Capítulo 5.- Manual de trabajo. Técnica analítica. MANUAL PRÁCTICO PARA EL ESTUDIO DE GRUPOS BIOINDICADORES EN FANGOS ACTIVOS

CAPÍTULO 5.- MANUAL DE TRABAJO. TÉCNICA ANALÍTICA. GBS TÉCNICA ANALÍTICA Procedimiento operativo 1.- Agitar con suavidad la muestra para homogeneizar cuandoPor: Eva Rodríguez, Laura Isac, Natividad Fernández, M. Dolo- se quieran observar las características del flóculo o cuan- res Salas. (GBS) do se quiera realizar un análisis cuantitativo. 2.- Dejar decantar y tomar la muestra de la porción sedimen-  FUNDAMENTO tada cuando se quiera estudiar diversidad de organismos. El análisis se realiza sobre muestras in vivo del fango acti- 3.- Tomar entre 25 y 50 μl con una micropipeta con punta devado de una EDAR a la que se le pueden realizar tres tipos de boca ancha o una pipeta Pasteur, depositarla en un portaanálisis: sobre muestra viva, sobre muestra viva con colorante (previamente desengrasado) y colocar encima un cubre-o sobre muestra fijada y teñida. objetos. En caso de no disponer de micropipeta, se puede pesar una gota de fango sobre un portaobjetos, conocien-  PROCEDIMIENTO OPERATIVO DE TRATAMIENTO Y do previamente el peso de éste y la densidad del fangoCONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS activado. Preparación del microscopio. 4.- Proceder al análisis microscópico de la preparación utili-1.- Realizar ajuste Köhler. zando los distintos objetivos. El último objetivo a utilizar2.- Ajuste de anillos para contraste de fases. es el de 100X con aceite de inmersión, para observar en3.- Limpieza de objetivos y portaobjetos con solución de etanol detalle las distintas estructuras.4.- Utilizar filtro azul para observar tinciones o resaltar contor- 5.- Observar al menos de 2 a 3 preparaciones de la muestra. nos en organismos vivos. 6.- Se recomienda como complemento el análisis de los SSLM,5.- Utilizar filtro verde para contraste de fases y resaltar tincio- V30 e IVF. nes Gram y Neisser difíciles de determinar.  INTERFERENCIAS Toma de muestras La muestra debe ser lo más reciente posible y realizar su aná-1.- Utilizar botes de plástico limpios de 2.000 ml. lisis cuanto antes. En caso de retraso es necesario mantenerla se-2.- Toma de muestras a profundidad determinada y fijada. gún lo establecido en el anejo 2 para conservación de muestras.3.- Punto de muestreo fijo y en zona de máxima homogenei- Si el análisis es sobre protozoos no debe retardarse más de dad del fango. 24 horas. Si por el contrario es sobre bacterias filamentosas el4.- Dejar siempre el bote de muestreo ¼ de su contenido vacío. margen puede ampliarse, mencionando la bibliografía már-5.- Fijar inmediatamente una submuestra con líquido de genes de hasta 6 días. Bowin (5 ml Bouin / 100 ml de muestra, o formol al 4%). Es preferible siempre realizar el análisis cuanto antes a fin6.- Proceder para el transporte y conservación según el proto- de evitar variaciones en la composición biótica del fango así colo establecido en el Anejo 2. como desestabilizaciones del flóculo. Tratamiento de las muestras  PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA HOJA DE1.- Muestras in vivo: TRABAJO * Para observación de la muestra sin alterar, colocar direc- El análisis biológico completo consta de varios apartados: tamente en un portaobjeto con un cubreobjetos. 1.- Valoración macroscópica y microscópica de un fango acti- * Para inmovilizar organismos y observar estructuras vo: Índice de fango. visibles sin necesidad de tinción, colocar la gota sobre el 2.- Identificación y cuantificación bacteriana (organismos fi- porta, poner un cubre y prensar suavemente. También se lamentosos). puede utilizar un inmovilizador tóxico como el sulfato de 3.- Identificación y cuantificación protozoaria. níquel al 0,01 %. 4.- Valoración general del estado del fango: conclusiones * Estudio ccualitativo de organismos.2.- Muestras fijadas: 1.- EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE UN FANGO BIOLÓ- * Estudio cuantitativo de organismos. GICO: Niveles macroscópicos y microscópicos. Índice de * Observación de las estructuras tal y como estaban en fango. el momento de tomar la muestra al añadir un reactivo de La valoración de las características macroscópicas del fijación como el líquido de Bouin (existe riesgo de defor- fango activado se realiza a través del ensayo de la V30, que mación de los organismos). determina la cantidad de fango activado que decanta en una3.- Muestras teñidas: probeta o cono Imhoff, tras un periodo de 30 minutos. * Para resaltar estructuras específicas que no se observan El análisis consiste en dejar que la muestra de fango activo fácilmente en la muestra in vivo. sedimente los sólidos fácilmente decantables, sin necesidad GBS 57

GBS de adición de productos químicos (sin coagulación ni flocu- lación), simplemente dejando decantar durante un tiempo determinado (30 min.). Se analizarán tanto las propiedades del proceso de decan- fías que permiten ajustar los tres rangos de este parámetro (Figura 1). La turbidez se desglosa en esta valoración de los microflóculos en suspensión del clarificado, valorándose ambos de forma independiente. Por lo tanto la medición directa tación como las características del clarificado. sobre el clarificado con un turbidímetro nos proporcionará un Como características macroscópicas se entienden aque- valor erróneo. llas características observables a simple vista sobre el aspecto Como referencia, tomaremos un objeto que se colocará del fango activado y del clarificado de la V30. en la parte trasera de la probeta. Si la forma del objeto se ob- - Turbidez serva claramente, definiremos la muestra como poco turbia - Flóculos en suspensión en el clarificado (turbidez baja). En este caso se pueden incluso apreciar los - Sedimentabilidad del fango dibujos existentes sobre el objeto. Si los contornos se apre- - Olor cian, pero no es posible observar el dibujo de la superficie, en A nivel microscópico: ese caso hablaremos de turbidez media. Por último, si no es - Forma del flóculo imposible observar ningún dibujo y los contornos del objeto - Tamaño del flóculo quedan difuminados e incluso no se ven, estaremos hablando - Estructura y textura del flóculo de turbidez alta. - Cobertura de la masa de fango sobre la circunferencia de El conjunto de características microscópicas recogidas du- un objetivo de 10x rante la observación microscópica se refieren al examen del - Presencia de filamentos en el flóculo y en disolución estado morfológico y estructural del flóculo de fango activo - Diversidad de protozoos (forma, tamaño, estructura, textura, cobertura, etc.) y al exa- Todas estas observaciones se han de realizar con un obje- men del componente biótico del “ecosistema fango activo”, tivo de 10x y, al menos, sobre 2 preparaciones distintas de la representado por las poblaciones de bacterias filamentosas y muestra, que será homogenizada previamente con suavidad. de protozoos (principalmente ciliados). Con ayuda de una pipeta Pasteur, se toma un pequeño vo- lumen de la suspensión biológica, se deposita sobre un portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos. La información que se deduce de las observaciones microscópicas, junto con la obtenida durante el ensayo de decantación en probeta o V30, permiten otorgar un valor final de puntuación que permi- tirá evaluar la calidad del fango, al encontrarse dicha puntua- ción divida en distintas categorías. Se valoran las siguientes características: Turbidez: • Alta: Visibilidad muy baja a través de la probeta • Media: Visibilidad media a través de la probeta • Baja: Visibilidad alta a través de la probeta Flóculos en suspensión: • Alta: abundancia de microflóculos Figura 1: Distintos niveles de turbidez, evaluados sobre el clarificado • Media: presencia de microflóculos • Baja: prácticamente ausencia de microflóculos La evaluación de estas características proporciona infor- Sedimentabilidad: mación sobre las propiedades de decantación y compacta- • Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros ción del fango activo durante la fase de clarificación del licor minutos del ensayo y el fango está muy compactado mezcla, así como del nivel y estado de colonización de la mi- • Media: la mayor parte del fango decanta entre 10-20 microfauna, aludiendo, indirectamente, al grado de actividad nutos y se observa un ligero esponjamiento biológica del proceso de depuración. • Baja: la mayor parte del fango decanta después de 20 Procedimiento operativo: minutos y se observa un claro esponjamiento Este procedimiento se destina a la observación de la mues- Olor: característica macroscópica del fango activado que se tra sin alterar, de la estructura flocular y de la disposición del define como correcto o incorrecto, indicando este último entramado filamentoso. Indicado en la evaluación del estado situaciones como septicidad, presencia de vertidos, etc. de formación flocular así como en el reconocimiento de cier- El máximo valor obtenido por las características macros- tas características morfológicas y estructurales empleadas en cópicas es de 30. la identificación de bacterias filamentosas. Si se produce un levantamiento total o mayoritario de la Las características estudiadas son: manta de fangos, se indica como valor macroscópico cero. Forma: característica que define la morfología externa del A nivel orientativo y con relación a la turbidez, por su flóculo como regular si aparece de forma redondeada e irre- complejidad en la evaluación, se muestran algunas fotogra- gular si difiere de esta configuración.58 GBS

Tamaño: • Pequeño: tamaño menor de 150 μm GBS tirá evaluar la calidad del fango al encontrarse dicha puntua- ción dividida en distintas categorías (Tabla 3), obteniéndose • Medio: tamaño entre 150 y 500 μm (Incluidos ambos va- como valor final una evaluación del fango comprendida entre lores) 0-100 que permite definir una categoría de IF entre pésimo y • Grande: tamaño mayor de 500 μm óptimo. Estructura: El parámetro IF ha resultado ser un buen sistema de • Compacto: no existen prácticamente huecos en la estruc- control rápido con el que obtener un índice de formación tura interna del flóculo flocular, orientativo del estado del cultivo biológico, que • Medio: se detectan algunos huecos nos aproxima a los rendimientos de depuración en las • Abierta: existen bastantes huecos dentro del flóculo que EDAR de fangos activos. En general, podemos definir el rompen la unidad interna Índice de Fango (IF) como un parámetro indicador del es- Textura: característica que alude al grado de cohesión tado de floculación en el reactor biológico, que nos apor-entre las partículas que forman el flóculo, estableciéndose ta información para modificar las condiciones del cultivolas categorías “fuerte” y “débil” en función a la ausencia o pre- y de esta forma mejorar la eficacia de la reducción de lasencia de disgregación de los flóculos, respectivamente, tras DQO y los SS en las EDAR, tomándose con reserva las re-punción sobre el cubreobjetos (Manual de laboratorio, Ayun- laciones que mantiene con la DBO, Nitrógeno y Fósforo.tamiento de Madrid, 1997). Una observación general del fango activado que puede Cobertura: característica que valora si la unión de todos los durar unos veinte minutos, nos proporcionará idea del es-flóculos presentes en el ocular de 10X cubren menos del 10 % tado de éste y de la respuesta esperable de la EDAR con-de su superficie, del 10-50 % o más del 50 %. vencional. Filamentos en el flóculo: El IF es un complemento analítico aplicable a plantas • Menos de 5 filamentos por flóculo depuradoras de fangos activos de grandes núcleos de po- • Entre 5-20 filamentos por flóculo (Incluidos ambos valores) blación, en las que a través de la observación del estado • Más de 20 filamentos por flóculo de floculación se podrá valorar la calidad del proceso de Filamentos en disolución: característica que cuantifica la depuración, entendida ésta como rendimientos depura-existencia de filamentos libres entre los espacios ínter flocula- dores. En plantas pequeñas se presenta como un sistemares del licor mezcla. Si no son observables será “baja”, mientras idóneo, dónde con reducidos costes un mismo especia-que si se observan normalmente será “alta”. lista puede controlar las condiciones de explotación de Diversidad de protozoos: varias EDAR Si a esto último añadimos que muchas de • Menos de 4 especies estas plantas pequeñas se encuentran localizadas en zo- • De 4-7 especies (Incluidos ambos valores) • Más de 7 especies Otras observaciones presencia/ausencia de crecimientodisperso, presencia/ausencia de fibras orgánicas, presencia/ausencia de partículas inorgánicas, presencia/ausencia de bac-terias helicoidales, presencia/ausencia de Zoogloea sp., etc. El máximo valor obtenido por las características microscó- ESTRUCTURAS FLOCULARESpicas es de 70. Todas estas observaciones se han de realizar con un ob-jetivo de 10X sobre al menos 2 muestras previamente homo-geneizadas suavemente con ayuda de una pipeta Pasteur. Elvolumen de muestra se deposita sobre un porta-objetos y secoloca encima un cubre-objetos. Es recomendable realizar una medida del tamaño flocularentre 15 flóculos elegidos al azar, para decidir en que catego-ría se engloban. Es conveniente realizar otras observaciones de presencia/ausencia, de: Bacterias helicoidales, fibras orgánicas, Zoogloeasp., partículas inorgánicas, burbujas, color, hinchazón y espu-mas o natas en superficie. A nivel orientativo y con relación al tamaño, estructura ytextura, se muestran algunas fotografías que permiten ajustarlos rangos de estos parámetros (Figura 2). La información obtenida tanto del estudio microscópicocomo del ensayo de decantación (V 30), permiten otorgar unvalor final de puntuación (Tabla 2), Índice de Fango, que permi- Figura 2: Distintos raangos de tamaños y estructura floculares. GBS 59

GBS nas sensibles (Oron et al., 2002), la aplicación del IF como parámetro complementario sería muy deseable. La valoración del estado de floculación de la materia orgá- nica permite tomar medidas encaminadas a la mejora de este activo está compuesta por polímeros extracelulares (EPS, extracellular exopolymers), los cuales son considerados como los principales responsables de la adhesión de las células micro- bianas a la estructura flocular y de la cohesión del conjunto. Las proceso para así obtener buenos clarificados y reducir de esta propiedades adsorbentes de los EPS han sido bien documenta- forma la emisión de contaminantes. Por otra parte, es sabido das por distintos autores en términos de bioadsorción de con- que una gran proporción de la estructura del flóculo de fango taminantes y tóxicos (iones metálicos, por ejemplo). Sin embar- CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Turbidez Alta 0 Media 4,5 Baja 9 Flóculos en suspensión Alta 0 Media 4,5 Baja 9 Sedimentabilidad Alta 9 Media 4,5 Baja 0 Olor Correcto 3 Incorrecto 0 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS Forma Regular 4 Irregular 0 Tamaño Grande 4 Medio 7 Pequeño 0 Estructura Compacta 18 Media 9 Abierta 0 Textura Fuerte 4 Débil 0 Cobertura < 10% 0 10-50% 7 >50% 3,5 Filamentos en flóculos >20 0 5-20 7 <5 14 Filamentos en disolución Alta 0 Baja 3 Diversidad de Protozoos <7 especies 13 4-7 especies 7 <4 especies 0 ÍNDICE DE FANGO TOTAL Tabla 2: Valoración del índice de fango. Los extremos de los intervalos pertenecen a las categorías intermedias. Es necesario revisar los apartados de filamentos y protozoos tras los recuentos, para reajustarlos a los valores obtenidos.60 GBS

go, el papel de los EPS en la eliminación biológica de nutrientescomo el nitrógeno o el fósforo no ha sido abordado hasta muy a la observación. GBS 2. Seleccionar el objetivo de inmersión o 100x y procederrecientemente debido a la falta de herramientas adecuadas. 3. Una vez concluido el análisis microscópico, retirar el ob-Cloete y Oosthuizen (2001) haciendo uso del análisis mediante jetivo con cuidado y limpiarlo con un paño suave impregnadoEDS (Energy Dispersive Spectrometry) y microanálisis con rayos en la solución éter-etanol 3:1.X, han estimado que la proporción de fósforo en los cúmulos Estudiaremos los siguientes puntos:bacterianos de una muestra de fango activo procedente de • Organismo filamentoso dominanteuna planta en la que existe eliminación biológica de fósforo, es • Organismo filamentoso secundariode un 57-59% del total. Estos mismos autores encontraron que • Otros filamentos de interéslos EPS aislados de muestras biológicas de igual procedencia, La identificación bacteriana se realizará fundamentalmen-retuvieron, por sí solos, entre el 27-30% del total del fósforo este sobre el filamento dominante y el secundario.timado. Estos resultados sugieren que la eliminación de fósforo Determinación de los efectos de dichos microorganismosen el fango activo podría ser debida no sólo a los organismos sobre la estructura flocular:acumuladores de fosfato, sino también al EPS como reservorio • Formación de puentes ínter flocularesde este elemento. Con esta explicación, lo que quiere significar- • Disgregación flocularse es que la detección precoz mediante el IF de alteraciones en • Filamentos libres en los espacios ínter flocularesel estado de floculación, evitará en buena proporción no sólo la La proliferación total de filamentos se valorará según laliberación de sólidos con el efluente, sino también de nutrien- Tabla 4, en función de la abundancia relativa, principalmente,tes a los cauces receptores. de los organismos dominante y secundario, aunque dejando En definitiva, el IF se establece como un sistema práctico constancia de la presencia de otras filamentosas que, por sudel control de la formación flocular en la EDAR y como un útil abundancia, se consideren de interés.complemento en la determinación de las condiciones de explo- Paralelamente, se pueden realizar dos aproximaciones mástación, repercutiendo positivamente sobre el medio ambiente. exactas de la cantidad de filamentos: una valoración “semicuan- titativa” en la que se contabiliza el número de filamentos obser- ÍNDICE DE FANGOS vados que interceptan la circunferencia del objetivo de 40x, para la cual la muestra debe estar teñida con cualquier tinción in vivo; 0-20 pésimo o una valoración cuantitativa de los m/mL de filamentos según 20-40 malo el recuento de los cortes en la diagonal de la cámara Neubauer 40-60 regular improved a 20x para lo cual la muestra debe estar in vivo. La me- 60-80 bueno todología de este último procedimiento, que viene expuesta con más detalle en Arnáiz et al. (1999), requiere de la realización de 80-100 óptimo cuatro réplicas de la muestra, en la que se cuentan los cortes deTabla 3: Categorías de Índice de Fango. los filamentos sobre la cuadrícula definida en los 16 cuadrados Pertenecen los extremos de los intervalos a las categorías de la diagonal de la cámara, valor que hay que multiplicar por elintermedias. Es necesario revisar los apartados de filamentos factor 37,12. La media del número de cortes por el factor valoray protozoos tras los recuentos, para reajustarlos a los valores los m/mL de filamentos. Esta técnica no es adecuada para No-obtenidos. cardia sp. Ambos sistemas no son comparativos, siendo más exacto el 2.- EVALUACIÓN DEL DESARROLLO DE BACTERIAS FI- recuento sobre la cámara Neubauer improved. En cualquier caso,LAMENTOSAS EN UN FANGO ACTIVO estos sistemas pueden servir de referencia si se practican de forma metódica en la EDAR, al detectar la proliferación de bacterias Los organismos filamentosos ocupan, a baja concentra- filamentosas y las oscilaciones en la abundancia de éstas.ción, un papel fundamental en la formación del entramado Debido a que determinadas bacterias originan problemasadecuado del flóculo. Un crecimiento excesivo de estos mi- de turbidez (Bacilllus sp., Tipo 1863....) se realizará una determi-croorganismos provoca alteraciones en la relación superficie/ nación cualitativa independiente y una cuantificación para estevolumen del flóculo que se traduce en problemas de sedi- tipo de organismos, según la tabla 5. Esta valoración se realizarámentabilidad del fango con el consiguiente empeoramiento sobre los filamentos que se encuentren situados en el espaciode la calidad del efluente. ínterflocular. La respuesta de los organismos filamentosos a las TincionesGram, Neisser, PHB, etc., realizadas sobre frotis fijos de fango acti- 3.- EVALUACIÓN DE LA MICROFAUNA PRESENTE ENvo, permiten, junto con las características morfológicas y estruc- FANGOS ACTIVOSturales deducidas de la observación in vivo, su identificación. En esta hoja de trabajo se pretende valorar la diversidad Procedimiento operativo: de la microfauna presente (Índice Biótico de fango (SBI) e 1. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis, Índice de Diversidad de Shannon (H)) e identificar y cuanti-perfectamente seco, que ha sido teñido según el protocolo ficar los organismos presentes (protozoos y metazoos) en laconvenido (capítulo 3). muestra. GBS 61

GBS VALORACIÓN DE FILAMENTOS EN FUNCIÓN DE LA ABUNDANCIA RELATIVA VALOR porcentual de los organismos y el Índice de Shannon (H = - ∑ (Pi(log2Pi) (bit)); Siendo Pi = nº organismos SPA/ nº total organismos. El Índice de Shanon de biodiversidad permite completar ABUNDANCIA SIGNIFICADO NUMÉRICO este estudio aportando otro parámetro más en el estudio 0 Ninguno biótico. Aporta las unidades de información que circulan por Hay filamentos pero el sistema en bit. Queda definido en la Teoría de los sistemas 1 Pocos se observan sólo en Ecológicos de Margalef (1992). algunos flóculos Descripción del índice Madoni (Madoni, 1994). Se ven filamentos en Desarrollo 2 Alguno los flóculos, pero no en *Visu preliminar: 50 µL o 1 gota de pipeta Pasteur de la todos ellos muestra, para valoración cualitativa de las especies presentes Se observan *Recuento de pequeños flagelados: 25 µL (2 réplicas) a filamentos en todos 200x con la cámara de Fuchs-Rosenthal en la diagonal com- 3 Comunes los flóculos pero en pleta (16 cuadrados) pequeña cantidad (1-5 *Recuento de organismos: 25 µL (2 réplicas) a 100x filamentos por flóculo) Datos a tener en cuenta: *Es recomendable utilizar cubres de 18 x 18 mm para evi- Se observan filamentos tar la desecación de la muestra 4 Muy en todos los flóculos, *Organismos a considerar en el recuento: grandes flagela- comunes pero con una densidad dos, tecamebas y metazoos media (5-20 por flóculo) *Organismos no considerados: Amebas desnudas, algas, crustáceos... Hay filamentos en *En los ciliados coloniales se contabiliza cada organismo 5 Abundantes todos los flóculos y con *Los organismos detectados en el visu, pero no en el re- densidad alta cuento, tienen una abundancia de uno (>20/flóculo) *No es necesario identificar a nivel de especie a flagelados, rotíferos y nematodos Filamentos * No afectan al porcentaje de grupos funcionales los cilia- 6 Excesivos presentes en todos los dos carnívoros y suctores flóculos; hay más Los resultados que se emplearán para determinar el valor filamentos que flóculos. final, según la tabla del anejo 1 (tabla para la determinación Tabla 4: Cuantificación de microorganismos filamentosos, Jenkins, del índice biótico), son: D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (2004). Manual on the Causes and *Grupo dominante Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. Lewis Publishers. *Densidad de la microfauna en número de individuos/mL *Número de especies detectadas De estos organismos se han clasificado en la hoja de tra- *Recuento de pequeños flagelados bajo correspondiente los más comunes en aparición, a fin de * Índice biótico de fango: SBI Clase de Madoni correspon- simplificar el trabajo. La observación se hará a 10X/40X au- diente al valor de SBI. mentos con volúmenes de 25 µL y en dos réplicas. La metodología a seguir es la establecida por Madoni Consideraciones a tener en cuenta para el SBI y el H. (1994) para el cálculo del SBI complementado con el reparto - Rotíferos y nematodos, debido a la complejidad que supo- ne identificarlos a nivel de especie, contribuyen cada uno a una ABUNDANCIA RELATIVA sola unidad sistemática; sin embargo, si somos capaces de dis- PARA FILAMENTOS LIBRES tinguir géneros es importante reflejarlos para el cálculo de H. VALOR - La determinación de amebas testáceas se realiza sólo a ABUNDANCIA nivel de género para el SBI. Sin embargo, si es posible llegar a NUMÉRICO diferenciar especies hay que señalarlo para determinar H. 0 Pocos - En cuanto a los “grupos-clave” sólo los ciliados bacterió- fagos se engloban dentro de los 3 grupos funcionales (nada- 1 Medio dores de vida libre, reptantes o móviles de fondo y sésiles o pedunculados). 2 Muchos - Los ciliados carnívoros tan sólo contribuyen a la densidad y diversidad total de la microfauna. Así pues, ciliados nada- Tabla 5: Cuantificación de microorganismos filamentosos en el dores predadores, tales como Litonotus sp., Amphileptus sp., espacio interflocular.62 GBS

Coleps hirtus, Acineria incurvata y Sphathidium sp. deben serapartados del grupo de los ciliados nadadores de vida libre. De GBS ceas que utilizan material extracelular (piedras, diatomeas...) para generar su teca (testas aglutinadas), pues casi siemprela misma forma, los ciliados predadores sésiles o pedunculados, son oscuras. En el caso de un fango activo con abundancia decomo los suctores Podophrya sp., Tokophrya sp. y Acineta sp. testáceas se procederá a realizar la prueba de actividad con eldeben ser igualmente apartados del grupo de los ciliados sési- Rosa de Bengala, la fórmula (Figura 3) C2OH2O5T4Cl2Na2. Esteles o pedunculados, considerándose tan sólo a la hora de com- reactivo se absorbe por la superficie protoplasmática, colo-putar densidad y diversidad total de la microfauna. reándose de rosa. Se añade un poco de reactivo a 50 mL de - No se tienen en cuenta las larvas telotrocas, pero se rese- fango activo y se deja reposar unos 15 minutos, tras lo que seña en observaciones su abundancia. realiza el recuento. - Es necesario realizar los recuentos de organismos con-tando también los contenidos en el rebose que se pueda pro- Situaciones anómalas en el SBI:ducir en el cubreobjetos. La presencia masiva de grandes flagelados por un lado o - Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están in- de nematodos y rotíferos por otro, plantea dificultades a lacluidas en el mismo grupo para el SBI, no así para H. hora de aplicar el SBI. En estos casos se pueden plantear dos - Colonias muy numerosas de peritricos falsean los resul- situaciones:tados finales de los recuentos. Por ello, el procedimiento a se- 1.- Sólo existen estos organismos anteriormente citados,guir cuando aparecen es: realizar los dos recuentos normales en cuyo caso no se puede aplicar el SBI. Se indicarían las den-de organismos y si aparece una colonia grande se obvia en el sidades de tales organismos.resultado final. Una vez terminado, se realizan de nuevo dos 2.- Existen otros organismos que sí están recogidos en elconteos y esta vez sólo se contabiliza el organismo colonial. SBI. En este caso se aplicaría el SBI a estos grupos de organis-Una vez terminado se sustituyen los valores del colonial en los mos, puntualizando que existen determinadas densidades dedos recuentos iniciales y se realiza el resultado final. organismos no recogidos en dicha clasificación. - La lista de especies observadas se realiza con al menos Otra situación dificultosa es la aparición de Vorticella mi-dos organismos vistos de cada especie. crostoma más V. infusionum o de Opercularia no dominante, - El SBI es adecuado para tratamientos convencionales de fan- pero sí abundantes. En este caso se aplica el SBI normalmentegos activos, contacto-estabilización y aireación prolongada. La y se puntualiza que aparecen estos grupos de organismos amedida de diversidad, H, es adecuada para cualquier ecosistema. tales densidades. -Las amebas testáceas deben contabilizarse solo cuandoestán vivas, por ello se prestará especial atención a su trans- 4.- EVALUACIÓN TOTAL DEL FANGO ACTIVO: CONCLU-parencia y si es necesario aplicaremos Rosa de Bengala. Como SIONESidea general: se tomarán las testáceas oscuras como inertes. En esta última hoja de trabajo se recogen las conclusionesSin embargo, esto plantea un problema para aquellas testá- parciales de cada una de las hojas anteriores de forma que nos ACTIVAS AMEBA ENQUISTADA: CITOPLASMA OSCURO, ESFÉRICO Y REGULAR. AMEBAS TESTÁCEAS INACTIVAS AMEBA DESNUDAFigura 3: Reacción al rosa de Bengala de distintas amebas. GBS 63

GBS aporten una visión clara de la calidad del fango y de la calidad previsible del agua de salida, así como de los parámetros de los cuales son bioindicadores los organismos presentes. En este apartado se recogerán todas las anomalías de sistema de control de calidad en la EDAR”. Tecnología del Agua 260, 82-92. • Fernández, N., Rodríguez, E., Isac, L. y Salas, M.D. (2002). “Quick wastewater treatment plants performance estimation, aplicación de los índices antes citadas, así como todas las based on macroscopic characteristics of activated sludge”. consideraciones que el operador crea que es necesario tener Congreso Internacional sobre Tecnologías de pequeña escala en cuenta. para la depuración y gestión de las Aguas residuales en el ám- bito Mediterráneo. Marzo de 2002, CENTA.  BIBLIOGRAFÍA • Gale, E. F. (1952). The Chemical activities of bacterias. Aca- demic Press. Nueva York. (Se recoge en este listado tanto la bibliografía utilizada en • Garrido, A., Canals, M., Ramírez, J. y Castanedo, C., (1988). el texto, como otras citas de interés) Seguimiento práctico por microscopía de la formación de fló- • Antonietti R., Broglio P. Y Madoni P. (1982).- Valutazione di culos de fango activo en la puesta en marcha de una depura- parametri biologici come indici di efficienza di depurazione in dora de aguas residuales. Tecnología del Agua 48, 35-44. impianti a fanghi attivi. Ingegneria Ambientale, 11: 472-477. • Isac, L. (2004). “Resultados y conlusiones obtenidas de • APHA, AWWA, WPCF (1992). Métodos Normalizados para los interlaboratorios realizados en el circuito 2003-2004”. Co- el análisis de aguas potables y residuales. Ed. Díaz de Santos, municación oral en la Jornada de Transferencia de Tecnología Madrid. sobre “Ejercicios interlaboratorios en fangos activos como sis- •Arnáiz, C., Jiménez, C. y Estévez, F. (1999). 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GBS ANEJOS ANEJO 1 : FORMATOS DE RECOGIDA DE DATOS66 GBS

GBS GBS 67

GBS TRAS ANEJO 2: TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUES- • Transporte El transporte se realizará en nevera, con el bote, lo más • ENSAYO MICROSCÓPICO estable posible, rodeado de material envolvente para evitar roturas floculares y movimientos bruscos. No es recomendable la refrigeración excesiva, aunque sí mantener una temperatura en torno a 13º C. En la medida de lo posible realizar el transporte mediante envío urgente. • Conservación de las muestras Inmediatamente a la recepción de las muestras se toma- rán tres alícuotas con distintos tratamientos: Alícuota 1: Destinada a la caracterización del flóculo. Man- tenida a temperatura ambiente y sin airear. Alícuota 2: Destinada a la caracterización de la microfauna (protozoos). Mantenida a temperatura ambiente, con oxigenación mediante piedra porosa (compresor de aire). La oxigenación debe colocarse en superficie una vez que ha decantado la muestra, de forma que exista oxígeno para el metabolismo protozoario, pero sin que se modifique el fango por la agitación. Alícuota 3: Destinada a la caracterización bacteriana. Man- tenida en frigorífico, sin agitación. Previamente se realizarán 5 frotis bacterianos para su tinción posterior. En todos los casos es recomendable realizar el análisis antes de 5 horas desde la toma de muestras, sobre todo para el caso de los fangos jóvenes (muy inestables). Es admisible un Distintos estados de formación flocular periodo de 24 horas y en oxidación total incluso de 48 horas. A: Flóculo de fango activo “ideal”; 100x, contrastes de fases ANEJO 3 : LÁMINAS FOTOGRÁFICAS B: Flóculo de fango activo bien formado en sistema con • ENSAYO DE LA V30 elevada edad de fangos; 100x, campo claro C: Estructura flocular abierta por la proliferación del filamento Sphaerotilus natans; 400x, campo claro. Tinción de Gram. D: Disgregación flocular ocasionada por episodio de bulking filamentoso; 100x; Contraste de fases. E: Crecimiento disperso local; 400x, campo claro, tinción de gram. Distintos ensayos de decantabilidad del fango activo.68 GBS

• CARACTERISITICAS Y REACCIONES BACTERIANAS GBS • ALTERACIONES EN LA DECANTABILIDAD Respuesta a la tinción de Gram: Flóculo en alfiler o Pin-Floc. 1.- Gram positiva; 1000 x, campo claro 2.- Gram negativo; 1000 X. Campo claro Respuesta a la tinción de Neisser: Bulking filamentoso. 1.- Neisser positivo. 400 x, campo claro 2.- Neisser negativo; Gránulos Neisser positivo; 1000 X.Campo claro Respuesta a la tinción de PHB: 1.- PHB negativo. 1000 x, campo claro Desnitrificación 2.- PHB positivo; 1000 X. Campo claro Ramificación: 1.- Ramificación falsa. 1000 x, campo claro 2.- Ramificación verdadera; 1000 X. Campo claro Crecimiento bacteriano: 1.- Crecimiento disperso. 400 x, campo claro 2.- Crecimiento epifítico; 1000 X. Campo claro GBS 69

GBS • PROTOZOOS Y METAZOOS: GRUPOS FUNCIONALES Flagelados: pequeños y grandes PROTISTAS PROTISTAS FLAGELADOS o EUGLÉNIDOS o BODÓNIDOS o COANOFLAGELADOS PROTISTAS AMEBOIDES o AMEBAS DESNUDAS o AMEBAS TESTÁCEAS o ACTINÓPODOS Amebas: Desnudas y con teca. PROTISTAS ALVEOLADOS o HETEROTRICOS o ESPIROTRICOS: HIPOTRICOS Y ESTICOTRICOS o LITOSTOMADOS: HAPTÓRIDOS Y PLEUROSTOMÁTIDOS o FILOFARÍNGEOS Y SUCTORES o NASOFÓREOS o COLPÓDEOS o PROSTOMADOS o OLIGOHIMENÓFOROS Ciliado nadador Ciliado reptante METAZOOS ROTÍFEROS GASTROTRICOS NEMATODOS ANÉLIDOS TARDÍGRADOS Ciliado sésil: solitario, colonial y lorigado Ciliado carnívoro: Nadador y sésil Metazoos: nematodo, rotífero y anélido.70 GBS

GRUPOS DE PROTISTAS PRESENTES EN FANGOS ACTIVOS GBS FLAGELADOS ZOOFLAGELADOS Bodo saltans, Pequeños flagelados sin identificar, Coanoflagelados Pequeños flagelados EUGLENOFITOS Euglena sp., Entosiphon sp., Peranema sp. Grandes flagelados RIZÓPODOS AMEBOIDES Mayorella sp., Familia Amoebidae Amebas desnudas Euglypha sp., Euglypha alveolata, Trinema sp., Arcella sp., Arcella hemisphaerica, Arcella vulgaris, Arcella gibbosa, Arcella arenaria, Arcella discoides, Pyxidicula sp., AMEBAS TESTÁCEAS Amebas testáceas Hyalosphenia papilio, Hyalosphenia elegans, Difflugia elegans, Difflugia bacillifera, Centropyxis sp., Centropyxis aculeata ACTINÓPODOS HELIOZOOS Actinosphaerium sp., Actinophrys sp. Heliozoos CILIADOS Spirostomum sp., Spirostomum teres, Blepharisma sp. Nadadores Euplotes sp., Euplotes aediculatus, Euplotes affinis, Euplotes patella, Euplotes moebiusi, Aspidisca cicada (sinónimo de A. costata), Aspidisca sp., Aspidisca ESPIROTRICOS Reptantes lynceus, Holosticha sp., Oxytricha sp., Parurosoma sp., Stylonychia sp., Stylonychia mytilus-complex Stentor sp. Sésiles Colpoda ecaudata, Prorodon teres*, Plagiocampa sp.*, Holophrya sp.*, Parame- cium caudatum, Paramecium aurelia-complex, Paramecium bursaria, Uronema sp., Nadadores Uronema nigricans, Cinetochilum margaritaceum, Cyclidium sp., Tetrahymena sp., Colpidium sp. HOLOTRICOS Acineria uncinata, Chilodonella uncinata, Gastronauta membranaceus, Trochilia Reptantes minuta, Drepanomonas sp. Paradileptus sp., Spathidium sp., Perispira sp.*, Litonotus sp., Litonotus fasciola, Carnívoros Litonotus crystallinus, Litonotus cygnus, Litonotus lamella, Coleps sp. Complejo Vorticella convallaria, Vorticella gracilis (Complejo V. convallaria), Vorticella picta, Vorticella campanula, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella microstoma, V. alpestris (Complejo V. microstoma), Complejo Vorticella aquadulcis, Vorticella striata (Complejo V. aquadulcis), Carchesium sp., Epistylis PERITRICOS Sésiles sp., Epistylis chrysemydis, Epistylis plicatilis, Epistylis entzii, Epistylis procumbens (sinónimo de E. rotans), Campanella umbellaria, Zoothamnium sp., Opercularia sp., Opercularia microdiscum, Opercularia articulata, Opercularia minima, Opercularia solitaria (O. hebes), Vaginicola sp., Thuricola kellicottiana Podophrya sp., Podophrya fixa, Solenophrya sp., Acineta sp., Tokophrya sp., Toko- SUCTORES Sésiles (carnívoros) phrya infusionum, Tokophrya quadripartita, Tokophrya lemnarum, Periacineta sp.Tabla I: Listado de especies más usuales, asignación a los grupos de protistas tradicionalmente conocidos y denominación de éstas en cuanto a surelación con el flóculo y hábitos alimenticios. GBS 71

GBS EUGLÉNIDOS PROTISTAS GRUPO: PROTISTAS FLAGELADOS Euglena sp., Entosiphon sp., Peranema sp. BODÓNIDOS Bodo saltans, Pequeños flagelados COANOFLAGELADOS Coanoflagelados GRUPO: PROTISTAS AMEBOIDES AMEBAS DESNUDAS Mayorella sp., Familia Amoebidae AMEBAS TESTÁCEAS (con filópodos) Euglypha sp., Euglypha alveolata, Trinema sp. AMEBAS TESTÁCEAS (Incertae sedis) Arcella sp., Arcella hemisphaerica, Arcella vulgaris, Arcella gibbosa, Arcella arenaria, Arcella discoides, Pyxidicula sp., Hyalosphenia papilio, Hyalosphenia elegans, Difflugia elegans, Difflugia bacillifera, Centropyxis sp., Centropyxis aculeata ACTINÓPODOS Actinosphaerium sp., Actinophrys sp. GRUPO: PROTISTAS ALVEOLADOS HETEROTRICOS Stentor sp., Spirostomum sp., Spirostomum teres, Blepharisma sp. ESPIROTRICOS: HIPOTRICOS Y ESTICOTRICOS Hipotricos: Euplotes sp., Euplotes aediculatus, Euplotes affinis, Euplotes patella, Euplotes moebiusi, Aspidisca cicada (sinónimo de A. costata), Aspidisca sp., Aspidisca lynceus Esticotricos: Holosticha sp., Oxytricha sp., Parurosoma sp., Stylonychia sp., Stylonychia mytilus-complex LITOSTOMADOS Haptóridos: Paradileptus sp., Spathidium sp., Perispira sp. Pleurostomátidos: Litonotus sp., Litonotus fasciola, Litonotus crystallinus, Litonotus cygnus, Litonotus lamella, Acineria uncinata FILOFARÍNGEOS Y SUCTORES Filofaríngeos: Chilodonella uncinata, Gastronauta membranaceus, Trochilia minuta Suctores: Podophrya sp., Podophrya fixa, Solenophrya sp., Acineta sp., Tokophr- ya sp., Tokophrya infusionum, Tokophrya quadripartita, Tokophrya lemnarum, Periacineta sp. NASOFÓREOS Drepanomonas sp. COLPÓDEOS Colpoda ecaudata PROSTOMADOS Coleps sp., Prorodon teres, Plagiocampa sp., Holophrya sp. OLIGOHIMENÓFOROS Paramecium caudatum, Paramecium aurelia-complex, Paramecium bursaria, Uronema sp., Uronema nigricans, Cinetochilum margaritaceum, Cyclidium sp., Tetrahymena sp., Colpidium sp. Oligohimenóforos peritricos Complejo Vorticella convallaria, Vorticella gracilis (Complejo V. convallaria), Vorticella picta, Vorticella campanula, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella microstoma, V. alpestris (Complejo V. microstoma), Complejo Vorticella aquadulcis, Vorticella striata (Complejo V. aquadulcis), Carchesium sp., Epistylis sp., Epistylis chrysemydis, Epistylis plicatilis, Epistylis entzii, Epistylis procumbens (sinónimo de E. rotans), Campanella umbellaria, Zoothamnium sp., Opercularia sp., Opercularia microdiscum, Opercularia articulata, Opercularia minima, Opercularia solitaria (O. hebes), Vaginicola sp., Thuricola kellicottiana METAZOOS ROTÍFEROS Rotaria sp., Philodina sp., Lecane sp., Testudinella sp., Cephalodella sp. GASTROTRICOS Gastrotrico NEMATODOS Nematodo OLIGOQUETOS Aelosoma variegatum ARTRÓPODOS Copépodo y ácaro TARDÍGRADOS Tardígrado Tabla II: Listado de especiesmás usuales y su asignación a grupo (denominación vernacular)72 GBS

Capítulo 5.- Manual de trabajo. Técnica analítica. MANUAL PRÁCTICO PARA EL ESTUDIO DE GRUPOS BIOINDICADORES EN FANGOS ACTIVOS

by Water Chemistry and Microbiology Area on Dec 14, 2010

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