì thuộc họ Endomycetaceae, giốngSacharomyces, loài cereviciae.       Sacharomy...
có độ nhớt cao, chiếm 3,5% lượng mía, được sử dụng nhiều (90% protein từ nấm men được sảnxuất bằng nguyên liệu rỉ đường) d...
Có 3 phương pháp xử lý:       Phương pháp hóa học: dùng axit H2SO4 kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ chấtkeo, đồ...
- Sunphat amon (NH4)2SO4: Là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩmkhông quá 1,5%. Vì sunphat amon thư...
Rỉ đường                                Thùng tạm chứa                    Pha loãng                                Axit hó...
-   Giai đoạn nhân giống sản xuất: Môi trường là rỉ đường nồng độ 12% có bổ sung muối           khoáng, thể tích các thùng...
Thể tích môi trường lên men khoảng 100m 3, thời gian lên men từ 12-20 giờ tạo ra được20-30 tấn nấm men tươi, nhiệt độ 28-3...
Gđ2: Tách nước ở bên trong tế bào, cần nhiều thời gian hơn so với giai đoạn trên. Tốc độsấy trong giai đoạn này giảm, độ ẩ...
Leuxin                                         7,9                  Isoleuxin                                      5,5    ...
Nguyên liệu, nghiền                                                          Nước + H2SO4 (0,5-                          B...
chỉ còn lại khoảng 0,5-0,8% là các hợp chất huyền phù chủ yếu là các chất vô cơ. Quá       trình làm nguội có thể làm lạnh...
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Cn protein
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Cn protein

7,057

Published on

1 Comment
2 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total Views
7,057
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
176
Comments
1
Likes
2
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Cn protein

  1. 1. CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN 1. Định nghĩa Protein là những đại phân tử được tạo thành từ các đơn phân axít amin, chúng kết hợp vớinhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptit (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thểxoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau củaprotein. Protein có thể gồm l hay nhiều chuỗi polypeptit cùng loại hay khác loại. Tính đặc thù vàđa dạng của protein được thể hiện ở số lượng axit amin, thành phần và trình tự sắp xếp các axitamin trong chuỗi polypeptit và cấu trúc không gian của protein. Protein đơn bào là thuật ngữ gọi theo quy ước dùng để chỉ nguồn protein thu được từ visinh vật. Phân biệt với protein đa bào thu được từ động vật và thực vật.2. Cấu trúc của protein Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗipolypepetit. Đầu mạch polypeptit là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhómcacboxyl của axit amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp củacác axit amin trên chuỗi polypeptit. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vìtrình tự các axit amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗipolypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng nhưvai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biếnđổi cấu trúc và tính chất của protein. Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗipolypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấpβ, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như Trang 1
  2. 2. keratin, colagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầucó nhiều nếp gấp β hơn. Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búicó hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyếtđịnh đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tínhchất của gốc -R trong các mạch polypeptit. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầudisunphua (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽxác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kịnước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trịcó ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu. Cấu trúc bậc 3 Trang 2
  3. 3. Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nêncấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu nhưliên kết hyđro. Chi khi hình thành cấu trúc bậc 4 thì protein mới có hoạt tính sinh học. Cấu trúc bậc 43. Chức năng của proteinLoại protein Chức năng Ví dụ Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền, mềm dẻo củaProtein cấu mô liên kết, dây chằng, gân, mô xương. Keratin tạo nên cấutrúc thường Cấu trúc, nâng đỡ trúc chắc của da, lông, móng. Fibroin của tơ nhện, tơ tằm tạocó dạng sợi nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén. Sclerotin tạo sự bền vững cho lớp vỏ ngoài của sâu bọ. Xúc tác sinh học: Xúc tác hầu hết các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phứcProtein tăng vận tốc phản tạp. Các enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn,Enzyme ứng, chọn lọc các amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín, protease phân phản ứng sinh hóa giải protein, lipase phân giải lipidProtein điều Điều hòa quá trình Insulin và Glucagon do tuyến tụy tiết ra có tác dụng điều hòahòa truyền thông tin di hàm lượng đường glucose trong máu động vật có xương sống. truyền, quá trình Thyroglobulin từ tuyến giáp điều hòa các quá trình chuyển hóa Trang 3
  4. 4. nói chung. Calcithonin có tác dụng hạ thấp nồng độ canxi trong trao đổi chất máu. Hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống),Protein vận Vận chuyển các hemoxianin (ở động vật ko xương sống) có vai trò vận chuyểntải chất trong cơ thể oxy từ phổi theo máu tới khắp các mô và cơ quan trong cơ thể. Tham gia vào chứcProtein vận Actin và myosin có vai trò vận động cơ ở tế bào nhân thật. năng vận động củađộng Tubulin có vai trò vận động lông, roi của các sinh vật đơn bào tế bào và cơ thể Cảm nhận, đáp Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tếProtein thụ ứng các kích thích bào thần kinh với các kích thích đặc hiệu. VD. Vai trò của sắcquan của môi trường tố thị giác rodopxin ở màng lưới mắt. Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho phôiProtein dự Dự trữ chất dinh phát triển. Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp acid amintrữ dưỡng cho con. Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần cho hạt nảy mầm như gliadin trong lúa mì, zein trong ngô. Các kháng thể (antibodies) còn được gọi là immunoglobulin tạo Bảo vệ cơ thể khỏiProtein bảo ra hàng ngàn protein khác nhau để phản ứng lại các kháng sự tấn công củavệ nguyên (antigens), bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các những vật thể lạ vật thể lạ.4. Cơ chế sinh tổng hợp protein trong tế bào Sao mã: Là quá trình tổng hợp mARN. mARN sau khi được tổng hợp sẽ rời khỏi nhânđến tế bào chất để tham gia giai đoạn giải mã. Giải mã: gồm 2 bước - Bước 1: Hoạt hóa axit amin Axit amin + ATP Enzym Axit amin hoạt hóa Axit amin hoạt hóa + tARN Enzym Phức axit amin – tARN Trang 4
  5. 5. - Bước 2: Tổng hợp chuỗi poly peptit: Tại mã mở đầu AUG, riboxom tiếp xúc vớimARN, aa mở đầu-tARN tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã mở đầu, sau đó aa1-tARN tiếp tục tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã sau 1. Sau đó liên kết peptit đượcthành lập giữa aa mở đầu với aa1. Riboxom dịch chuyển 1 bộ 3 trên mARN, tARN mở đầu rờiriboxom. Cứ như vậy khi riboxom dịch chuyển đến mã kết thúc, không giải mã mà rời khỏimARN, đồng thời chuỗi polypeptit được giải phóng. Sau đó aa mở đầu được tách khỏi mạchpolypeptit nhờ enzym đặc hiệu. Chuỗi polypeptit tại thành những cấu trúc bậc cao hơn để tạothành protein hoàn chỉnh. Một mARN có thể liên kết nhiều riboxom cùng lúc để tổng hợp nhiềuprotein cùng loại. 5. Tại sao phải sản xuất protein đơn bào 5.1. Vai trò của protein trong cuộc sống Cơ thể người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp các chất dinh dưỡng có trongthức ăn để tiến hành trao đổi chất, duy trì sự sống, tăng cường sinh trưởng và phát triển. Thức ănngoài nước còn bao gồm các nhóm chất: protein, lipit, gluxit, vitamin, muối khoáng,... trong đóprotein là quan trọng nhất. Protein là nguồn nitơ duy nhất cung cấp cho con người và động vật, nó không phải lànguồn cung cấp năng lượng chủ yếu (sau glucid và lipid) mà trong quá trình cơ thể đồng hóaprotein được phân giải thành 20 acid amine cần thiết cho cơ thể. Trong đó có các acid aminekhông thay thế rất cần thiết cho con người và động vật là Isoleucine, leucine, lysine, methionine,phenylalanine, treonine, tryptophan và valin. Nếu không nhận được các aa này cơ thể sẽ bị bệnhtật và chết. 5.2. Tính cấp thiết của CNSX protein đơn bào Trang 5
  6. 6. Hiện nay nhân loại đang đứng trước vấn đề bùng nổ dân số, mỗi năm tăng khoảng gần100 triệu người. Năm 1996 có 5,7 tỉ người, năm 2000 lên đến trên 6 tỉ người, Dự kiến đến năm2020 là 8,5 tỉ và nếu không có sự kiểm soát chặt chẽ của mỗi quốc gia thì đến năm 2050 có thểlên tới con số 10 tỉ dân. Trong đó gần 50 % là trẻ em, đòi hỏi trong khẩu phần ăn hàm lượngprotein cao nhưng lại chưa có khả năng lao động. Hiện nay lượng lương thực, thực phẩm trênthế giới chỉ đủ cung cấp gần 2/3 nhu cầu protein cho con người. Ở Việt Nam, tính trung bìnhhiện nay chỉ cung cấp được khoảng 40g Pr/ ngày/người, thậm trí có các quốc gia hiện nay cóhàm lượng protein trung bình là 3 – 20 g/người/ngày. Vì vậy, công nghệ sản xuất protein đơn bào giải quyết vấn đề thiếu hụt protein trên thếgiới. Cơ sở khoa học của giải pháp này là lợi dụng sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật vàsự phong phú về protein, axit amin trong tế bào vi sinh vật làm nguồn thức ăn cho người và giasúc. Hiệu suất sinh tổng hợp protein ở các đối tượng khác nhau Các loài (1000 kg) Sản lượng protein/ngày (kg) Hiệu suất/ngày (%)Bò 1 0,1Đậu tương 10 1Nấm men 105 104Vi khuẩn 1011 1010 5.3. Giá trị dinh dưỡng của protein vi sinh vật Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật (% khối lượng khô) Thành phần Nấm sợi Tảo Nấm men Vi khuẩnNitơ 5-8 7,5-10 7,5-8,5 11,5-12,5Lipit 2-8 7-20 2-6 1,5-3Chất tro 9-14 8-10 5-9,5 3-7Axit nucleic - 3-8 6-12 8-16 Trong thành phần nitơ của vi sinh vật có mặt các axit amin không thay thế mà hàm lượngcó thể so sánh với protein của trứng và thịt bò. Hàm lượng axit amin không thay thế của một số nguồn protein (mg/100g chất khô) Trang 6
  7. 7. Axit amin Lúa mỳ Trứng Spirulina S. cerevisiae Candida Pseudomonas maxima lipolyticaLysine 2,8 6,5 4,6 7,7 7,8 5,3Threonin 1,9 5,1 4,6 4,8 5,4 4,5Methionin 1,5 3,2 1,4 1,7 1,6 1,8Cystein 2,5 2,4 0,4 - 0,9 0,3Tryptophan 1,1 1,6 1,4 1,0 1,3 -Izolơxin 3,3 6,7 6,0 4,6 5,3 3,9Lơxin 6,7 8,9 8,0 7,0 7,8 7,0Valin 4,4 7,3 6,5 5,3 5,8 5,9Phenylalanin 4,5 5,8 5,0 4,1 4,8 4,2 Tế bào vi sinh vật chứa nhiều loại vitamin. Nấm men giàu vitamin nhóm B, vi khuẩnchiếm ưu thế về VTM B12, tảo chứa nhiều β-caroten (tiền VTM A) và tocopherol, nấm mốc chứaít VTM nhất. Hàm lượng vitamin (mg/100g chất khô) Vitamin Candida utilis S. cerevisiae Pseudomonas methanicaThiamine (B1) 0,53 5-36 1,81Riboflavin (B2) 4,50 3,6-4,2 4,82Niacin (B3) 41,73 32-100 15,9Pyridocyn (B6) 3,34 2,5-10 14,3Axit pantothenic (B5) 3,72 10 2,42Choline (hỗn hợp VTMB) - - 968Axit folic (dạng hòa tan của B9) 2,15 1,5-8 -Inositol (Bh) - - -Biotin (VTM H) 0,23 0,5-1,8 -VTM B12 0 0 0,96Axit p-amineobenzoic (BX) 1,7 0,9-10 - Do cơ thể không tự tổng hợp đựợc các axit amin không thay thế nên phải bổ sung quathức ăn. Nếu bị thiếu một trong số các axit amin này hoặc không đủ về lượng thì không thể đồng Trang 7
  8. 8. hóa hết lượng protein có trong thức ăn. Hầu hết các loại thức ăn đều thiếu 1 hay nhiều loại axitamin nên thông thường trong bữa ăn hàng ngày nên ăn nhiều loại thức ăn khác nhau để cung cấpđầy đủ axit amin không thay thế cho cơ thể. Các loại aa không thay thế thiếu hụt trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau Thực phẩm Loại axit amin thiếu hụt Phần trăm thiếuTrứng Không 0Thịt bò Cystein, Methionin 29Sữa bò Cystein, Methionin 32Gạo, lúa mì, ngô Lyzin 61-72Nấm men bánh mì Cystein, Methionin 55 Vì vậy nguồn protein vi sinh vật là vô cùng quan trọng bổ sung đầy đủ các thiếu hụt vềprotein nói chung và axit amin không thay thế nói riêng cho con người và động vật.6. Các nguồn thu protein • Protein động vật: Protein động vật là nguồn protein phổ biến nhất bao gồm hệ thống protein của thịt, cá,trứng, sữa... Protein cá thường ít tan trong nước nếu chưa được khử lipit tốt. Trong công nghệprotein thường Protein sữa bao gồm cazein, cazeinat và lactoserum. Cazein là một protein cótính chất tạo nhũ được sử dụng nhiều trong thực phẩm. Protein của máu và nội tạng động vật lànguồn protein có thể thu hồi cho sản phẩm giá trị cao như globin, chất tạo nhũ sử dụng trongcông nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. • Protein thực vật Do đặc trưng cấu tạo loài, thực vật được xem là nguồn protein ít phổ biến nhất ngoại trừmột số nguồn protein kinh điển như đậu tương. Gần đây protein từ các nguồn đậu khác như đậuHà Lan, đậu đỏ, các loại hạt như hạt hướng dương, hạt cải cũng được khai thác và sử dụng. Cácloại lá thực vật là một nguồn protein phong phú, tuy nhiên do cấu trúc và thành phần phức tạp,protein thường nằm trong hỗn hợp các thành phần khác nhau của lá thực vật, liên kết với cácthành phần không có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học, vì thế nguồn protein lá thực vật đượckhai thác rất ít. Gần đây một số protein lá thực vật được khai thác chủ yếu để thu hồi các enzymcó hoạt tính sinh học. • Protein vi sinh vật Trang 8
  9. 9. Protein vi sinh vật được xem là nguồn protein hấp dẫn do chứa khá đầy đủ và cân đốithành phần các axit amin cũng như hàm lượng protein của tế bào vi sinh vật. Nguồn protein visinh vật có lợi thế như tốc độ sinh trưởng nhanh, thức ăn rẻ, nâng cấp sản xuất dễ dàng, chủđộng thiết kế và xây dựng dây chuyền công nghệ tổng hợp protein, không phụ thuộc vào thờitiết hay khí hậu, có khả năng kiểm soát quá trình chặt chẽ. • Protein tái tổ hợp Bên cạch các protein khai thác từ các nguồn tự nhiên, một nguồn protein rất quan trọng làprotein thu được từ các vi sinh vật cải biến gen. Tiến bộ trong kỹ thuật gen trong vài thập kỷ gầnđây cho phép tạo ra các protein mới dựa vào việc tạo ra các gen tái tổ hợp. Hiện nay các proteintái tổ hợp có đặc tính quý được biểu hiện trong các vật chủ là động vật, thực vật hoặc vi sinh vậtcàng làm phong phú thêm nguồn protein và khả năng sử dụng chúng. CHƯƠNG II: NGUỒN DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 1. Dinh dưỡng cacbon Nguồn cacbon trong tự nhiên rất phong phú. Tất cả các hợp chất cacbon nào (trừ kimcương và than chì) đều được VSV sử dụng. Đây là nguồn dinh dưỡng chủ yếu có trong môitrường có giá thành tương đối rẻ như CO 2, hydratcacbon (rỉ đường, bã mía, bã bia, dịch kiềmsunfit...), cacbua hydro (n-parafin, khí metal...). Dinh dưỡng cacbon xảy ra ở cả ngoại bào và nộibào. - Ngoại bào: Tinh bột α-amilase Dextrin β-amilase maltose và saccharose Maltose Maltase 2 glucose (mono saccharid) Saccharose Saccharase và investase glucose + fructose (mono saccharid) - Nội bào: Maltase glucose Có oxy Protein, aa, a.acetic, các sán phẩm LM hiếu khí Không oxy Các sản phẩm LM yếm khí CO2, H2O, rượu, acid lactic ... Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào: - Thành phần và cấu tạo hóa học, đặc biệt là mức độ ôxi hóa của nguyên tử cacbon. Trang 9
  10. 10. - Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật + Với các chất có phân tử lượng thấp thì VSV có thể đồng hóa trực tiếp + Với các hợp chất hữu có cao phân tử sẽ được phân hủy nhờ các enzym để tạo thành cáchợp chất thấp phân tử hơn mà VSV có thể đồng hóa được. + Với các hợp chất không tan trong nước (xenluloza, parafin...) thì vi sinh vật hấp thụquanh bề mặt của chúng và phân giải dần dần. Các nguồn cacbon thường được sử dụng là các loại đường sacaroza, maltoza, glucoza,hexoza và các loại bột ngũ cốc như bột gạo, bột ngô, bột đại mạch... chứa chủ yếu là tinh bột. Đểđồng hóa được tinh bột VSV phải tiết ra môi trường enzym amilaza như α-amilaza, β-amilazavà α-glucosidaza. Hệ enzym này được sinh ra trong tế bào rồi được tiết ra môi trường để phânhủy tinh bột. 2. Dinh dưỡng nitơ Vi sinh vật cũng như các cơ thể sống khác cần nitơ để xây dựng tế bào, tất cả các thànhphần quan trọng của tế bào đều chứa nitơ. Nguồn nitơ - Nitơ trong không khí: lượng nitơ này rất phong phú nhưng nó rất bền vững về mặt hóahọc, rất khó bị ôxi hóa hoặc khử. Chỉ có một số VSV có khả năng cố định nitơ mới có khả năngđồng hóa nitơ không khí. - Nitơ hữu cơ: cấu trúc chủ yếu là aa. Các aa có mặt trong môi trường thường không đượcVSV sử dụng trực tiếp mà phải tiến hành 2 loại phản ứng khử amin và khử cacboxyl. Nitơ hữucơ thường sử dụng: cao ngô, khô đậu tương, khô lạc, pepton, cao thịt, cao nấm men ... Muốnđồng hóa được các chất này VSV phải tiết vào môi trường hệ enzym protease để thủy phânprotein thành aa. - Nitơ vô cơ: thường sử dụng các muối amon: (NH 4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4,NH4H2PO4, NH4NO3 là nguồn nitơ mà tất cả các VSV đều có khả năng đồng hóa. Ure được dùng bổ sung nguồn nitơ và điều chỉnh pH môi trường, dưới tác dụng củaurease, ure phân huỷ thành CO2 và NH3. (NH2)2CO + H2 Urease 2NH3 + CO2 Trang 10
  11. 11. Nguồn nitrat VSV cũng không thể đồng hóa được mà phải trải qua quá trình biến đổidưới tác dụng của enzym nitratreductase để tạo thành sản phẩm cuối cùng là NH 3.3. Dinh dưỡng khoáng - Các hợp chất phospho: có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bàoVSV. Liên kết cao năng là nguồn cung cấp năng lượng sống khá lớn cho tế bào VSV (dạngADP, ATP). Ngoài ra phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzymđồng hóa nguồn cacbon. Nguồn phospho thường là các hợp chất phospho hữu cơ trong bột đậu, cao ngô, bã rượu,khô dầu... và các hợp chất phospho vô cơ, các muối phospho... Nhu cầu phospho của vi sinh vậtphụ thuộc vào từng chủng VSV, vào tỉ lệ thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Thôngthường tỉ lệ C : N : P trong môi trường phải cân đối thường = 100 : 10 : 1. - Các chất khoáng khác: Trong tế bào vi sinh vật có hàng loạt các chất khoáng khácnhau như magie, natri, sắt, nhôm, kali, liti, rumidi, mangan, chì... Vi sinh vật lấy chất khoáng từmôi trường dinh dưỡng, những chất khoáng này có thể có sẵn trong nước, trong các hợp chất cóchứa cacbon, nitơ nhưng cũng có khi phải bổ sung thêm vào môi trường.4. Các chất kích thích sinh trưởng Biotin, penicilin, acid béo và các chất hoạt động bề mặt, các aa như cystein, xistin,histidin, leuxin, VTM B1, các loại axit hưu cơ như acid citric, oxalic, tri hoặc tetra-polyphosphatđể ức chế sự phát triển của thực khuẩn thể. ..5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của VSV - Nước là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến tế bào VSV. Nó hòa tan các nguồndinh dưỡng để đưa vào cơ thể VSV. Nước chiếm 80-85% trọng lượng cơ thể. - Chất khô: Cao trên 60% hầu hết VSV không sinh trưởng và sinh sản được - Nhiệt độ: Các VSV thích nghi ở các điều kiện nhiệt độ tương đối đa dạng. Có chủng thìthích hợp ở nhiệt độ thấp 0 – 15oC, đại đa số nhiệt độ tối thích ở khoảng trung bình 25-37 OC cònlại thích nghi ở nhiệt độ cao 50-75OC. Bảng nhiệt độ tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV (oC) VSV Nhiệt độ tối thiểu Nhiệt độ tối thích Nhiệt độ tối đaVi khuẩn 8-10 30-35 40-45 Trang 11
  12. 12. Nấm mốc 7-10 33-37 40-43Nấm men 0,5-5 20-30 40-50 - pH: có ảnh hưởng rất lớn đến VSV Bảng pH tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV VSV pH tối thiểu pH tối thích pH tối đaVi khuẩn 4,0-4,7 6,0-6,5 7,9-8,5Nấm mốc 1,5 4,0-6,0 9,0-11,0Nấm men 3,0-3,5 4,5-6,0 8,5 - Oxy: là nguyên tố không thể thiếu đối với hoạt động sống. Trong công nghệ vi sinhchúng ta quan tâm đến nồng độ oxy tới hạn. Trong điều kiện sinh trưởng lượng oxy cần nhiềuhơn nồng độ oxy tới hạn. Khi nhiệt độ tăng hàm lượng oxy hòa tan giảm. Bảng qua hệ giữa nhiệt độ và nồng độ oxy hòa tan Nhiệt độ (OC) [O2] mg/l H2O 0 14,6 6 12,5 10 11,3 16 10 20 9,2 26 8,2 30 7,6 Nhu cầu về oxi của VSV và ảnh hưởng của nó đến quá trình lên men: - Oxi là một trong những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất. Oxi hòa tan trong nước được 9-10mg/l. Vì tế bào cần oxi để hô hấp nên cần cung cấp đều đặn, nếu thiếu oxi nhất thời hoặc ở khu vực nào đó sẽ phá vỡ sự trao đổi chất trong tế bào và phải cung cấp oxi sao cho tốc độ hòa tan oxi bằng tốc độ sử dụng oxi. Việc sục khí đảm bảo cung cấp oxi cho môi trường và cân bằng nhiệt độ lên men Trang 12
  13. 13. - Khi sử dụng cánh khuấy, oxi tiếp xúc với màng tế bào do đó cần sục khí sao cho áp suất bên ngoài lớn hơn áp suất bên trong tế bào. - Trong quá trình nuôi cấy không khí được nén vào thùng lên men, tốc độ cánh khuấy tăng dần làm thay đổi tốc độ hòa tan và có thể trộn đều các chất giúp VSV đồng hóa tốt hơn, có thể tách nhanh các sản phẩm trao đổi chất của tế bào vào môi trường - Tuy nhiên nếu khuấy quá mạnh sẽ phá vỡ tế bào. Thông thường phải tính toán chiều cao của cánh khuấy phù hợp với thùng lên men - Trong thời kỳ sinh trưởng, VSV cần oxi, cường độ bão hòa oxi trong môi trường phụ thuộc vào áp suất và nhiệt độ. Áp suất tăng đến 50KPa thì độ hòa tan của oxi tăng 10- 15%, khi nhiệt độ tăng thì độ hòa tan của oxi giảm. Độ hòa tan của oxi giảm khi trong môi trường có các chất dạng huyền phù. Trong môi trường có xác tế bào sẽ làm giảm độ hòa tan của oxi 85-90%. Nếu trong môi trường có những chất có khả năng khuếch tán bọt thì độ hòa tan oxi tăng. Nước biển (3-4% NaCl) hòa tan oxi kém nước ngọt 20%. CHƯƠNG III. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG CNSX PROTEIN, AXIT AMIN 1. Tảo Trong tự nhiên có nhiều loại tảo có hàm lượng protein cao nhưng ko sử dụng được chongười và gia súc vì chúng có độc tố. Ở Châu Phi người ta vớt tảo lam Spirulina maxima ở các aohồ giàu muối canxi làm thức ăn bồi bổ và dùng làm thuốc chữa một số bệnh như phù chân, đaurăng và các bệnh về đường tiêu hóa. Cho đến nay có 3 loại tảo đơn bào đuợc sản xuất trên quymô lớn và có hiệu quả kinh tế cao là: Chlorella, Spirulina và Scenedesmus. Ưu điểm của tảo đơn bào: - Giá trị dinh dưỡng cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi + Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô), riêng tảo Spirulina chiếm tới 70% chất khô. Trang 13
  14. 14. + Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo. Hàm lượng protein trong tảo gần với quy định protein tiêu chuẩn. Lượng aa không thay thế rất cao, có thể chiếm tới 42% tổng số aa. + Tảo chứa nhiều VTM như VTM A, B, C, K (đặc biệt là VTM A, B12 và VTM C) và chất lượng các VTM này rất tốt. Ngoài ra còn có axit aconitic, axit pantotenic, biotin, lecophorin. - Cho đến nay chưa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm trong các loại tảo trên. - Tảo có diệp lục nên chúng là loài tự dưỡng do chúng có khả năng quang hợp khác với các loài vi sinh vật khác. - Tảo có kích thước tế bào lớn, thuận lợi cho quá trình thu nhận cũng như số lượng sinh khối. - Không bị virus tấn công, môi trường nuôi cấy đơn giản. - Tảo có khả năng làm sạch các nguồn nước bẩn, giữ vệ sinh môi trường. Tảo lam còn tham gia quá trình cố định nitơ của không khí nhờ những tính chất đặc biệt của mình. 3. Mấm men Trong các nguồn protein sản xuất bằng VSV, nấm men được nghiên cứu sớm nhất vàđược ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Con người đã sử dụng nấm men hoặc các sản phẩm củachúng từ hàng ngàn năm nay. Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi.Nấm men không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng mà phải sử dụng các nguồn dinhdưỡng từ môi trường. Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết các chất cần thiết cho sự sống (protein, gluxit,lipit, các enzym, các VTM, axit nucleic và các chất khoáng). Nấm men được chú ý nhiều không chỉ vì giá trị dinh dưỡng mà còn vì khả năng tăng sinhkhối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp.Giá trị dinh dưỡng của nấm men: - Giàu protein và VTM đặc biệt là VTM nhóm B. Trang 14
  15. 15. - Sinh khối nấm men chứa khoảng 20-25% chất khô, trong đó cacbon chiếm 45-50%, nitơ 7-10%, hydro 5-7%, oxy 25-30%, các nguyên tố vô cơ 5-10%, ngoài ra còn một số nguyên tố vi lượng khác. - Hàm lượng protein tùy thuộc vào từng chủng nấm men và thành phần, điều kiện nuôi cấy dao động trong khoảng 40 - 60%. - Protein của nấm men gần giống protein của động vật, chứa khoảng 20aa cần thiết, thành phần aa của nấm men cân đối hơn so với lúa mì và các hạt ngũ cốc khác, kém chute ít so với sữa và bột cá, bột xương thịt và các sản phẩm động vật nói chung. - Các chủng nấm men thường được sử dụng cho người và gia súc là: Endomyces vernalis, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Turolopsis utilis, Monilia candia… - Các chủng nấm men dùng để sản xuất protein từ các nguồn hydrat cacbon cần có các tiêu chuẩn sau: + Có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khac nhau + Có thể phát triển tốt trên môi trường có nồng độ chất khử cao + Có khả năng phát triển nhanh, có sức đề khàng cao đối với nồng độ CO2 + Sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều aa không thay thế, có nhiều VTM quý…) + Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ dàng tách bằng ly tâm + Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường. + Trong sản xuất công nghiệp các giống nấm men thường được sử dụng là Saccharomyces, Candida, và Turolopsis vì khả năng chuyển hóa của 3 chủng này rất cao và đa dạng, quy trình công nghệ tương đối đơn giản. 3. Vi khuẩn Vi khuẩn để sản xuất protein thường được nuôi trên cacbua hydro. Các giống thườngđược sử dụng là: Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium và Nocardia. Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hóa các ankal (C6 – C18), cacbua hydro béovà thơn khác. Đối với nguyên liệu là metan, sử dụng giống Methylamonas, Methyllococens capsulatus. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn này: Trang 15
  16. 16. - Tốc độ sinh trưởng nhanh - Sử dụng được nhiều loại cơ chất - pH luôn giữ ở 5-7 để tránh nguy cơ nhiễm các vi khuẩn gây bệnh - Thành phần các aa cân đối - Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất protein cần lưu ý khả năng sinh độc tố củachúng.4. Nấm mốc và xạ khuẩn Nói chung nấm mốc và xạ khuẩn ít được dùng để sản xuất protein. Về mặt dinh dưỡngprotein của các VSV này kém hơn của tảo, nấm men và vi khuẩn. Về mặt kỹ thuật do hệ sợi pháttriển thành từng búi nên rất khó khăn cho quá trình khuấy trộn và sục khí. Nấm mốc là những cơ thể đa bào giàu VTM nhóm B, chứa khoảng 30-60% protein, hàmlượng methionin và tryptophan thấp, có các aa khác tương tự tiêu chuẩn của FAO. Các giốngnấm mốc có hàm lượng protein cao là: Fusarium, Rhizopus, Penicillium, Apspegillus. Cho đến nay xạ khuẩn chưa được dùng trong sản xuất protein. Tuy vậy người ta vẫnthường thu hệ sợi của xạ khuẩn và nấm mốc trong quá trình sản xuất thuốc kháng sinh(Penicillium), các enzym và axit xitric… dưới dạng sản phẩm phụ của nhà máy nhằm sử dụngprotein, VTM, enzym trong đó vào các mục đích khác nhau. Nhược điểm của sinh khối xạkhuẩn và nấm mốc thu theo phương pháp này là nhanh bị hư hỏng. Vì vậy phải chú ý khâu sấyngay sau khi tách sinh khối ra khỏi dây chuyền công nghệ. Trong công nghiệp kháng sinh ngườita có thể thu được từ sinh khối hệ sợi gần 17% các chất chứa nitơ trong số đó các chất chứa nitơđồng hóa khoảng 14%, gần 10% protein tiêu hóa, 2% chất béo, 2,5% chất xơ… để sử dụng trongchăn nuôi.CHƯƠNG IV: CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN SX PROTEIN, AXIT AMIN 1. Giống sản xuất 1.1. Tuyển chọn chủng Trang 16
  17. 17. - Phân lập: Để chọn được giồng VSV thuần chủng bước đầu phải tiến hành phân lập từ tựnhiên như đất, nước, không khí, các mô động, thực vật, các vật liệu vô cơ, hữu cơ đã bị phânhủy ít nhiều. - Tuyển chọn: Các chủng phân lập được gọi là chủng nguyên thủy, thường những chủngnày chưa đáp ứng được các yêu cầu cho sản xuất công nghiệp mà nó phải được tuyển chọn đểxác định các tính chất sinh lý, sinh hóa và các điều kiện lên men thích hợp để nó có hoạt tính caovà thực hiện được một quá trình lên men có ý nghĩa kinh tế Mục đích cuối cùng của quá trìnhphân lập và tuyển chọn là tìm được chủng giống tốt mang đi sản xuất trên quy mô công nghiệpgọi là giống VSV công nghiệp. VSV công nghiệp phải đạt được các yêu cầu sau: + Có khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao trong quá trình lên men. + Khả năng sử dụng nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền tức là trên những cơ chất này VSV vẫnphát triển nhanh, sản sinh một lượng lớn sinh khối một cách ổn định. + Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn được các đặc tính sinh hóa ban đầu. + Không độc với người, động vật, thực vật, môi trường (nếu có thì phải rất thấp và mấtnhanh ở môi trường ngoài) + Chủng phải thuần khiết + Dễ tách khỏi môi trường khi xử lý, thu sản phẩm + Có khả năng tạo biến chủng với hoạt lực cao hơn 1.2. Bảo quản giống 1.2.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ (giữ giống VSV trên môi trường thạch) - Nguyên lý: Nuôi VSV trên môi trường thạch dinh dưỡng sau đó một thời gian lại cấytruyền sang môi trường mới để đảm bảo luôn cung cấp dinh dưỡng cho VSV. - Phương pháp này phải định kỳ cấy truyền trên môi trường mới, mất nhiều công sức,thời gian và rất dễ dẫn đến thoái hóa giống hoặc mất hẳn tính chất ban đầu. Chất lượng môitrường thạch dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng phát triển của VSV. - Trong quá trình cấy truyền trên các môi trường giàu dinh dưỡng rất dễ bị nhiễm tạp vàochủng giống làm giống bị giảm hoặc mất hẳn hoạt lực, khả năng sinh trưởng kém hoặc có thể bịtiêu diệt hoàn toàn gây ra tình trang mất giống. 1.2.2. Giữ giống trên môi trường thách dưới lớp dầu khoáng Trang 17
  18. 18. Giống được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng ở điều kiện tối ưu để thu được VSVđang ở giai đoạn phát triển logarit hoặc thu được nhiều bào tử đã đạt tới thời kỳ chín (đối vớiloại có bào tử). Những ống nghiệm đó được phủ một lớp dầu parafin dày khoảng 10mm. Lớpdầu này làm cho nước không bị bay hơi nên nồng độ các chất hòa tan không thay đổi dẫn đến áplực thẩm thấu cũng không thay đổi, không gây ảnh hưởng đến đời sống của VSV. Mặt khác lớpdầu chỉ cho phép oxy xủa không khí thấm rất chậm vào môi trường nên VSV trong môi trườngphát triển rất chậm nên khi cấy truyền chủng giống không kéo theo sự phá hủy chủng nguyênthủy. Sau khi xử lý như trên chủng được giữ ở 5oC có thể bảo quản được nhiều năm. 1.2.3. Giữ giống trên môi trường đất, cát Đây là phương pháp bảo quản bào tử trong cát khô. Cát sông, rử sạch, sấy khô, sàng quarây lỗ nhỏ ssể loại bỏ đất và rác bẩn. Có thể dùng HCl đặc để loại bảo các chất hữu cơ. Đổ axitngập cát, đun nóng ở 100oC rồi rửa bằng nước. Nếu chưa sạch axit thì phải trung hòa bằng kiềmhoặc Na2CO3. Sau khi trung hòa rửa lại bằng nước. Sấy khô ở 120 oC trong 3 – 4 giờ. Chia cátvào các ống nghiệm thủy tình đã sấy tiệt trùng ở 160 – 180 oC trong 2 – 3 giờ. Dùng que cấy càobào tử vào cát, lắc đều. Chỉ bảo quản các ống cáct chứa bào tử khô, không bị ướt, không bị vóncục. Tiếp tục sấy khô trong các bình CaCl2 hoặc silicagen khoảng 1 tuần hoặc sấy ở 37oC trong 2ngày. Đậy các ống giống này bằng nút bông tráng parafin và giữ ở nhiệt độ phòng hoặc 4 – 6 oC.Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống cấy vào các ống thạch nghiêng sau đóchọn lại và cấy truyền tiếp. 1.2.4. Phương pháp lạnh đông Tiến hành làm lạnh các môi trường có giống phát triển và giữ ở nhiệt độ lạnh sâu (-15đến -20oC), (-20 đến -30oC), (-30 ddeens -40oC) ... Trong qúa trình làm lạnh sâu tế bào VSV cóthể bị chết. Để khắc phục trạng thái này người ta phải tiến hànhnhũ hóa môi trường và chú ý tốcđộ làm lạnh. Trong quá trình lạnh đông cần chú ý các điểm sau: - Trước khi làm lạnh cần nhũ hóa VSV - Cho 1 – 2 % nhũ dịch VSV vào mỗi ống nghiệm để đảm bảo làmlạnh đều - Khi làm lạnh tới -20oC hoặc thấp hơn phải giữ tốc độ làm lạnh không lớn hơn 1 –2oC/phút. Trang 18
  19. 19. - Giữ các chủng lạnh đông phải quy định thời gian cấy truyền. Ở -15 đến -20 oC: 6 tháng,ở -30oC: 6 – 9 tháng, ở -40oC: 1 năm, ở -50 đến -60oC: 3 năm. - Khi làm tan băng để phục hồi giống cần phải rất nhanh bằng cách đặt ống giống trongnồi cách thủy 37oC. Không nên làm đông lạnh hoặc làm tan băng quá nhiều lần vì nó làm giảmkhả năng sống của chủng đã bảo quản. Để tăng khả năng sông sót của chunge bảo quản, trongquá trình thao tác người ta thêm những keo bảo vệ và các hỗn dịch như sữa, huyết thanh, lòngtrắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường. 1.2.5. Phương pháp đông khô Bảo quản đông khô: làm mất hơi nước của môi trường nuôi cấy. Thường VSV được nuôitrên môi trường lỏng, sau đó đưa vào thiết bị đông khô làm mất dần hơi nước của môi trường.Quá trình diễn ra cho đến khi toàn bộ môi trường chứa VSV tạo thành rạng bột khô thì mang đibảo quản trong tủ lạnh từ -20 đến -80oC. Đây là phương pháp tốt nhất bảo quản được rất lâu màkhông làm chết VSV. 1.2.6. Bảo quản siêu lạnh Giữ giống trong hydro lỏng, nitơ lỏng (hay sử dụng bảo quản tế bào động, thực vật) 1.3. Nhân giống Mục đích của quá trình này là đủ giống cho sản xuất (cả về lượng và chất), giống phải cóhoạt tính, khỏ mạnh, thuần khiết và có đúng thời điểm ta cần. Các bước nhân giống thường qua 3 giai đoạn: - Giống bảo quản được mang nhân trong ống nghiệm. Đây là giai đoạn phục hồi lạigiống, yêu cầu môi trường thuần khiết để giống có thể hoạt động trao đổi chất tốt nhất. - Nhân giống cấp 2: đây là giai đoạn trung gian, giống làm quen dần với môi trường sảnxuất và đạt được mức độ nhân nhanh. - Nhân giống sản xuất: giống quen với môi trường sản xuất, số lượng và chất lượng giốngđảm bảo để khi đưa vào sản xuất rút ngắn tối đa làm quen mà đi ngay vào pha phát triển để rútngắn thời gian lên men đảm bảo chất lượng sản phẩm cũng như hiệu quả kinh tế. Thường sử dụng tỉ lệ cấp giống 5 – 10%. 2. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men 2.1. Môi trường Trang 19
  20. 20. 2.1.1. Chuẩn bị môi trường - Phải phù hợp với sự phát triển và yêu cầu sinh lý của chủng VSV. Môi trường phải cóđầy đủ các nguồn thức ăn: C, N, K, S, P, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinhtrưởng ... - Phải đảm bảo các chỉ tiêu về kinh tế - Đảm bảo cho sự phát triển ổn định của chủng (vô khuẩn) - Tùy thuộc môi trường lên men rắn hay lỏng, thành phần môi trường lên men mà tiếnhành pha chế môi trường sao cho phù hợp với từng loại VSV. 2.1.2. Thanh trùng môi trường Có một số phương pháp thanh trùng môi trường như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụngtia năng lượng (cực tím) khả năng đâm xuyên kém nên khi gặp môi trường huyền phù khả năngbị hạn chế, sử dụng nhiệt độ cao và phương pháp lọc. Thông thường người ta hay sử dụng 2phương pháp cuối. - Phương pháp nhiệt độ cao: + Phương pháp gián đoạn: 110 – 121 oC (chủ yếu ở 121oC) trong 15 phút, Pa = 1 at, gianhiệt từng giai đoạn. Thường sử dụng cho thể tích nhỏ. + Phương pháp liên tục: 137 – 145oC, Pa = 5 – 6 at trong 3 – 5 phút, có ưu điểm tiết kiệmthời gian, bảo đảm được tính chất của sản phẩm do giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao, cóthể tự động hóa và độ thuần nhất của môi trường cao. Sử dụng cho thể tích lớn. Khi thanh trùng ở nhiệt độ cao chất lượng môi trường bị biến đổi như: làm biến tínhprotein và ức chế enzym, phá hủy một số VTM và một số tác nhân khác, trong quá trình gianhiệt kéo theo sự trùng hợp của một số thành phần làm môi trường có màu nâu (do caramen hóacác loại đường, oxi hóa các fenol và VTM C, trùng hợp các aldehyt chưa no, phản ứng giữanhóm aldehyt của đường và nhóm amin của aa trong các peptit và protein nên người ta có xuhướng thanh trùng riêng rẽ sau đó phối trộn lại sau. 2.2. Thiết bị lên men Thiết bị lên men gồm thùng lên men (hoặc phòng nuôi) và các thiết bị phụ trợ. Trước khilên men tất cả đều phải được khử khuẩn với tiêu chuẩn phụ thuộc vào yêu cầu sản xuất và yêucầu công nghệ. Trang 20
  21. 21. * Phòng nuôi: Sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn mạnh như CaCl 2, ... đặc biệt cácphương pháp có khả năng bay hơi như phương pháp xông hơi (ethylen dioxit), đối với nhữngphòng nuôi hẹp có thể xử lý bằng tia tử ngoại (trong điều kiện công nghiệp không thể sử dungphương pháp này). * Các thiết bị lên men: - Các quá trình lên men đòi hỏi rất nghiêm ngặt độ vô khuẩn, số VK < 10 -3 đến 10-4TB/ml. Thường sử dụng hơi quá nhiệt 3 – 4 at, 2- 3 giờ. - Các quá trình lên men không đòi hỏi quá nghiêm ngặt người ta có thể sử dụng 2 phươngpháp: + Các chất có khả năng oxi hóa + các chất sát khuẩn (CIP-Thanh trùng tại chỗ) tiến hànhnhư sau: Rửa nước, khô, rửa bằng axit hoặc bazơ 2,5 – 4%, 70 oC, 25 – 30 phút, khô 5 phút, rửlại bằng axit 2 – 4%, khô tự nhiên, tráng lại bằng nước để chảy tự nhiên, rử bằng chất sát khuẩn,để khô, sử dụng + Phương pháp xông hơi: đốt lưu huỳnh tạo ra hơi SO2 * Thiết bị phụ trợ: Khi thanh trùng các thiết bị phụ trợ cũng phải đạt chất lượng tươngứng với thiết bị lên men. Vô khuẩn các thiết bị này khó hơn thùng lên men vì vậy người tathường sử dung kết hợp phương pháp xông hơi và hơi quá nhiệt. 2.3. Khử khuẩn không khí Do hàm lượng oxi trong không khí và nước rất thấp mà hàm lượng oxi cần cung cấp choVSV rất nhiều nên cần sục một lượng không khí rất lớn cho quá trình lên men. Vì vậy phải tiếnhành khử khuẩn không khí để sử dụng. Người ta thường dùng phương pháp nén cao áp bằng nén2 cấp đoạn nhiệt với áp suất 8 – 9 at/210 – 230 oC/2-3 giây. Với phương pháp này hầu như tất cảVSV bị tiêu diệt nhưng sau đó chứa vào thùng chứa nên khi sử dụng phải kết hợp lọc bằng cácvật liệu lọc tạo ra những khe hẹp (mao quản) chịu rất nhiều tác đọng khác nhau nếu giữ đượcVSV gọi là cơ chế chắn cản. Trong công nghiệp thường dùng bông thủy tinh (đường kính sợi 5– 10 µm) hoặc sứ xốp (đường kính sợi > 10 µm). Nếu quãng đường đi đủ lớn (700 – 1000 mm)và vận tốc nhỏ (<200 m/s) có khả năng chắn cản hầu hết VSV. Ngoài ra người ta còn có thể sửdụng đồng xốp hoặc vật liệu siêu lọc (giá thành đắt) nên chỉ sử dụng được cho thiết bị lên mennhỏ. Điều cần chú ý là các vật liệu lọc phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nên không được phép Trang 21
  22. 22. để phên lọc bị ẩm, nếu ẩm sẽ bị bết khối lọc dẫn đến phá hỏng phên lọc tạo ra những dòng chảy.Vì vậy nếu xảy ra hiện tượng giảm áp đột ngột phải thay toàn bộ thiết bị lọc. 3. Quá trình lên men Là giai đoạn nuôi VSV tạo sinh khối, đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của cả quátrình sản xuất. 3.1. Lên men bề mặt - Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trườnglỏng hoặc rắn + Thiết bị lên men là những khay dày 2-5 cm (tăng diện tích bề mặt) + Vi sinh vật hiếu khí (môi trường lỏng), VSV hiếu khí hoặc kỵ khí (MT rắn) + Môi trường lỏng là những nguồn dinh dưỡng khác nhau phù hợp với từng loài VSV(dịch đường hóa, nước bã rượu, dịch kiềm sunfit, bổ sung các muối khoáng...). Môi trường rắnthường là các loại hạt như gạo, đậu tương, mảnh sắn, ngô, bã mía, bã rượu, trấu, rơm... Đối vớimôi trường rắn yêu cầu độ ẩm 55-70%, chiều dày môi trường 2-3cm, có hệ thống quạt thổi khívô trùng. Buồng lên men cần điều hòa không khí, làm ẩm và loại CO2. + Ưu điểm: Đơn giản, dễ loại bỏ phần nhiễm cục bộ, ít tốn kém đầu tư thiết bị + Nhược điểm: Tốn diện tích nhà xưởng, tốn nhân công, khó cơ giới hóa, tự động hóa,hiệu suất thấp. 3.2. Lên men chìm - Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trên môi trường dịch thể, chúng phát triểntheo chiều sâu môi trường. + Sử dụng cho VSV hiếu khí và kỵ khí + Trong quá trình lên men phải khuấy đảo và sục khí (đối với VSV hiếu khí) nhằm tăngcường diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, ngăn cản sự kết lắng của tế bào. + Trong quá trình lên men phải theo dõi sự tạo bọt khi tiến hành khuấy và sục khí mạnhsẽ tạo nhiều bọt có khuynh hướng trào ra ngoài gây hỏng thiết bị và nhiễm VSV ko mong muốncho quá trình lên men. Bọt còn cản trở sự tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng.Thường sử dụng các loại dầu thực vật để phá bọt. Trong quá trình lên men luôn phải theo dõi vàđiều chỉnh pH, nhiệt độ của thùng lên men. Trang 22
  23. 23. + Ưu điểm: Hiệu suất cao, ít tốn diện tích, dễ cơ giới hóa, ít tốn nhân công. + Nhược điểm: Đòi hỏi đầu tư thiết bị chất lượng cao, dễ bị nhiễm hàng loạt, đòi hỏi đảmbảo vo trùng nghiêm ngặt, cần sục khí liên tục nên tốn năng lượng, tốn nhiều hơi vô trùng thiếtbị, cần nguồn nhân lực có trình độ cao. 4. Quá trình lên men chìm 4.1. Lên men gián đoạn - Ưu điểm: Thông dụng, dễ vận hành và duy trì, giá thành lắp đặt thấp, sử dụng một môi trường, khả năng nhiễm thấp. - Nhược điểm: Thời gian làm quen lớn, hiệu suất thấp, giá thành cao, sản phẩm phụ ức chế sản phẩm tạo thành, khó đáp ứng cấp oxy 1 cách tuyệt đối 2.2. Lên men liên tục - Ưu điểm: Hiệu suất cao do bỏ qua được giai đoạn làm quen, giảm nhiều công vận hành, môi trường duy trì ở tốc độ phát triển ổn định, phát triển cân bằng: thành phần môi trường không đổi, hiệu suất ổn định. - Nhược điểm: Khả năng bị nhiểm cao, đòi hỏi các thiết bị xác định nồng độ oxy, pH nhậy, điều khiển quá trình khó. 2.3. Lên men bán liên tục (lên men 2 pha) - Pha 1: Sinh trưởng và phát triển + Giai đoạn 1: Tiềm ẩn + Giai đoạn 2: Thích ứng + Giai đoạn 3: Phát triển lũy tiến Pha 2: Tích tụ sản phẩm trao đổi chất + Giai đoạn 4: Phát triển chậm dần + Giai đoạn 5: Cân bằng + Giai đoạn 6: Suy thoái (ở giai đoạn này VSV tự phân (chết) ảnh hưởng đến kết quả quátrình thu sản phẩm Để quá trình lên men xảy ra nhanh cần làm tăng vận tốc giai đoạn 1 và 2 bằng cách đảmbảo khả năng sẵn sàng sinh trưởng, sinh sản, phát triển và đảm bảo điều kiện môi trường dinh Trang 23
  24. 24. dưỡng pH, nhiệt độ, nồng độ chất tan. VSV đưa vào lên men phải ở giai đoạn lũy tiến của phanhân giống. Đồng thời kéo dài gian đoạn 3 bằng cách bổ sung thường xuyên chất dinh dưỡng(lên men liên tục). 5. Khuấy trộn, sục khí Trong quá trình lên men hiếu khí nhất thiết phải có khuấy trộn và sục khí giúp trao đổinhiệt, cấp oxi và tạo sự tiếp xúc tốt giữa VSV và nguồn thức ăn. Khi khuấy tạo đối lưu cưỡngbức giúp quá trình trao đổi nhiệt tốt hơn Khi dùng cách khuấy nghiêng ngoài dòng tiếp tuyến còn có dòng hướng trục cắt nhau tạochảy rối nên tăng cường tiếp xúc pha và trao đổi nhiệt. Thời gian trao đổi nhiệt ngắn dẫn đếnnăng suất và hiệu suất sử dụng thiết bị tăng, tăng cường tiếp xúc pha tức là các enzym α, β, γ –amilase hòa tan trong nước tiếp xúc với cơ chất mạnh, đồng thời VSV cũng tiếp xúc rất tốt vớinguồn thức ăn. Đối với sinh khối người ta lại dùng khuấy tuốc bin, dòng chính là dòng hướng tâm, dòngphụ là dòng hướng trục, lưu lượng của 2 dòng bằng nhau. Do sinh khối luôn cần một lượng oximà khuấy cánh khả năng khuếch tán oxi kém trong khi khuấy tuốc bin khi chất lỏng văng ra ápsuất bên trong thấp, khí đi vào rất dễ hòa tan với nhau. Chiều cao của thiết bị sinh khối rất caonên dễ bị hỏng trục. Khuấy tuốc bin rất mạnh và dễ dàng làm nhiều tầng khuấy. Ngoài ra, chấtkhí có xu hướng đi từ dưới lên nếu khuấy cánh khí sẽ đi thẳng lên trên nhưng nếu dùng khuấytuốc bin nhiều tầng thì tầng này sẽ hút khí của tầng dưới nó. Tuy nhiên khuấy tuốc bin có nhượcđiểm là nếu khuấy quá mạnh dịch lên men sẽ trào ra ngoài hết nên phải tính toán tốc độ khuấysao cho phù hợp với từng thiết bị lên men khác nhau. Trong quá trình lên men tạo sinh khối luôn cần sục khí do khi VSV phát triển thì thức ănxung quanh nó giảm mà dinh dưỡng phải khuếch tán vào tự nhiên rất chậm nên phải tạo chảy rốiđể tế bào VSv di chuyển để tiếp xúc pha. Bọt khí chỉ chảy từ dưới lên trên tạo chảy rối, tạođường đi rích rắc nên tiếp xúc tốt hơn, các chất dinh dưỡng hòa tan nhanh hơn. 5. Kiểm tra và giám sát quá trình lên men Trong quá trình lên men cần kiểm tra, giám sát các chỉ tiêu sau: - Cường độ khuấy - Cấp khí:nồng độ oxi, nhiệt lượng Q của quá trình cấp khí Trang 24
  25. 25. - Giám sát quá trình tạo bọt: Nếu lượng bọt tăng thể tích hiệu dụng của thiết bị giảm gâytràn làm tổn hao và bịt kín hệ thống làm tắc đường ống và tạo cầu nối từ bên ngoài vào bêntrong nên rất dễ bị nhiễm. Giải pháp khống chế là dùng dầu phá bọt (thường sử dụng các loạidầu thực vật), có thể giảm cường độ khuấy hoặc chọn chủng không phụ thuộc nghiêm ngặt vàonồng độ oxi. Chất phá bọt là chất không tham gia quá trình lên men, không đưavào lượng dư vìsẽ ức chế chủng và làm thay đổi quá trình lên men. Đồng thời nếu đưa dư lượng dầu phá bọt thìquá trình tinh chế sẽ vô cùng phức tạp. - Thể tích lên men (phụ thuộc vào nồng độ thông khí) - Thành phần dịch vào gồm tất cả các cấu tử, kiểm tra nồng độ vf sự biến thiên nồng độoxi, CO2, pH, thế oxi hóa khử. - Kiểm tra đầu ra: sản phẩm, thành phần của khí thải ... 6. Chiết tách, tinh chế các sản phẩm lên men Hòa tan protein trong dung dịch: Khả năng hòa tan protein trong dung dịch có thể được hỗ trợ bằng cách thay đổi các yếutố hóa học hoặc sử dụng enzym. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của enzym baogồm: lực ion, pH, nhiệt độ và nồng độ ion Ca 2+. Tại pI, protein trung hòa về điện tích nên độ hòatan của chúng nhỏ nhất. Để hòa tan thông thường giá trị pH được chọn là kiềm nhẹ do tại đó độhòa tan của protein lớn nhất và môi trường gần trung tính nên nguy cơ biến tính protein nhỏnhất. Lực ion thông thường được thay đổi tại pH trung tính hoặc xung quanh pI nhờ việc sửdụng các muối tan. Tại các lực ion quá cao hoặc quá thấp độ tan của protein giảm. Việc hòa tanprotein nên thực hiện ở nhiệt độ thấp để giảm nguy cơ biến tính protein và nguy cơ mẫu bị pháhủy bởi VSV. Tuy nhiên nếu protein cần tách có khả năng chịu nhiệt tốt thì nên chiết chúng ởnhiệt độ cao để hạn chế các chất không mong muốn hòa tan trong dung dịch và nâng cao hiệuquả thu nhận protein. Việc lựa chọn các yếu tố này luôn gắn liền với phương pháp thu nhậnprotein tương ứng. Việc sử dụng các enzym trong quá trình hòa tan protein khá hạn chế doenzym phá vỡ các liên kết ngoại phân tử của protein tạo ra sự hòa tan khá dễ của protein vàthường kèm theo việc hòa tan trong dung dịch nhiều hợp chất khác gây khó khăn cho quá trìnhchiết tách sau này.6.1. Tách protein: Trang 25
  26. 26. - Kết tủa protein trong pha lỏng và tách kết tủa khỏi pha lỏng + Kết tủa nhờ muối: là phương pháp thông thường nhất trong các phương pháp kết tủa.Thông thường nồng độ muối thấp làm tăng mức độ hòa tan protein do protein được bao bọc bởilớp vỏ ion trái dấu với muối, năng lượng tĩnh điện tự do của protein giảm, hoạt tính dung môităng. Ngược lại khi tăng nồng độ muối làm giảm lực hydrat hóa các ion làm giảm độ hòa tan củaprotein dẫn tới kết tủa protein. Ở cùng một nồng độ muối các protein khác nhau có độ hòa tankhác nhau vì vậy với mỗi một protein phải sử dụng nồng độ muối khác nhau để kết tủa (phươngpháp kết tủa phân đoạn). + Kết tủa nhờ dung môi: Dung môi hữu cơ trung tính khi trộn lẫn với dung dịch enzymlàm giảm hằng số điện môi của dung dịch, vì vậy làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tửprotein làm các phân tử protein kết hợp lại tạo thành kết tủa. Cần chú ý dung môi là tác nhângây biến tính protein do chúng có ái lực với bề mặt kỵ nước của protein vì vậy cần giữ nồng độdung môi thấp. Các dung môi thường sử dụng là ethanol, aceton. + Kết tủa đẳng điện: Protein bị biến tính bởi các tác nhân như acid, nhiệt độ, ethanol... cóthể kết tủa hoàn toàn tại giá trị pI của chúng. Việc lựa chọn tác nhân biến tính protein cần tínhđến khả năng biến tính thuận nghịch hay không của protein cần thu nhận. Đặc biệt trong trườnghợp protein cần thu nhận là protein có hoạt tính sinh học, không áp dụng được các tác nhân biếntính không thuận nghịch như nhiệt độ do sự biến tính làm mất hoạt tính của chúng. + Kết tủa bằng enzym: Các enzym có thể sử dụng kết tủa protein có khả năng tạo cầungoại phân tử giữa chúng làm kết tụ các khối protein. (Ví dụ như enzym đông tụ sữa)6.2. Tinh sạch protein Dựa vào các tính chất của protein như tính phân ly đẳng điện, tính chất bề mặt (protein cóthể hấp thụ, hấp phụ trên các chất mang khác nhau nhờ đó protein có thể được phân tách nhờ sắcký ái lực), kích thước phân tử . Thông thường sử dụng các kỹ thuật sau:6.3.1. Kỹ thuật lọc: Protein là cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein sử dụng màng lọc phântử khá hữu hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ sử dụng được đối với các nguồn proteinđộng vật trong dung dịch sinh lý như sữa, máu, huyết thanh mà không áp dụng được với cácprotein thực vật do chúng thường nằm trong phức hợp polyme khác. Kỹ thuật này được thực Trang 26
  27. 27. hiện nhờ một màng bán thấm hoặc màng lọc phân tử. Dung dịch protein được phân làm 2 pha,một pha không đi qua màng lọc chứa các cao phân tử trong đó có protein, pha còn lại đi quamàng lọc chứa các phân tử có kích thước nhỏ hơn như glucid đơn giản, peptid, muối...6.3.2. Kỹ thuật sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thíchhợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc địnhlượng và định danh. Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất làsắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổiion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực củaphân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kíchthước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquidchromagraphy). - Sắc ký lọc gel: Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thướcphân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tannhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) haypolyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường cósẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cảbên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vìvậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử cókích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa;còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. - Sắc ký trao đổi ion: Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều cómang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểmpH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc kýtrao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định,những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể,nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi làsắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, Trang 27
  28. 28. nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi làsắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùngdấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thíchnhững protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử proteintương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natriclorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với cácprotein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích rangoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. - Sắc ký ái lực: Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trongviệc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóahọc chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi choqua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởivì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A cóthể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trongdung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột. Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, nhữngprotein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự ADN. Hỗn hợpprotein thấm qua cột có chứa những trình tự ADN đặc hiệu được gắn vào thể mang; nhữngprotein có ái lực cao với trình tự ADN sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này,yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoàira, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch khángnguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn cókhả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất củanó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loạibỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch Xvới nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháptinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein cóđộ chuyên biệt cao. Trang 28
  29. 29. - Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắcký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã cósự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách đượctăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lêncột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.6.3. Đánh giá quá trình tinh sạch protein Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạttính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình cácprotein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di. Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này, được đặttên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khácnhư ADN và ARN. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điệntrường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f) Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độnhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động với môi trường. Lực ma sát phụthuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tử đang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường.Với một khối cầu có bán kính là r, ta có Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống nhưmột cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thểdi chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không dichuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khácnhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòngđiện từ trên xuống CHƯƠNG V: CNSX MỘT SỐ PROTEIN ĐƠN BÀO1. CNSX protein nấm men từ rỉ đường1.1. Giống nấm men Nấm men bánh mì là một trong những sản phẩm lâu đời nhất của ngành công nghệ lênmen. Cho đến nay nấm men bánh mì vẫn là sản phẩm quan trọng của ngành công nghệ sinh học Trang 29
  30. 30. cả về số lượng và chất lượng. Nấm men bánh mì thuộc họ Endomycetaceae, giốngSacharomyces, loài cereviciae. Sacharomyces cerevisiae là loài nấm men có hình cầu hay hình trứng, kích thước nhỏ từ5 – 14 µm. Thành phần tế bào nấm men thường chứa 70 – 75% nước, còn lại là chất khô. Đây làloài chủ yếu sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, trong quá trình sinh sản chồi mới phát triển từman mẹ khi có các điều kiện thích hợp, khi chồi đạt kích thước của men trưởng thành thì nó táchra khỏi nem mẹ để tạo thành một tế bào mới hoàn chỉnh. Ngoài nấm men Sacharomyces cerevisiae thì hiện nay trên thế giới còn sử dụng phổ biến2 loài nấm men nữa để sản xuất protein từ rỉ đường là Turolopsis utilis và Candida tropicalis. Đặc điểm của nấm men dùng trong sản xuất: - Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng - Hoạt lực maltase: biểu thị thời gian 1g nấm men ép phóng thích ra 10 ml CO 2 khi lênmen 20 ml dung dịch đường maltose 5%: ≤ 70 phút. - Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm mrn ép làm nở khối bột 280g đến chiềucao 1,5 cm theo khuôn có kích thước xác định: ≤ 45 phút. - Bền vững với rỉ đường: chủng nấm men được đánh giá là bền vững với rỉ đường nếuchúng tồn tại 6 – 7 thế hệ mà không bị chết trong môi trường có nồng độ rỉ đường cao. - Khả năng sinh sản nhanh, ít bị thay đổi trong quá trình bảo quản. - Có khả năng lên men được đường sacharose, glucose, maltose. Có hàm lượng zimase và maltase cao (hoạt lực maltase và hoạt lực làm dậy bột nhanh). - Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao,có nhiều aa không thay thế, có nhiều VTM quý…) - Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường.1.2. Nguyên liệu1.2.1. Rỉ đường Rỉ đường là phế thải của nhà máy đường, được dùng làm nguồn nguyên liệu sản xuất trên90% số lượng nấm men. Rỉ đường là phần không thể kết tinh sau khi đường saccaroza đã đượckết tinh. Có 2 loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Rỉ đường mía là chất lỏng màu đen Trang 30
  31. 31. có độ nhớt cao, chiếm 3,5% lượng mía, được sử dụng nhiều (90% protein từ nấm men được sảnxuất bằng nguyên liệu rỉ đường) do: - Giá thành rẻ - Ngoài đường saccharoza, glucoza, fructoza rỉ đường còn chứa một số chất hữu cơ, vôcơ và VTM có giá trị. Thành phần của rỉ đường Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cảiĐường tổng (%) 48-56 48-52Đường khử (%) 25-30 0,8-1Các hợp chất hữu cơ không 9-12 12-17phải đường (%)Protein (%) 2-4 6-10Kali (%) 1,5-5 2-7Canxi (%) 0,4-0,8 0,1-0,5Magie (%) 0,06 0,09Phospho (%) 0,6-2 0,02-0,7Biotin (mg/kg) 1-3 0,02-0,15Axit pantothenic (mg/kg) 15-55 50-110Inositol (mg/kg) 2.500-6.000 5.000-8.000Thiamin (mg/kg) 1,8 1,3Vi sinh vật trong rỉ đường: - Nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic, axetic: độ nhiẽm được đánh giá bằng độ chua của rỉ đường. - Rỉ đường tự lên men sau 24 giờ có thể làm tăng độ axit lên 0,2-0,3 độ - Trong 1g mật rỉ có chứa 100.000 VSV không có bào tử và 15.000 VSV có bào tử. - Nếu mật rỉ loãng VSV có thể hoạt động, cần hạn chế nhiễm khuẩn để giảm tổn thấtXử lý rỉ đường: Mục đích: Loại bỏ tạp chất, tạp khuẩn, nâng cao độ thuần khiết (giảm 20% các tạp chấtphi đường, giảm 40-60% chất keo) và tạo pH thích hợp. Pha loãng sơ bộ: Có thể pha loãng đến 55-60 độ Bx (tương ứng tỉ lệ khoảng 1:1 đến 1:4).Hệ số pha loãng càng lớn càng dễ dàng loại cặn. Trang 31
  32. 32. Có 3 phương pháp xử lý: Phương pháp hóa học: dùng axit H2SO4 kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ chấtkeo, đồng thời H2 SO4 còn liên kết với muối có trong rỉ đường cạnh tranh với axit hữu cơ làmgiảm một số muối bằng cách điều chỉnh pH xuống 3,5-5 rồi để lắng từ 4-8 giờ. Pha loãng rỉđường (0,73m3 nước cho 1 tấn rỉ đường), thêm CaCl2 (0,9 kg vôi/1 tấn rỉ đường), khuấy trộntrong 30 phút, để yên 30 phút. Thêm 6 lít H 2SO4/1 tấn rỉ đường, tiếp tục khuấy 30 phút sau đó đểlắng từ 6 – 12 giờ. Dùng bơm hút dịch trong bên trên, thêm 1% vôi tôi (tính theo nồng độ rỉđường), khuấy đều, đun sôi 10 phút, để lắng 7 giờ, loại bỏ lớp màu đen ở đáy bồn, bơm phầntrên vào bồn chứa khác. Phương pháp vật lý (gia nhiệt): phương pháp này tiết kiệm được axit nhưng tốn điệnnăng. Sau khi pha loãng sơ bộ tiến hành thổi hơi nước để dịch sôi từ 0,5-1 giờ. Sau đó để lắng 4-8 giờ rồi gạn lấy dịch đường trong. Chú ý thông thường sử dụng nhiệt độ 85-90 oC trong 45 phútvì nếu xử lý ở nhiệt độ cao 120-130oC thì dễ tạo melenoidin Phương pháp cơ học: Dùng máy ly tâm loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn phươngpháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa họckhoảng gần 2% (từ 2% xuống còn 0,14%). Trước khi ly tâm pha loãng rỉ đường với nước theo tỉlệ 1:1, 1:2, 1:4 tùy thuộc thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉđường < 0,5% thì pha loãng 1:1, nếu bằng 0,6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4.Xử lý rỉ đường xấu: Đối với rỉ đường xấu tùy yếu tố ảnh hưởng mà đưa ra các phương pháp xửlý như sau: Yếu tố ảnh hưởng Phương pháp và thời gian xử lýRỉ đường chứa vi Bổ sung chlotetracylin 1-5g/m3 dung dịch rỉ đường pha loãng đểkhuẩn tạo acid nitric làm trong, thời gian 1 giờRỉ đường có SO2 Bổ sung clo 11g/110g SO2 trong 1 giờAcid bay hơi cao Dùng H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đườngĐộ màu cao Pha loãng ít nhất 20 lầnCanxi cao ≥ 1% Pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:3, hạ pH đến 4,5, để lắng 4 giờ, ly tâm loại tủa.1.2.2. Một số nguyên liệu khác Trang 32
  33. 33. - Sunphat amon (NH4)2SO4: Là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩmkhông quá 1,5%. Vì sunphat amon thường được sản xuất từ acid sunfuric có thể còn lẫn FeS vàFe2(SO4)3 độc đối với tế bào nấm men nên trước khi đưa vào sản xuất thì để trong không khí khô4 giờ.- Dung dịch amoniac: Dùng để chỉnh pH và cung cấp nguồn nitơ cho nấm men (chứa 25%nitơ)- Axid phosphoric: Cung cấp nguồn phospho, nồng độ không ít hơn 70%, có thể thay thế DAP(chứa P2O5 hơn 50,5%)- MgSO4: Loại kỹ thuật, dễ tan trong nước, lượng MgO < 16,3%- H2SO4: Dùng để acid hóa môi trường- Các hóa chất chống nhiễm: CaCl2, formalin, NaOH Để khử trùng thiết bị và đường ống- Nước: Nước dùng để nuôi nấm men thường là nước mềm, sạch, trong, không màu, không mùihàm lượng các muối không cao hơn Cl - = 0,5, SO42- = 80, As = 0,05, Pb = 0,1, Zn = 5, Cu = 3,FeO = 3.- Dầu phá bọt: Có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt dung dịch. Có thể dùng acid oleic, dầulạc, dầu cám, dầu thầu dầu nồng độ 0,005 – 0,01%.- Không khí: Lượng không khí dùng trong các nhà máy sản xuất nấm men rất lớn. Tuy nhiêncần làm sạch không khí trước khi đưa vào sản xuất.1.3. Qui trình công nghệ Trang 33
  34. 34. Rỉ đường Thùng tạm chứa Pha loãng Axit hóa = H2SO4, 60oC, pH = 4,5-4,8 Thanh trùng Các muối vô cơ Môi trường dinh dưỡng Men giống Oxi Nuôi thu sinh khối Nhân giống Ly tâm Xử lý Thải bỏ Sữa men đặc Sấy khô Thành phẩm1.3.1. Nhân giống nấm men - Giai đoạn phòng thí nghiệm: tỉ lệ 1:10, từ 4 ống nghiệm giống hòa ra 100ml môi trường, rồi tiếp tục từ 100ml lại được nuôi trong 1 lít môi trường nước chiết malt 12% đã khử trùng 20 phút, 0,5 at. Thời gian 18-24 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30oC. - Giai đoạn nhân giống nhỏ trong phân xưởng: tỉ lệ 1:6 (5L đến 30L rồi đến 180L), thời gian 14-18 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30 oC, môi trường là 50% rỉ đường 12%, 50% mước chiết malt 12% Trang 34
  35. 35. - Giai đoạn nhân giống sản xuất: Môi trường là rỉ đường nồng độ 12% có bổ sung muối khoáng, thể tích các thùng lên men có thể lên tới 3-4 m 3, tỉ lệ tiếp giống là 1:10, trong quá trình nhân giống cần thổi khí liên tục, nếu qui mô sản xuất lớn có thể chuyển tiếp sang thùng nhân giống 12-15m3, thời gian mỗi cấp là 12-14 giờ. Đánh giá tiêu chuẩn: trong giai đoạn nhân giống nấm men từ phòng thí nghiệm đến 180L cần đạt: - Không nhiễm nấm men dại, vi khuẩn - Tế bào đồng nhất: không nhỏ, không lớn - Lực nở bột: 45 - 50 phút - Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 45 phút - Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 60 phút Xác định lực nở bột: xác định lực α-glucosidase (maltase) và zymase. Hoạt lực zymase biểu thị tốc độ lên men đường glucose và saccarose còn hoạt lực maltase biểu thị tốc độ lên men đường maltose của nấm men. Tiêu chuẩn giai đoạn nhân giống sản xuất: nấm men cần đạt yêu cầu hình tròn, ovan đều,hàm lượng nitơ 2,2-2,4%, phospho 0,9-1,1%, lực nở bột: 45-50 phút, hoạt lực maltase ít hơn 60phút, hệ số sinh sản 0,11-0,14.1.3.2. Môi trường dinh dưỡng: - Nồng độ rỉ đường: 10-12% - (NH4)2SO4: 0,1-0,3% - Ure: 0,1-0,15% - (NH4)2HPO4: 0,1% - MgSO4: 0,05% - pH: 4,2-5,5Thanh trùng: Môi trường sau khi được xử lý được bổ sung các muối vô cơ để tạo môi trườnglên men rồi thanh trùng ở 121oC/1atm/phút.1.3.3. Nuôi thu sinh khối Trang 35
  36. 36. Thể tích môi trường lên men khoảng 100m 3, thời gian lên men từ 12-20 giờ tạo ra được20-30 tấn nấm men tươi, nhiệt độ 28-30oC, hệ số sinh sản: 0,15-0,16, mật độ tế bào 60-100g/l,hiệu suất 75-95%, có thể lên men liên tục hoặc gián đoạn.1.3.4. Quá trình men lắng Quá trình men lắng: quá trình này rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng thương phẩm,trong quá trình lắng không còn chất dinh dưỡng trong môi trường, hệ enzym trong nấm menchuyển từ quá trình sinh tổng hợp sang quá trình trao đổi chất nhằm duy trì các chức năng bìnhthường của tế bào. Trong quá trình này còn tế bào non đang nảy chồi, tỉ lệ giữa số tế bào non vàtế bào trưởng thành tùy thuộc vào qui trình kỹ thuật và môi trường dinh dưỡng lúc đầu. Số tếbào trưởng thành càng cao thì nấm men thành phẩm càng giữ được chất lượng tốt. Điều kiệnlắng tốt nhất là 27oC, giảm lượng không khí 40 – 60% so với giai đoạn nuôi chính, thời gianlắng 1,5 – 2 giờ.1.3.5. Thu sản phẩm- Ly tâm sau men lắng: Bơm dịch lên men vào máy ly tâm, thời gian ly tâm càng nhanh càng tốt(không quá 2 giờ), rửa nấm men bằng nước lạnh 2oC thu được sinh khối nấm men.- Lọc ép, quạt khô: Sau khi ly tâm, thu nấm men và đưa vào thiết bị lọc chân không hoặc lọc ép.Nấm men được giữ lại trên tấm vải lọc có độ ẩm 75%. Nếu lọc ép hiệu quả thì không cần quátrình quạt khô, nếu lọc ép không hiệu quá thì có thể sử dụng quạt gió để xử lý tiếp 0,5 – 1 giờ.- Tạo hình, đóng gói men ép: Ở các nước giai đoạn này được thực hiện bằng máy và có bổ sungdầu thực vật 0,1% và lơxitin để đảm bảo độ chắc và màu cho sản phẩm ép bằng máy. Men épđược bảo quản ở 2-4oC. Khâu tạo hình, đóng gói men thực hiện càng nhanh càng tốt vì trongđiều kiện nhiệt độ thường tế bào nấm men đang ở trạng thái nghỉ có thể tiếp tục hoạt động ảnhhưởng đến chất lượng nấm men hoặc sinh khối nấm men bị nhiễm khuẩn tạo những chất độc vàlàm giảm hàm lượng dinh dưỡng của nấm men. Ở nước ta giai đoạn này vẫn chủ yếu được thựchiện thủ công nên ít nhiều cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấm men.Quá trình sấy khô được chia làm 3 giai đoạn Gđ1: Tách nước ở bên ngoài tế bào, quá trình diễn ra nhanh cho đến khi độ ẩm còn 52-53%. Lực nở của nấm men không đổi, không có tế bào chết nếu nhiệt độ sấy thấp hơn 38 oC. Trang 36
  37. 37. Gđ2: Tách nước ở bên trong tế bào, cần nhiều thời gian hơn so với giai đoạn trên. Tốc độsấy trong giai đoạn này giảm, độ ẩm cuối giai đoạn đạt 16-20% Gđ3: Tách nước liên kết, khó tách nên cần nhiều thời gian, độ ẩm đạt 7-8% Có 2 phương pháp sấy: Sấy liên tục: thời gian 2-4 giờ, nhiệt độ không khí 42, 37, 32, 28 oC, tốc độ sấy phụ thuộcnhiệt độ. Thường nhiệt độ đầu vào là 50oC, nhiệt độ đầu ra là 35oC. Sấy thùng quay: thời gian 10-20 giờ, tốc độ 4 vòng/phút, vận tốc không khí 1,5-2,5m/giây, nhiệt độ không khí 50-60oC trong 6-7 giờ, độ ẩm còn 15-22%, nhiệt độ không khí40oC 1,5-3,0 giờ, độ ẩm còn 7-8%.Đánh giá chất lượng men khô: - Độ ẩm: không quá 8 % - Lực nở bột: không quá 75 phút - Độ axit: ngày đầu sản xuất nhỏ hơn 120mg, sau 12 ngày nhỏ hơn 360 mg - Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 100 phút (loại tốt), nhỏ hơn 160 phút (loại trung bình) - Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 60 phút (loại tốt), nhỏ hơn 80 phút (loại trung bình).1.3.6. Yêu cầu thành phẩmMàu sắc: xám sáng, trứng sữa cho đến nâu tốiMùi vị: Đặc trưng của nấm men, không có mùi lạCó đầy đủ các VTM: B1 ≥ 10 mg/kg, B2 ≥ 30 mg/kg, B3 ≥ 300 mg/kgTỷ lệ tiêu hóa protein ≥ 75 – 80%Giá trị sinh học của protein ≥ 55% Thành phần Hàm lượng (% chất khô) Protein 50 Lipid 6 Độ ẩm 8 Các acid amin không thay thế Hàm lượng (% protein tổng) Lysine 8,2 Valin 5,5 Trang 37
  38. 38. Leuxin 7,9 Isoleuxin 5,5 Threonine 4,8 Methionine 2,5 Phenylalanine 4,5 Tryptophan 1,2 Histidine 4,0 Arginine 5,01.4. Ứng dụng • Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm • Ứng dụng trong y học • Ứng dụng trong mỹ phẩm2. CNSX protein từ dịch thủy phân các nguyên liệu thực vật và dịch kiềm sunfit2.1. Các nguồn nguyên liệu - Các loại thực vật như rơm, rạ, bã mía, lõi ngô, trấu ... sử dụng axit H 2SO4 0,4 – 0,6% cho đến 5% hoặc enzym cellulase để thủy phân. Trong môi trường axit có khả năng thủy phân tốt cellulose và hemicellulose. - Dịch kiềm sunfit thu được từ các nhà máy sản xuất giấy. Cứ 5 tấn bột cellulose dùng để sản xuất giấy thải ra lượng dịch có chứa 180 kg đường, trong đó chủ yếu là đường pentose là loại đường chỉ nấm men mới chuyển hóa tốt.. - Nước chiết ngô, ngước chiết lúa mì, nước chiết từ bã khoai tây thu được từ các nhà máy sản xuất tinh bột ...2.2. Nguồn vi sinh vật được sử dụng Từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật: candida utilis, candida tropicalis, candidascotti, candida humicola. Từ dịch kiềm sunfit: candida utilis, candida tropicalis. Đây là nhữngchủng nấm men có khả năng lên men được nhiều loại đường đặc biệt là có khả năng lên men tốtđường pentose có nhiều trong dịch kiềm sunfit. Ít sử dụng nấm men S. cerevisiae vì loài nàykhông có khả năng lên men đường pentose như các loài Candida.2.3. Quy trình sản xuất nấm men từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật và dịch kiềm sunfit Trang 38
  39. 39. Nguyên liệu, nghiền Nước + H2SO4 (0,5- Bột xenlulo 0,6%)Fucfurol vàcác chất bay Thủy phân Hơi nóng hơi khác (179-190oC), áp suất 9-13kg/cm3 Dịch thủy phân, Trung hòa=Ca(OH)2 Lọc và làm sạch Tách CaSO4 Làm nguội (30-32oC) KCl, super phosphat, (NH4)2SO4, Lên men sinh khối Men giống cấp IIIdầu phá bọt, chất điều chỉnh pH Tách sinh khối Sấy Đóng gói, thành phẩm Nghiền• Muốn thu được dịch thủy phân cần xử lý cơ học (nghiền, xay, cắt, loại bỏ tạp chất). Thủy phân ở nhiệt độ 179-190oC, chiều cao thùng 2-3m. Quá trình thủy phân diễn ra trong một thời gian dài sau đó chuyển sang thiết bị khác, chuyển đường nghịch đảo (nhiệt độ 100 – 105oC) bằng enzym investasse và sacharase. Sau quá trình chuyển đường nghịch đảo, lượng đường đơn có thể tăng 5-10%, dịch này có thành phần chủ yếu là hexose (70-80%) và pentose (20-30%), ngoài ra còn có khoảng 5% các axit hữu cơ, fucfurol, oxymethyl fucfurol là 2 thành phần không có lợi cho quá trình lên men nên phải loại bỏ. Sau khi thủy phân thường có pH axit nên sử dụng nước vôi, nước amoniac để trung hòa và cung cấp nitơ. Sau khi trung hòa nhiệt độ khoảng 80 – 85 oC có chứa nhiều thành phần lơ lửng và tạo kết tủa. Vì vậy phải loại tủa bằng cách lắng xoáy. Thông thường sau khi loại tủa Trang 39
  40. 40. chỉ còn lại khoảng 0,5-0,8% là các hợp chất huyền phù chủ yếu là các chất vô cơ. Quá trình làm nguội có thể làm lạnh trong các thiết bị ống lồng ống, dạng tấm, tự bay hơi ... Thông thường sử dụng phương pháp tự bay hơi để loại bớt 5-7% nước, 5-7% fucfurol và oxymethyl fucfurol. Chiều cao của thiết bị có thể lên tới 17m, có thể sử dụng thiết bị làm lạnh phụ khi tháp không đủ độ cao. • Dịch kiềm sunfit là dịch thu được sau khi nấu cellulose có chứa thành phần chủ yếu là lignin, hemicellulose, các chất keo tụ dạng nhựa, chất béo, muối khoáng và các monosacharid. Do quá trình nấu cellulose với H2SO3 và Ca(HCO3)2 nên trong dịch còn rất nhiều SO2 và SO3 khÀ•#c

×