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3S_Resumo técnica de pcr

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    3S_Resumo técnica de pcr 3S_Resumo técnica de pcr Document Transcript

    •  HISTÓRIAEm 1983, o processo de Reação em Cadeia de Polimerase foi descrito por Kary Mullis e em 1989patenteado pela Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation. K. Mullis recebeu o Prémio Nobel daQuímica após 10 anos de sua descoberta.  O QUE É A PCR?A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro, a duplicação de cadeias de DNA, envolvendonucleotídeos, sequências iniciadoras (primers) e enzimas polimerases (enzima que catalisam a reação depolimerização de ácidos nucléicos a partir dos seus monômeros).É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde,ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.  A TÉCNICAA Reação em Cadeia da Polimerase é feita do seguinte modo: primeiro, extrai-se o material a serestudado: DNA, vestígios de crimes, etc. Na segunda etapa o DNA é colocado em microtubo de ensaiojuntamente com a enzima taq polimerase, nucleotídeos, os primers complementares a sequência de DNA,Mg ²+ e solução tampão. Todos os “ingredientes” são colocados em uma máquina termocicladora, nascondições ideais, semelhantes às do nosso organismo, onde ocorrerão cerca de 60 ciclos, cada um delesdivido em 3 etapas, sendo estas: desnaturação, anelamento e extensão.A desnaturação é uma etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC, onde ocorre aseparação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio.Durante o anelamento, com duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC, os primers se anelamas duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. E, é nesta etapa que se tem oseqüenciamento de DNA pelo Método de Sanger. O sequenciamento de DNA faz parte da etapa deextenção - uma etapa com duração entre 45s e 1min, a 72ºc - pois é nesta etapa que se criam condiçõesideais para a atividade enzimática da taq polimerase (temperatura ótima), que estimulada pela presençade magnésio, irá “completar” o seqüenciamento iniciado pelos primers, que se incorporaram nasextremidades da fita simples de DNA.Estas 3 etapas acontecem repetidas vezes até a formação de milhares de novas fitas de DNA. Após cadaciclo, o número de fragmentos se duplica, o que pode ser resumido pela fórmula matemática N = No x 2n.A leitura dos resultados é feita através da eletroforese em gel de agarose um gel que se dissolve em águafervente e geleifica quando esfria. O gel de agarose é a “Fase Estacionária”, que possui pequenos poçosonde a amostra a ser analisada será colocada. Por este gel, aplica-se uma corrente elétrica e como oDNA é negativamente carregado, ele será atraído pelo pólo eletrodo positivo, migrando através do gel. Otamanho exato de um fragmento pode ser obtido através da razão de migração. Após a eletroforese emgel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade peloDNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta (procedimento realizado emcâmera escura). Dessa forma podem-se localizar as bandas que correspondem ao DNA e, através decomparação, descobrir se o resultado foi positivo ou negativo.  VANTAGENSAs vangagens de se utilizar este método são: não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar,mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão aespecificidade; a capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; a elevada sensibilidade eespecificidade; ser uma técnica rápida, barata e segura.  LIMITAÇÕESAs limitações são: a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primersespecíficos; a relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho; a limitada extensãoda sequência; a incorporação errônea de bases durante a replicação; substâncias que conhecidamenteinibem a reação, como é o caso da hemoglobina.