慢性乙肝治疗的策略分析  慢性乙型肝炎(CHB)在全球有 3.5 亿感染者,每年发生与慢性乙肝相关的肝硬化和肝癌,导致的死亡人数在一百万以上。在中国约有 1.2 亿慢性乙型肝炎感染者,这严重威胁着我国人民的生命健康和生活质量。经过几年来的临床治...
变,所以二者组成的体系所需要达到的稳定是发展变化的。即以数量和结构决定的双向选择,适者存在,不适者被改造或被淘汰。亦即以数量和结构决定的阴阳,平衡,相生相克。   结构相似的物体称为相似体。结构的组成包括其内所含的相似体的种类和数量,以及它们之...
胞和巨噬细胞。其中TLRs是现在被认为的最主要的识别病原相关的分子模式受体(recognizing pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs),目前发现的在人体中发现10种,老鼠11种。十种TLRs...
因子(TNF receptor-associated factor ,TRAF),白介素1受体相关激酶(IL-1 receptor-associated kinase ,IRAK), 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-ass...
位的不同等位基因之间的结构差异,可改变 HLA 分子的抗原结合槽的结构。由此造成不同 HLA 等位基因编码分子对各种抗原肽的结合具有选择性。分析从 HLA 分子抗原结合槽中洗脱下来的各种天然抗原肽的一级结构,发现这些抗原肽往往有两个或两个以上和...
在双向选择中使对方的结构发生改变的作用,称为排斥作用。   当病原成分与 TLRs 等 PRRs 识别结合后,结合的病原成分会诱导TLR 活化,依次活化 MAPK 依赖的或者 NF-kappaB 依赖的串连反应流,促发前炎症反应。这种反应包括各...
CD2 与 LFA3(CD58)的介导,与病原靶细胞之间的亲和力增强,通过释放穿孔素,脱颗粒,表达和分泌 Fas 配体,启动杀伤功能。另外细胞毒性 T 细胞还可分泌 TNF-β、IFN-γ等细胞因子,亦可杀伤病原靶细胞或治愈被感染细胞。但外周 ...
服从或近似服从正态分布。因此认为某一个 MHC-肽复合体与整个人体的全部 TCR 的亲和力呈正态分布。   在携带有抗原表位肽的 MHC-Ⅰ分子与 CTL 的 TCR 的衔接中,CD8的衔接被认为在幼稚 T 细胞的活化中是非常关键的因素, ke...
亲和力,但它们缺少与 T 细胞之间结合后的互动,不能像真正的 APC一样分泌细胞因子和表达更多的共刺激分子,进一步对 T 细胞进行结构改造。但这也有优点,它们可以用来检测实时体内和体外 T 细胞的亲和力状况,可以标准化。假设 tetramer ...
改变;在平衡常数之下时,结构轻微改变。结构明显改变包括成熟、活化、抑制、死亡和细胞分裂等。                 体系中的免疫双向选择   在 ELISPOT 试验中如果 T 细胞的阳性细胞频率太少,可以适当增加 DC 的浓度或者在一...
将明显改变,直到浓度亲和积≤K。群体平衡改造平衡常数在不同的双向选择双方中由于发生结合后的效应不同而有不同的名称:在抗原和 DC 的活化作用时称为静息活化平衡常数。       免疫双向选择的选择速度和排斥速度    选择速度是指双方从游离到结...
把 L1q1×L2q2/K 的比值称为活化势。活化势越大,选择速度越快。  排斥速度受多个方面的影响,一个 DC 细胞的成熟过程涉及其内部的或者内部与外部的多个双向选择和排斥体系,营养供应就是其中的一个问题。  每一个具体的双向选择的反应方程式...
另外,乙肝病毒还可从被感染细胞中释放 HBsAg、HbeAg 等游离抗原。                                       13乙肝病毒的复制达高峰时,在患者肝脏中每日至少可复制的病毒 10个,平均每个被感染的肝细胞...
汇管区界面性炎症和桥样坏死区,除 CD8+细胞外,有较多的 CD4+细胞和一定数量的单个核巨噬细胞,而在小叶内灶性坏死区则极大多数是 CD8+细胞。 慢性感染者肝内 CD8+T 淋巴细胞主要浸润于肝          HBV小叶,在小叶内炎性坏...
乙肝感染中的双向选择方程   在黑猩猩感染实验中,接种乙肝病毒后 7~8 周时,血液中HBV-DNA 水平在 4.3×108 到 3.4×109copies/ml 之间,一周后复制达高峰,此时 86%~99%的肝细胞 HbcAg 阳性,表明事实...
降速度。这被认为是 IFN-γ的非损伤性抑制病毒复制的作用。由于肝脏每秒超过 1.5L 血液流过, 24 小时之内有 108 个外周血淋巴细                 在胞通过肝脏。 由于肝窦的直径大概在 6~15um 之间,而相对于的淋...
脏移植可以跨越 MHC 的限制(19)。实际上,不使用免疫抑制药物成功进行肝移植的试验也有报道(20)。肝脏较心脏、肾等其它脏器移植,其排斥反应发生率低,且程度较轻。匹兹堡器官移植研究所的 QianS 等人最先在检测小鼠肝移植后移植物和受者脾脏...
体慢性病毒感染的高发器官的原因。最近有人报告活化的 CD8+T 细胞在到达肝脏后 18 小时发生调亡,另有有学者估计在慢性 HCV 感染,每天在肝脏要损失约 2 亿个 T 细胞,占全身淋巴细胞地 0.1%(22)                ...
CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞数明显多于正常肝组织(t=4.504,8.272,4.742,P 均<0.01),但明显少于免疫活动期患者(t=7.079,6.866,6.316,P 均<0.01). 免疫耐受期患者肝内 CD4+主要分...
功能。但(26) DC2 在 HBV-DNA<106 的病人比在 HBV-DNA>106 的病人的百分比要显着升高。从单核细胞来源的 DC(MDDC)像被 HBV 感染,与正常人相比,在 HBsAg 刺激时,细胞表面表达 HLA-DR 和 CD...
了抑制,外周血中乙肝病毒滴度(A)下降,被感染的肝细胞(F)及其感染程度降低,E 的数量和亲和力增加(32),ELISPOT 检测特异性T 细胞活性增强(33),但 E 和 F 之间的活化势降低,G 和 H 的流量减少,患者谷丙转氨酶(ALT)...
和糖皮质激素等免疫抑制药物一断时间后停药,病人的慢性乙肝会复发,甚至产生爆发性肝炎( 39)               ,出现病人死亡的情况。但耐受期的病人,可以通过停药后,使部分病人的 HBeAg 转阴,感染情况得到缓解。也有报道使用糖皮质...
CTL 流程中 DC 位置的重要性。转基因鼠动物实验中表明 DC 功能性缺陷是导致 T 细胞无能的重要机制(48)。在对人体临床用药中,拉米夫定(23)的使用可以使削弱的共刺激功能上升,增加 HLA-Ⅱ的表达,增强已经削弱的 Th1 反应。  ...
淋巴细胞会随时间而死亡。在清除的起始阶段,必须有足够数量的特异性的高亲和力的 T 细胞进入,杀死少量肝细胞,同时产生足够数量的细胞因子,以非溶细胞的方式清除或抑制整个肝脏的病毒的复制,大大降低 cccDNA 半衰期(17),减少肝细胞内的抗原产...
减少顺向选择时损失的肝细胞数量;另外只有这样才能保留足够的高群体亲和积的前体 DC,利用抗原冲击,一次才能在短时间内激活足够数量的特异性的高亲和力的 CD4+和 CD8+的 T 细胞(32),通过非溶细胞途径(13),抑制病毒复制。同时通过提高...
法,并且在使用免疫治疗前优先使用拉米夫定等核苷类似物抑制病毒复制,预先降低病人血液中病毒抗原的含量,能增强慢性乙肝治疗的疗效。这一策略已取得国内外大多数同行的一致认同,最近的动物和临床试验都已经证明其与实践的相互吻合(60-62)       ...
持续的抑制作用。另外,外周血中被感染的 DC 细胞低水平表达 MHC和共刺激分子(64),使得它们在与乙肝病毒特异性的 T 细胞群作用时,诱导活化的 T 细胞的比例将下降,而耐受和调节性 T 细胞产生的比例将升高。要解决这些错综复杂的局面,必须...
1~10 周为免疫系统重新格式化阶段, 周起为免疫治疗阶段。                      11  ①基因重组表面抗原抗体或者 RNA 干扰类药物(目前还没有上市的药物)或者有抑制病毒抗原表达的中草药(苦味叶下珠等)降低病人外周血中...
毒抗原的 DC 对乙肝病毒特异性的幼稚 T 细胞持续的选择作用。    ③在免疫系统恢复期和免疫治疗期间,都必须充分保证营养的供给,使患者的体液免疫和细胞免疫处于一个较好的水平,如果经口和胃肠道吸收不良或者不便时,应考虑静脉营养等方式,但应减少...
of     Dendritic     Cells.     Clinical     Medicine     &   Research.2005,Volume 3, Number 3: 166-175.4 CHRISTINA WEILER...
infection. PNAS,April 27,2004,Vol.101,No.17:6669-6674.16 Bumgardner GL,Li J,Apte S,et al.Effect of tumor necrosis   factor...
Zhonghua gan zang bing za zhi.2005 Jun;13(6):414-6.27 Soheila Tavakoli,Wibke Schwerin,et al. Phenotype and   function of m...
chronic hepatitis B. J Gastroenterol Hepatol. 1999   Aug;14(8):804-6.39 Arase Y. Acute exacerbation by reactivation of HBV...
12、www.51pdf.info13、www.xp.mo.cn14、www.dwc.net.cn45 Akbar SM, Furukawa S, Hasebe A, et al. Production and   efficacy of a ...
54 Szkaradkiewicz A, Jopek A, Wysocki J, et al. HBcAg-specific   cytokine production by CD4 T lymphocytes of children with...
63 γδT cell homeostasis is established in competition with   αβ T cells and NK cells .Jena D. French, Christina L. Roark, ...
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慢性乙肝治疗的策略分析

  1. 1. 慢性乙肝治疗的策略分析 慢性乙型肝炎(CHB)在全球有 3.5 亿感染者,每年发生与慢性乙肝相关的肝硬化和肝癌,导致的死亡人数在一百万以上。在中国约有 1.2 亿慢性乙型肝炎感染者,这严重威胁着我国人民的生命健康和生活质量。经过几年来的临床治疗和实验室研究,作者结合国内国外研究人员的研究成果和自己的实践经验,对慢性乙肝的发病机理进行了分析,初步认识了慢性乙肝的发生和发展规律,并提出慢性乙肝的治疗策略和方案,希望对攻克这一顽疾有所帮助。 免疫双向选择学说 为了更深入地理解疾病,特别是对慢性肝炎、艾滋病和肿瘤等病原体和病原细胞已知的疾病的理解,作者提出免疫双向选择学说:一、 生物体对进入体内的抗原、微生物、病原细胞或其它异体细胞 等的选择性排斥作用称为顺向选择;进入生物体的抗原、微生 物、病原细胞或其它异体细胞等对生物体的选择性排斥作用称 为反向选择;二、 人体中各种细胞和各种成分之间的双向选择作用中主动方的选 择性排斥作用为反向选择,被动方的选择性排斥作用为顺向选 择。 相互的选择性排斥作用将使对方的数量和结构(结构决定功能、性状等)发生改变,使二者组成的体系趋向于稳定。双方对对方的选择性排斥作用由各自的数量和结构决定,这种双向作用都将导致适者存在,不适者被淘汰或被改造适应,最终趋向于实现免疫双向选择平衡。由于各自的数量和结构均能被二者组成的体系之外的因素所改
  2. 2. 变,所以二者组成的体系所需要达到的稳定是发展变化的。即以数量和结构决定的双向选择,适者存在,不适者被改造或被淘汰。亦即以数量和结构决定的阴阳,平衡,相生相克。 结构相似的物体称为相似体。结构的组成包括其内所含的相似体的种类和数量,以及它们之间的相对位置和相对运动。结构内部的相似体之间的相对运动可导致相对位置的改变,从而使结构发生改变,也使其内部的相似体内部结构发生改变,超过一定界限时,生成新的相似体,发生数量改变。 免疫双向选择的选择性 免疫可广泛地分类为固有免疫和适应性免疫。 固有免疫(1)主要由自然杀伤细胞(NKs)、树突状细胞(DCs) 、巨噬细胞、γ/δT淋巴细胞、NKT细胞和B-1细胞组成,可固有地有选择性地识别和结合一些病原体的某些成分。它们对病原体的选择性结合作用主要由Toll样受体(TLRs) 、甘露糖受体(mannosereceptor,MR)、清道夫受体(scavenger receptor,SR)和NK活化受体这四种固有免疫受体介导,这些受体是在进化过程中发展的,可以选择性识别一大群病原体的固定结构,如革兰氏阴性菌的脂多糖(LSP)。其中TLRs主要在单核细胞、巨噬细胞、DCs、上皮细胞、肥大细胞和中性粒细胞表达;甘露糖受体主要在巨噬细胞、DCs、肝内皮细胞、肾小球膜细胞和气管平滑肌细胞表达;清道夫受体主要在巨噬细胞、DCs、某些内皮细胞和平滑肌细胞表达;NK活化受体主要分布在NK细
  3. 3. 胞和巨噬细胞。其中TLRs是现在被认为的最主要的识别病原相关的分子模式受体(recognizing pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs),目前发现的在人体中发现10种,老鼠11种。十种TLRs现在的结构、选择性识别配体、分子内的信号传导途径都已经知晓,并且已可分子克隆表达。TLRs能区别不同的微生物成分,这些保守分子模式为许多微生物所共有。如:TLR1和TLR2的异二聚体识别三酰基脂蛋白、TLR2和TLR6的异二聚体识别二酰基脂蛋白、TLR3识别双链RNA、TLR4识别脂多糖(LPS) 、TLR5识别细菌鞭毛、 TLR7/8识别单链RNA、TLR9识别细菌(CpG)DNA(2). 它们在在识别微生物成分中发挥重要作用,同时把固有性免疫和适应性免疫联系起来。TLRs主要分布于淋巴组织、白细胞等细胞表面,不同的TLRs在非淋巴组织也有不同程度的表达,其中抗原递呈细胞(APC)能表达多种不同的TLRs。树突状细胞(dendritic cell,DC)是存在于非淋巴器官和血液中形态及功能最为强大的抗原递呈细胞,在抗感染免疫、器官移植、自身免疫性疾病中发挥重要作用,是识别病原侵入的第一道防线。各种TLR在不同的DC亚群细胞上表达存在差异,使其能比较独特地识别某一类病原体成分,例如浆细胞样DC独特表达TLR9和TLR7,分别使浆细胞样DC对病毒CpG DNA和病毒单链RNA灵敏识别,但它们不表达TLR4,所以对LPS反应微弱(3)。所有的TLRs都有亮氨酸重复的结构域,都有同样的细胞内结构域和相似的细胞内信号传导途径。信号传递依次依靠一些接头分子(adaptor molecule) :髓样分化因子( myeloiddifferentiation factor 88 ,MyD88)或者肿瘤坏死因子受体相关
  4. 4. 因子(TNF receptor-associated factor ,TRAF),白介素1受体相关激酶(IL-1 receptor-associated kinase ,IRAK), 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6), 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein (MAP) kinases),和核因子κB( nuclear factor, (NF)-κB).另外如 NKT细胞表达有限多样性的TCR,并通过非经典的抗原提呈分子——CD1d识别抗原。NKT细胞在大部分的组织中含量较低,但是在肝脏中含量却很高,它识别的靶点是非肽类抗原如分支杆菌细胞壁的脂质和糖脂类成分(4) 。γ/δT淋巴细胞(5)可直接识别和结合:①感染后产生的热休克蛋白(heat-shock protein)或表达于受感染细胞表面的热休克蛋白;②感染后异常表达于受感染细胞表面的脂类抗原:CD1分子复合物;③某些病毒蛋白或表达于受感染细胞表面的病毒蛋白,如疱疹病毒和牛痘病毒糖蛋白等;④分枝杆菌产生的小磷酸化非肽分子,如磷酸糖和核酸衍生物。这些都表明固有免疫中细胞和细胞表达分子与病原成分之间的相互作用具有较强的选择特异性。 适应性免疫是脊椎动物所独有的,是基因重排的结果,其受体识别和结合单个病原体表达的某一个表位。适应性免疫主要由抗原递呈细胞(APCs)包括 DCs 和巨噬细胞、TCD4+和 TCD8+、B 淋巴细胞组成。适应性免疫主要体现在对 MHC 的依赖,MHC 以其产物结合并提呈抗原肽供 TCR 识别,首先涉及 MHC 分子与抗原肽的结合。1 类分子凹槽接纳 8~10 个氨基酸残基的抗原肽,而 2 类分子凹槽接纳 13~17个氨基酸残基的抗原肽。由于在群体中的个体 MHC 不同座位或同一座
  5. 5. 位的不同等位基因之间的结构差异,可改变 HLA 分子的抗原结合槽的结构。由此造成不同 HLA 等位基因编码分子对各种抗原肽的结合具有选择性。分析从 HLA 分子抗原结合槽中洗脱下来的各种天然抗原肽的一级结构,发现这些抗原肽往往有两个或两个以上和 MHC 分子槽相结合的特定部位,称锚定位,该位置的氨基酸残基称为锚定残基。而且,能够和同一类 MHC 分子结合的抗原肽,其锚定位和锚定残基往往相同和相似(6)。活化的 DC 除 MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子表达增高外,共刺激分子和细胞因子表达和分泌也增高,通过 CD80/86- CD28、CD72-CD5、CD40- CD40L、MHC2 肽-TCR 和 CD4 复合体、ICAM1- LFA1、LFA3- CD2等分子的介导,而发生相互的识别结合作用。活化的细胞毒性 T 细胞(CTL)与靶细胞之间通过 MHC-I-肽与 TCR,LFA-1 与 ICAM-2,CD2与 LFA3(CD58)等分子的介导而识别活化。这些都表明适应性免疫中细胞间的分子相互作用同样具有较强的选择特异性。 在人体综多复杂的成分中,固有免疫和适应性免疫中病原、免疫细胞、免疫细胞表达分子以及免疫信号的传递过程中的分子之间的相互作用都表现出了非常强的选择性。同样在人体其它的生理生化反应中各种分子成分也表现了同样的独特的相互选择性, DNA 合成中的 如碱基配对 A-T、G-C,翻译过程中核糖体和转录 RNA 的相互作用等等。随着研究的深入,对人体中这种由结构决定的选择特异性的认识将越来越明朗。 免疫双向选择的排斥作用
  6. 6. 在双向选择中使对方的结构发生改变的作用,称为排斥作用。 当病原成分与 TLRs 等 PRRs 识别结合后,结合的病原成分会诱导TLR 活化,依次活化 MAPK 依赖的或者 NF-kappaB 依赖的串连反应流,促发前炎症反应。这种反应包括各种细胞因子、趋化因子的分泌,还有包括防御素在内的多种广普抗病原物质的分泌(7)。细胞因子IFN-α/β 和 IL-12 等细胞因子分泌增加,IFN-α/β 能直接起到抗病原体的作用,而 IL-12 可作为 Th1 细胞的活化提供第三信号分子。同时结合的病原成分还会引起细胞胞饮和吞噬功能增强,细胞表面的TLRs 和共刺激分子的表达水平增高。抗原对 APC 的排斥作用主要是使它们的结构发生改变,功能活化,出现吞噬和吞饮功能增强,抗原提呈功能增强,MHC-1 和 2 类分子、共刺激分子和细胞因子表达和分泌增高,抗体分泌功能增强,通过消化、中和等作用使抗原浓度降低,以达到对抗原的排斥作用。 被激活的 DC 开始由非淋巴器官到二级淋巴器官的移位,并且同时抗原提呈功能逐渐增强,表达共刺激分子和主要组织兼容性抗原分子(MHC)另外分泌大量细胞因子和趋化因子启动和/或增强许多 T 和B 淋巴细胞反应,包括( 3) :①诱导 Th0 淋巴细胞的Ⅰ型和Ⅱ型分化;②CD8+T 淋巴细胞活化和增强毒性淋巴细胞活性;③B 淋巴细胞成熟,Ig 类型转换和抗体产生。在细胞的相互作用的同时 T 淋巴细胞表面的各种分子也能使 DC 细胞活化和/或成熟。 细胞毒性 T 细胞的生成,活化后的 CTL 细胞表面的 TCR、LFA-1和 CD2 等分子的表达增高,通过 MHC-I-肽与 TCR,LFA-1 与 ICAM-2,
  7. 7. CD2 与 LFA3(CD58)的介导,与病原靶细胞之间的亲和力增强,通过释放穿孔素,脱颗粒,表达和分泌 Fas 配体,启动杀伤功能。另外细胞毒性 T 细胞还可分泌 TNF-β、IFN-γ等细胞因子,亦可杀伤病原靶细胞或治愈被感染细胞。但外周 T 细胞被抗原或超抗原激活后会克隆扩增,发挥效应机制,而随后大部分活化的 T 细胞均会死亡,这一过 程 称 为 活 化 诱 导 的 细 胞 死 亡 ( activation induced celldeath,AICD)。可见病原靶细胞也同时诱导活化的细胞毒性 T 细胞的结构改变,而使其死亡。 免疫细胞的成熟和活化,靶细胞和活化细胞的死亡,信号的分子传导都是一种结构的明显改变过程。这种改变都是由双向的排斥作用介导的。排斥作用使个体结构发生明显改变后,这个个体就会脱离原来的二者组成的体系,使这个二者组成的体系发生数量改变。 免疫双向选择的选择亲和力和排斥作用 细胞或各成分间的双方的亲和作用是发生排斥作用的基础,排斥作用的完成必须先由选择性亲和力介导。所以决定双方特异亲密接触的亲和力是至关重要的。 由 MHC-肽复合体的形成机制可知,这样形成的 MHC-肽复合体将具有不同的亲和力,又由于 TCR 分子的结构多种多样,势必导致它们之间结合时表现不同的亲和力。一般说来,若影响某一数量指标的随机因素很多,而每个因素所起的作用都不太大,则这个指标服从正态分布。人的生理特征的量:身高、体重等;农作物的收获量等等,都
  8. 8. 服从或近似服从正态分布。因此认为某一个 MHC-肽复合体与整个人体的全部 TCR 的亲和力呈正态分布。 在携带有抗原表位肽的 MHC-Ⅰ分子与 CTL 的 TCR 的衔接中,CD8的衔接被认为在幼稚 T 细胞的活化中是非常关键的因素, kerry SE 但等(8)发现即使是没有 CD8 分子的参与,只要通过改变肽-MHC(pMHC)/TCR 复合体中短肽而获得足够的亲和力,幼稚的 T 细胞也同样能被活化,在早期的信号传导和晚期的功能活性方面都和有 CD8 是一样。由此可见亲和力的介导并不要求严格的结构特异性。 对于两个细胞之间的亲和力与它们之间表面的分子结构有关外,还与它们的表达量有关。当细胞表面的 TCR-肽-MHC 分子数量太少时,细胞也会表现不活化。同时介导亲和力的分子一般由多种共刺激分子组成,当它们之间的相对和绝对数量不同时可形成不同的亲和力。所以这就决定了细胞间活化具有特异性和非特异性。它们之间这种由介导分子的数量和结构决定的亲和力有一个活化域值。假设细胞表面特异性结合分子的总亲和力为 q,双方 q1 与 q2 的乘积称为亲和积。那么它们之间的亲和积有个平衡改造域值:q1×q2=K(K 为个体亲和积,又称个体平衡改造平衡常数,与物种、遗传、年龄、体温、营养状况等有关)。当 q1×q2>K 时,对结构的改造加剧,结构明显改变。如果某一个 DC 与 Th 的相互作用时 q1×q2>K,那么 Th 活化,或者 DC和 Th 同时活化;如果 DC 与 Th 的相互作用时 q1×q2≤K,那么 DC 和Th 都不活化,但并不是它们的结构不发生改变,只是改变不明显罢了。tetramer 能对 T 细胞 TCR 或 TCR-CD3、CD4 或 CD8 复合型表现出
  9. 9. 亲和力,但它们缺少与 T 细胞之间结合后的互动,不能像真正的 APC一样分泌细胞因子和表达更多的共刺激分子,进一步对 T 细胞进行结构改造。但这也有优点,它们可以用来检测实时体内和体外 T 细胞的亲和力状况,可以标准化。假设 tetramer 的亲和力是 q,只要 T 细胞的亲和力大于 k/q,那么这样的 T 细胞就能被检测得到。ELISPOT涉及细胞培养,细胞在体外的亲和力会发生改变,主要是升高。而tetramer、ELISPOT、细胞内细胞因子染色示三种检测有一致性的结果(9),说明亲和力的大小与功能是一致的,同时也说明 T 细胞的特异性亲和力大小的细胞频率呈正态分布。体外的 ELISPOT 如果不考虑取血、细胞分离和体内体外微环境改变对细胞的影响,不考虑 K 值的改变,ELISPOT 技术检测到的 T 细胞频率从理论上包括三部分组成,一部分是在体内活化的 T 细胞,一部分是体内成熟的,另一部分是体内不成熟的体外培养成熟的,这都取决于 T 细胞 TCR 及其它黏附分子的表达变化。所以从亲和力理论上来说,tetramer 和 ELISPOT 能检测到体内亲和力已经成熟的和还没有成熟的,但成熟了的 T 细胞在体内不一定在行使功能,还必须对方也有足够亲和力,并且有相互作用的机会。同时亲和力是相对作用双方的,同一个 APC 在与抗原的双向选择中表现出来的亲和力与其与 Th 细胞作用是不一样的。 同时,在抗原刺激 APC 细胞的过程中,可能它们之间的亲和积低于活化域值,细胞并不出现较大的结构改变而走向成熟,但可能某个刺激分子配体和受体之间所引起的信号传导已经发生,使细胞内部结构发生改变。双方亲和积在个体平衡改造平衡常数之上时,结构明显
  10. 10. 改变;在平衡常数之下时,结构轻微改变。结构明显改变包括成熟、活化、抑制、死亡和细胞分裂等。 体系中的免疫双向选择 在 ELISPOT 试验中如果 T 细胞的阳性细胞频率太少,可以适当增加 DC 的浓度或者在一定范围内增加抗原的量增加抗原浓度来达到提高阳性频率的目的。在人体的疫苗注射中,同等剂量的疫苗注射在淋巴结内、皮下会比静脉效果好,这是为什么?因为在个体的静息活化域值的限制下,由于二者必须有亲密接触的机会,这是一个概率问题,与双方的浓度有关。在同等计量的用量时,血液给药,很快被稀释;而淋巴结引流区前体 DC 丰富,浓度也较高,在亲和力不变的情况下,抗原和前体 DC 细胞结合的几率最高;即使在浓度相同时,由于 DC 在淋巴结引流区中浓度高,这种概率也更高,所以淋巴结引流区较高,而血液小。在一个细胞群体中,一方的亲和力往往也不全相同。也认为群体的亲和力符合正态分布。设一方个体浓度为 L,单个个体的亲和力为 q,具有相同亲和力的个体数量为 a,那么一方的浓度亲和力为 L = ( a1q1+a2q2+…………anqn ) /V; 平 均 个 体 亲 和 力 为 : q =(a1q1+a2q2+…………anqn)/(a1+a2+…………an) 。在个体亲和积的基础上,体系中双方达稳定平衡时,由概率决定的群体有此时有L1q1×L2q2=K (K 为群体亲和积,为群体平衡改造常数,与物种、遗传、年龄、营养状况等有关),称为群体平衡改造平衡常数,类似溶解沉淀平衡常数。当双方的浓度亲和积>K 时,双方的数量和结构都
  11. 11. 将明显改变,直到浓度亲和积≤K。群体平衡改造平衡常数在不同的双向选择双方中由于发生结合后的效应不同而有不同的名称:在抗原和 DC 的活化作用时称为静息活化平衡常数。 免疫双向选择的选择速度和排斥速度 选择速度是指双方从游离到结合的浓度/数量的改变快慢;排斥速度是指使对方结构发生改变的快慢。 选择的浓度(L),单位:个;选择速度(S)是指一方对另一方选择作用后,另一方的单位时间内的浓度消耗,单位:个/毫升·秒。在人体中,很多分子、细胞等结构的数量处在一个动态平衡之中,不只是有消耗量,还会有新生量。设新生浓度速度为 N。 这样在人体一个反应体液容积一定的双向选择体系中,设定反应双方 A 和 B,其反应产物为 C(或者还有另外的产物 D) ,例如以 A 表示新生的 DC 前体细胞,以 B 表示抗原,C 表示负载有这种抗原的成熟 DC,那么在人体中这就是一个单向的反应。 A + B C 如果 Sa=Na 时,称为单极免疫双向选择平衡;如果 Sa=Na,且Sb=Nb 时,称为双极免疫双向选择平衡。双极免疫双向选择平衡为稳定的平衡。选择速度与亲和力、体流速度等有关。选择速度与选择双方的浓度亲和积的乘积正相关,S=k·L1q1×L2q2,类似化学反应速 a b度方程式 V=kA B ,实际上它们是同一个问题,都有被概率决定的因素。当双向选择双方处于 L1q1×L2q2>K(K 为平衡改造平衡常数)的情况,此时单位时间双方出现结合的概率增加,发生改造的次数增加,
  12. 12. 把 L1q1×L2q2/K 的比值称为活化势。活化势越大,选择速度越快。 排斥速度受多个方面的影响,一个 DC 细胞的成熟过程涉及其内部的或者内部与外部的多个双向选择和排斥体系,营养供应就是其中的一个问题。 每一个具体的双向选择的反应方程式只能通过实验找出其具体表达方程式,选择和排斥速度只能通过实验获得。微生物进入人体,人体的免疫反应是一个由多个联串的大结构上的免疫双向选择连接的,在这些一联串的环环相扣的双向选择体系中,每个双向选择的选择速度和排斥速度决定的产物流量都势必影响到其最终的结局。疫苗的预刺激,能加快以后再次遇到类似抗原的选择和排斥速度。 慢性乙肝中的免疫双向选择 乙肝病毒感染中双向选择的三方主体 免疫系统 (DC CD8+T) (Dane 颗粒) (肝细胞) 乙肝病毒抗原系统 人体被感染细胞 乙肝病毒进入人体后,HBV 以其外膜蛋白的前 S1 区与肝细胞的受体结合,进入肝细胞内复制。乙肝病毒在肝细胞内的复制产物经重新组装后释放入血,进入细胞外液,称为 Dane 颗粒。Dane 颗粒中含有表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HbcAg)、DNA 多聚酶、HBV-DNA。
  13. 13. 另外,乙肝病毒还可从被感染细胞中释放 HBsAg、HbeAg 等游离抗原。 13乙肝病毒的复制达高峰时,在患者肝脏中每日至少可复制的病毒 10个,平均每个被感染的肝细胞的日产量有 200~1000 个,患者血液中 10Dane 颗粒中 HBV-DNA 的浓度峰值每毫升可高达 10 基因组当量(10) ,Dane 颗粒具有再感染其它细胞的能力。 的细胞嗜性取决于该种细 HBV胞是否有接受其外膜蛋白的表面受体,是否有支持病毒复制的细胞因子及其数量的多寡。运用原位杂交技术,可在外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结、脾脏、肾、皮肤等肝外组织中检测到少量病毒 DNA。乙肝病毒主要还是感染肝细胞。各种抗原均可被单核-巨噬系统和内皮系统的吞噬,同时能将病毒抗原成分递呈给 T 细胞,进而激发特异性T 细胞免疫反应。活化的固有和适应性免疫细胞如 DC、巨噬细胞、Th1、Th2、CTL、NK、NKT、B 细胞等均可对感染的细胞进行攻击,清除被感染的细胞。目前研究人员普遍认为细胞免疫反应在介导病毒清除和疾病病理的关键因素(11).患急性自限性 HBV 感染的病人特征性地表现出剧烈的、多克隆的和多特异的 Th 和 CTL 应答,这种应答针对HbeAg 抗原表位、核衣壳以及在外周循环中可测定到的多聚酶蛋白。HLA-1 限制的 CTL 针对外膜核壳和聚合酶的多个病毒表位,即 CTL 是多克隆和多特异的。即使某个抗原发生变异,亦难有免疫逃逸。急性乙型肝炎的病变特征是小叶内淋巴细胞浸润、肝细胞变性和灶性坏死。T 淋巴细胞是最主要的肝内炎症细胞,T 细胞系中主要为 CD8+者,CD4+/CD8+比值在汇管区约 0.85,小叶内约 0.2、灶性坏死区约 0.15,提示 CTL 是肝细胞损伤的主要效应细胞。慢性乙型肝炎在
  14. 14. 汇管区界面性炎症和桥样坏死区,除 CD8+细胞外,有较多的 CD4+细胞和一定数量的单个核巨噬细胞,而在小叶内灶性坏死区则极大多数是 CD8+细胞。 慢性感染者肝内 CD8+T 淋巴细胞主要浸润于肝 HBV小叶,在小叶内炎性坏死灶及窦周炎部位增多明显,而 CD4+T 淋巴细胞主要浸润在汇管区,与国内外报道的慢性乙肝的 CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞肝内浸润状况基本一致 (12)。说明小叶内炎症和灶性坏死主要是 CD8+细胞诱导的细胞毒效应。在黑猩猩感染实验中,进一步实验证实 CD8+T 淋巴细胞在病毒清除中比 CD4+T 淋巴更关键的作用(13),这与组织学检查结果也是一致的。 Robert Thimme 等(14 )在论文中写道: “非常值得注意的是,使用同样的检测方法,肝内浸润的病毒特异性的 CD8+T 细胞能被检测得到,而外周血中的只有通过体外病毒特异性多肽预刺激后才能检测得到。”作者把这种由于肝脏特殊的结构,而使各种产生的细胞因子浓度高,诱导通过的淋巴细胞高表达 TCR 和黏附分子,而使亲和力增强,被感染的肝细胞表面的 MHC-病毒的抗原表位肽复合体,黏附分子,抗原等对敏感的成熟的效应细胞的亲和力增强,当血液通过肝脏时,使得这些效应细胞在肝脏中被吸附,而使血液中很少出现这样的效应细胞,甚至没有的现象,这与物质的分离纯化作用亲和层析机制相似,称为亲和层析现象。这种现象在 CD4+T 细胞上则表现不如CD8+T 细胞明显。这也从一个侧面反应了被感染的肝细胞对于 T 细胞的选择亲和力更侧重于 CD8+T 细胞。
  15. 15. 乙肝感染中的双向选择方程 在黑猩猩感染实验中,接种乙肝病毒后 7~8 周时,血液中HBV-DNA 水平在 4.3×108 到 3.4×109copies/ml 之间,一周后复制达高峰,此时 86%~99%的肝细胞 HbcAg 阳性,表明事实上整个肝脏已被完全感染,但基因检查发现,在感染的 7~8 周内,HBV 并没有引起感染部位的固有免疫反应(15),直到 8 周左右适应性免疫发起攻击。乙肝病毒的清除明显呈两个阶段。第一阶段由一群高亲和力的 MHC 限制的α/βT 细胞进入肝脏,它们杀死一些感染细胞,释放IFN-γ、TNF-α等大量细胞因子,引起大量的基因表达,增强抗原处理递呈能力,明显上调肝细胞 HLA-Ⅰ和 ICAM-Ⅰ分子( 16)的水平,HLA-Ⅱ分子也有少量细胞表达。IFN-γ能诱导多种抗病毒的基因表达,抑制病毒复制。在这之后的 4~6 周(17)之内,病毒核酸下降了 8~50 倍,其下降速度明显快于肝细胞 HBcAg 阳性细胞阳性率的下
  16. 16. 降速度。这被认为是 IFN-γ的非损伤性抑制病毒复制的作用。由于肝脏每秒超过 1.5L 血液流过, 24 小时之内有 108 个外周血淋巴细 在胞通过肝脏。 由于肝窦的直径大概在 6~15um 之间,而相对于的淋巴细胞 7~12um 的直径,当淋巴细胞通过肝窦时,必然会紧贴内皮细胞,甚至挤压内皮细胞(4)。但由于肝脏的特殊结构,在肝窦中血流较慢,造成高细胞因子的环境,IL-2、IFN-γ、TNF-α都能使路过淋巴细胞 TCR 和黏附分子表达增强。这样原本 TCR 低亲和的 T 细胞群由于 T 细胞表面的 TCR、黏附分子数量增多, 同时肝细胞 HLA-Ⅰ和 ICAM-Ⅰ分子的数量也同时增多,它们之间就表现出平时所没有的高亲和积。这样就有更多的 T 细胞被活化了,特别是 CD8+的 T 细胞,它们表现出像第一阶段的高亲和力的 T 细胞一样的功能,通过溶细胞机制和非溶细胞机制抑制病毒复制,杀伤和治愈被感染的肝细胞。这种情况也类似地发生于巨噬细胞、NK 细胞、γ/δT 细胞等固有免疫细胞,导致了第二阶段肝脏的大规模的淋巴细胞浸润。在这一阶段,更多的HBcAg 阳性细胞的依靠溶细胞作用而清除,伴随血清转氨酶达高峰。第二阶段在 14~16 周达高峰,这一阶段的清除活动相对于第一阶段的清除活动,对于取得稳固的血清 HBV-DNA(A)下降是更为关键的。当 A 下降后,C 的流量降低,继发 Th 和 E 的下降。国外报道:28 例急性肝炎病人在发病后 4~8 周内外周血 HBc 特异性 CD4+T 细胞应答突然降低(18)。这是高消耗,低补给的双重结果。 在肝移植中供受体选配可以不若其它同种器官移植那样严格,临床上一般仍作细胞抗原(HLA)配型,但都不具有实际临床意义。肝
  17. 17. 脏移植可以跨越 MHC 的限制(19)。实际上,不使用免疫抑制药物成功进行肝移植的试验也有报道(20)。肝脏较心脏、肾等其它脏器移植,其排斥反应发生率低,且程度较轻。匹兹堡器官移植研究所的 QianS 等人最先在检测小鼠肝移植后移植物和受者脾脏中淋巴细胞 CTL 活性时发现,直接从移植肝中分离出来的非实质细胞(nonparenchymalcells,NPC)的 CTL 活性在术后第 4~7 天达高峰,术后 14 天起开始下降,随后恢复至正常水平。这种移植肝浸润淋巴细胞表现出的 CTL活性由强到弱的过程,与前述的肝移植手术后的病理学变化相当吻合。 为了明确移植肝内浸润淋巴细胞的转归, 研究人员利用原位 TUNEL检测调亡的发生。结果发现,与同系小鼠肝移植在术后第 4、7、14天仅表现出轻微的炎症性细胞浸润相比,同种异体肝移植肝中有大量的炎症细胞浸润。TUNEL 检出的调亡细胞在术后第 4 天开始出现,至术后第 7 天数量开始增加,随后 TUNEL 阳性的细胞数量逐渐减少,至术后 60 天左右仍有少量的调亡细胞可能检出。与此形成对比的是调亡的肝实质细胞在任何时候检测数量均很少,术后第 7 天时,数量少于调亡淋巴细胞的 1/3。而在同系肝移植物中,调亡的浸润性 T 细胞及实质细胞的数量始终很少。证明移植物浸润性细胞的原位调亡是肝移植耐受的机制之一(21)。这样,由于肝细胞庞大的数量和强大的分裂增生能力,使得供体肝脏在与受者免疫系统的较量中,比心脏、肾等更具优势地位,它能通过反向选择将与其有较大亲和力的免疫细胞通过诱导其活化到死亡,从而大大降低了排斥反应。同样,在被乙肝病毒感染的肝脏,这种机制同样会起作用。这就是为什么肝脏是人
  18. 18. 体慢性病毒感染的高发器官的原因。最近有人报告活化的 CD8+T 细胞在到达肝脏后 18 小时发生调亡,另有有学者估计在慢性 HCV 感染,每天在肝脏要损失约 2 亿个 T 细胞,占全身淋巴细胞地 0.1%(22) 。这样 E 的数量和补给速度于 F 的数量和补给速度对于乙肝病毒和宿主之间的相互的双向选择的结果是起到决定性的作用。 在乙肝病毒进入人体几个月大量复制后,人体才产生特异性细胞免疫反应。在黑猩猩实验中特异性细胞免疫反应 7 周左右才启动。这可能与病毒抗原与人体 DC 细胞亲和积低有关。在 A 与 B 的双向选择中,要使 A 和 B 的浓度亲和积大于平衡改造平衡常数,需要 A 的浓度超过一定的限度。而 A 的浓度又与 F 的数量和感染程度正相关。如果在感染人群中,达到平衡改造平衡常数时的 HBV-DNA 越高,C 的出现越晚,此时肝细胞被感染的程度也越高,在进一步的 HBV-DNA 攀高的过程中,相同的 HBV-DNA 水平下,活化势越低,C 的流量也越低,如果 C 的流量与 E 的流量正相关的话,乙肝病毒的感染结果可能出项以下三种比较典型的情况:①在乙肝病毒逐步扩大感染肝细胞数量时,在肝细胞感染数量少的情况下,免疫系统的效应细胞流量达高峰且流量大,出现无症状清除;②在肝细胞感染数量大的情况下,免疫系统的效应细胞流量达高峰且流量大,则发生急性肝炎或者爆发性肝炎;③在肝细胞几乎完全感染,而免疫系统的效应细胞流量迟迟未达高峰而流量较低,则出现一过性转氨酶升高后,进入长达十年二十年的低效应细胞流量的免疫耐受期。 在慢性乙肝免疫耐受的病人中,组织学检查示(12)肝内浸润的
  19. 19. CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞数明显多于正常肝组织(t=4.504,8.272,4.742,P 均<0.01),但明显少于免疫活动期患者(t=7.079,6.866,6.316,P 均<0.01). 免疫耐受期患者肝内 CD4+主要分布在汇管区,肝小叶内仅零星分布几个,均稍多于正常肝组织(P<0.05),但明显少于免疫活动期患者(P<0.01)免疫耐受期患者肝小叶内及汇管区 CD8+细胞明显少于免疫活动期患者(P<0.01),但明显多于正常肝组织(P<0.01)。这说明慢性乙肝耐受期的病人肝内少量的高亲和力 E 的流量,它们也能低水平发挥像急性肝炎中第一阶段作用,但引起的第二阶段的作用和第一阶段无明显增强。这说明 C 也处于一个低流量,间接的认为 B 处于一个低的生理补给流量。但由于 F 的数量和高的补给速度(10),使得 E 的流量对完全清除病毒无能为力,此时 E 的流量等于 G 的流量。慢性乙肝患者肝脏内的淋巴细胞浸润,出现虽然不成功,但持续进行着试图清除感染的炎症反应,从而出现持续的免疫介导的肝脏疾病。并最终耗竭肝脏的再生能力。星形细胞转化为分泌胞外基质的细胞,并发展为肝纤维化和肝硬化。 乙肝病毒颗粒可以引起单核细胞来源的 DC 产生 IL-2,TNF-α、IFN-γ(23),其核衣壳可通过巨噬细胞表面的膜硫酸乙酰肝素,还有 TLR2 的介导,使其强烈产生多种细胞因子(24)。但在慢性乙肝病人外周血中,髓样 DC(DC1)和浆细胞样 DC(DC2)的数量和功能都有不同程度的改变,与正常人相比,DC1 前体细胞的共刺激分子表达降 低 ( 25 ) 削 弱 自 身 混 合 淋 巴 细 胞 反 应 (autologous mixed ,lymphocyte reaction, AMLR)能力,同时降低 DC2 前体细胞的数量和
  20. 20. 功能。但(26) DC2 在 HBV-DNA<106 的病人比在 HBV-DNA>106 的病人的百分比要显着升高。从单核细胞来源的 DC(MDDC)像被 HBV 感染,与正常人相比,在 HBsAg 刺激时,细胞表面表达 HLA-DR 和 CD40减少,IL-12P70 的分泌减少,但对 LPS 的反应跟正常人无明显差别(27)。MDDC 与 T 细胞的相互作用减弱,在活跃复制的病人中更为明显,表现在 DC 没有增加 HLA-Ⅱ、B7 分子的表达和 IL-12 的分泌,用HBsAg 刺激时,诱导 T 细胞对 HBsAg 的增值、产生细胞因子和毒性 T细胞产生均失败( 28)。这说明病人体内的 DC 的数量和结构都出现了不同程度的改变,对乙肝抗原的亲和力选择性减低。但是在细胞因子诱导成熟后(27),表位肽长时间刺激后(29),加用 Poly(I:C)后(30),病人的 DC 并没有明显的缺陷。这说明在体外能诱导 DC 细胞成熟,能表达足够的 HLA-Ⅱ、B7 分子以增加亲和力来行使其功能。但也有报道(31),慢性乙肝患者 DC1 成熟时表达 CD80 和 CD86 的阳性百分率比正常人显着减低,共刺激能力低下,但 DC2 没有差别。这说明慢性乙肝病毒对 DC 的结构影响是普遍的和深远的。在高浓度的HBV-DNA 作用下,同一体系内的 DC 的数量和结构的改变是不可避免的。 临床中可以通过两类药物的对双向选择方程进行影响,它们是核苷类似物和免疫抑制剂。在核苷类似物中,拉米夫定是较为常用的,拉米夫定通过影响 F 和间接影响 A 起作用。因为 A 与 B 以及 E 与 F 之间存在平衡改造平衡常数,所以 B 和 E 的数量和结构也会随 A 和 F 的数量和结构改变而改变。病人在使用拉米夫定后,乙肝病毒复制得到
  21. 21. 了抑制,外周血中乙肝病毒滴度(A)下降,被感染的肝细胞(F)及其感染程度降低,E 的数量和亲和力增加(32),ELISPOT 检测特异性T 细胞活性增强(33),但 E 和 F 之间的活化势降低,G 和 H 的流量减少,患者谷丙转氨酶(ALT)恢复正常。由于伴随 A 下降,B 的数量和群体亲和力增加(23),但 A 和 B 之间的活化势减小,C 的流量减小,从而使 E 最终减小,ELISPOT 检测特异性 T 细胞活性减低,在使用至 6 个月的时候,部分患者出现病毒开始变异,外周血中病毒滴度增加(34)。但患者停药后,F 和 A 同时增大,而 B 处于一个相对较大的群体亲和积,C 的流量猛然增大,E 的流量继发增大,最后与处于一个峰值的 F 相遇,二者处于一个高的活化势,导致大量的被感染肝细胞被破坏,所以拉米夫定停药后也容易复发,甚至病情更加严重,出现肝功能失代偿而导致死亡(35)。所以也有报道部分研究人员使用拉米夫定,中断 2 周后,再继续服用,疗效有一定改进(36),还有报道短期使用拉米夫定(37),然后停用,大部分病人转氨酶升高,也取得了 HBeAg 转阴、HBV-DNA 显着降低的较好的疗效。这种现象称为拉米夫定效应。 免疫抑制剂可通过激活诱导细胞凋亡(AICD)等途径作用于 B和 E,使得它们的群体亲和积减小,而使 A 和 F 的群体亲和积增大,使用糖皮质激素后,HBV-DNA 升高(38)。当停药后,B 和 E 的补给流量增大,使得活化势增大,C 的流量增大,进一步增大 E 的流量,最后与处于一个峰值的 F 相遇,二者处于一个高的活化势,导致大量的被感染肝细胞被破坏。所以有乙肝病毒感染的病人使用 OKT3、 ATG
  22. 22. 和糖皮质激素等免疫抑制药物一断时间后停药,病人的慢性乙肝会复发,甚至产生爆发性肝炎( 39) ,出现病人死亡的情况。但耐受期的病人,可以通过停药后,使部分病人的 HBeAg 转阴,感染情况得到缓解。也有报道使用糖皮质激素停药后联用拉米夫定(38,40)或α-干扰素(41)取得了较好疗效。这种现象称为免疫抑制效应。 Zhang XH 等报道从停用拉米夫定到病情复发的时间中位数为三个月(34),但在乙肝感染的潜伏期 CTL 启动到临床症状期至少相差4 周以上(42),而在 Stefan F,et al(17,43)的黑猩猩动物实验中 CH1627 的血液中 HBV-DNA 在第 8 周达高峰,而第 8 周时转氨酶还处于正常值,但在 12 周时 ALT 已经大幅升高,此时血液中的 HBV-DNA已经大幅降低,与人体临床急性感染过程十分相似,同时这也与拉米夫定停药后的发病过程在时间上有很大的一致性,有理由认为拉米夫定停药后与一次新发的急性感染在发病过程是一致的。但由于肝细胞已经被完全感染,从理论上认为其出现②和③的情况最为可能,这与临床是一致的。免疫抑制效应也是如此。 实验室检查表明乙肝病毒感染可能使 DC 在表型和功能上有少许改变(27),在种群类别和数量上有改变(44),但它们激活抗病毒的Th 的能力并没有受到显着的影响(27,29)。绝大部分慢性乙肝病人肝内淋巴水平浸润和大部分慢性乙肝病人自动进入活动期、拉米夫定效应、免疫抑制效应都说明了慢性乙肝患者体内的免疫系统的功能是完好的。临床使用同源的树突状细胞疫苗,在动物(45,46)和人体(47)使用中比使用抗原的效果明显要好,这说明在抗原、 和 Th1、 DC
  23. 23. CTL 流程中 DC 位置的重要性。转基因鼠动物实验中表明 DC 功能性缺陷是导致 T 细胞无能的重要机制(48)。在对人体临床用药中,拉米夫定(23)的使用可以使削弱的共刺激功能上升,增加 HLA-Ⅱ的表达,增强已经削弱的 Th1 反应。 在无复制的慢性乙肝病人肝内 HBV 特异性的 CD8+T 细胞出现频率较高,其绝对数与大量浸润的活动性肝炎相近(49);在急性感染后完全恢复的病人中对 HBV 敏感的 T 细胞在数年后仍有很强的抗病毒T 细胞应答(50);有自然免疫力的患者,其血清及外周血单个核细胞(PBMC)中用 PCR 法可检出 HBV-DNA,在 PBMC 中也可发现 CD69+(近期复制标志)和细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL) (51)。这提示,HBV低水平复制受活跃的 CTL 控制。由此可见活跃的细胞免疫在乙肝病毒的清除和防止乙肝病毒再次启动复制都是至关重要的。 根据被感染肝细胞的亲和力与免疫系统效应细胞的亲和力的关系,可将慢性乙肝感染的三期和急性感染的病程统一起来,称为被感染肝细胞反向选择主导期,双向选择活跃期,免疫系统顺向选择主导期。 慢性乙肝的治疗思路 理想的治疗方法应该能够激活足够的免疫细胞,但尽可能减少肝细胞的损伤,并能中止这种持续的感染。要减少肝细胞的损失,必须先控制病毒持续复制和持续感染的过程,所以拉米夫定等核苷类似物有提前使用的必要,同时提供足够的前体 DC 群体亲和力。由于浸润的
  24. 24. 淋巴细胞会随时间而死亡。在清除的起始阶段,必须有足够数量的特异性的高亲和力的 T 细胞进入,杀死少量肝细胞,同时产生足够数量的细胞因子,以非溶细胞的方式清除或抑制整个肝脏的病毒的复制,大大降低 cccDNA 半衰期(17),减少肝细胞内的抗原产量,减少第二阶段效应细胞的作用范围(13,17);同时诱导被感染肝细胞表达足够的 MHC 和共刺激分子,还同时使途经的 T 细胞等淋巴细胞表达足够的 TCR 和共刺激分子,提高被感染肝细胞和淋巴细胞的群体亲和积。 免疫治疗前患者体内抗原与前体 DC 系统的亲和积处于平衡改造平衡常数 L1q1×L2q2=K,从体外补给 A 的替代物对患者进行治疗,设其浓度为△X,免疫治疗效果 C 的增加浓度为 N。由于 B 的群体中个体的亲和力呈正态分布,所以认为 B 数量的减小倍数等于平均亲和力的减小倍数,假设 C 的生理流量不受影响, 1 不变, q 那么,N=L2{1-[L1/(L1+△X)]1/2},当 L1 越小, 由于 L1q1×L2q2=K,所以 L2 越大,并且当△X 越大时,N 越大,所以免疫治疗要大剂量给药,同时大剂量给药活化势越大,活化速度也就越大。 免疫治疗需先降低血液中 HBV-DNA水平,所以有必要使用核苷类似物使 L1 减小,同时为了加速 L2 的增大,可能有使用免疫或血液系统兴奋剂的必要。又成熟 DC 数量=N×发生体积,所以有静脉给药或者多点皮下给药的必要。在慢性乙肝病人体内,由于存在静息活化平衡常数,那么在抗原浓度和亲和力相同的情况下,前体 DC 的浓度和亲和力之积为定值。前体 DC 浓度越大,亲和力越小,此时给药的途径的区别大大缩小。 使用核苷类似物减少被感染肝细胞的量,和减少被感染程度,能
  25. 25. 减少顺向选择时损失的肝细胞数量;另外只有这样才能保留足够的高群体亲和积的前体 DC,利用抗原冲击,一次才能在短时间内激活足够数量的特异性的高亲和力的 CD4+和 CD8+的 T 细胞(32),通过非溶细胞途径(13),抑制病毒复制。同时通过提高双方的亲和力使得在肝内积累到足够数量的效应细胞,产生足够强大的顺向选择作用,将被感染的肝细胞清除或帮助肝细胞清除其内的病毒。小规模的积累效应细胞,其顺向选择作用有限,达不到很理想的清除程度,往往还带来大量肝细胞消耗,长久将打破肝脏内肝细胞和非肝细胞之间的平衡,导致肝硬化。如何找到恰当的△X,使产生的高亲和力的 T 细胞的数量足够而不是过量,需要在动物实验和临床实验中得出结论。 乙肝病毒的各种抗原都对促进细胞免疫和/或体液免疫有作用(52,53,54,55)。拉米夫定能使乙肝病毒各种抗原的表达都有不同程度的降低(33),从而能降低抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC);乙肝病毒能通过提高肿瘤坏死因子相关的调亡诱导受体和死亡受体 4 的表达而增强肿瘤坏死因子相关的调亡诱导配体毒性,人肝细胞中 HBV 复制水平升高能增强肿瘤坏死因子相关的调亡诱导配体诱导的调亡(56);HBV 感染时肝细胞可强表达 CD95L 和 CD95,相互作用可引起肝细胞调亡(57)。所以拉米夫定的使用能减少肝细胞的调亡。拉米夫定治疗还能降低淋巴细胞的调亡敏感性(58),并且拉米夫定不会妨碍免疫系统对乙肝病毒的成功清除(59)。在治疗的过程中可以有选择地予以护肝防纤维化治疗。 慢性乙肝的治疗,采用抗病毒和免疫调节治疗的联合用药的方
  26. 26. 法,并且在使用免疫治疗前优先使用拉米夫定等核苷类似物抑制病毒复制,预先降低病人血液中病毒抗原的含量,能增强慢性乙肝治疗的疗效。这一策略已取得国内外大多数同行的一致认同,最近的动物和临床试验都已经证明其与实践的相互吻合(60-62) 。 持续存在的乙肝病毒抗原对对其敏感的前体 DC 持续的反向选择,使得这些前体 DC 不能在同一段时间内积累,继而使得二者相互作用后产生的成熟的活化的 DC 不能在同一段时间内积累,以致不能同时产生足够的 CTL 细胞进行有效的控制被感染的肝细胞的作用。所以有必要提前降低病人细胞外液中慢性乙肝抗原的含量,以减小它们的反向选择作用。自然界中生物对有限的资源同样存在着相互的竞争。各种免疫细胞以及它们的亚群之间均存在着相互的竞争和抑制作用,如T 细胞、NK 和 NKT 细胞之间以及它们亚群之间的相互竞争(63)。人体各种前体 DC 细胞亚群之间也同样可能存在不同种群之间的相互竞争。乙肝病毒抗原系统对对其敏感的前体 DC 持续的反向选择,使得这些敏感的前体 DC 减少,进而使得它对其它前体 DC 细胞的抑制作用减弱,其它的前体 DC 细胞数量就会增加,进而增强了它们对对乙肝病毒抗原系统敏感的前体 DC 细胞的抑制作用,使其恢复感染前的速度减小和能恢复的数量减少。同样,被感染的肝细胞也会持续的反向选择对其敏感的 CTL 细胞而使其数量减少,其它 CTL 细胞的数量将会增加,它们的抑制作用也会抑制乙肝病毒特异性 CTL 的恢复。为了增加对乙肝病毒敏感的前体 DC 的恢复速度,增大其能恢复的数量;同样也为了特异性抗乙肝病毒的前途 CTL 细胞的恢复,有必要解除这种
  27. 27. 持续的抑制作用。另外,外周血中被感染的 DC 细胞低水平表达 MHC和共刺激分子(64),使得它们在与乙肝病毒特异性的 T 细胞群作用时,诱导活化的 T 细胞的比例将下降,而耐受和调节性 T 细胞产生的比例将升高。要解决这些错综复杂的局面,必须对免疫系统重新进行一次格式化。 所以作者认为慢性乙肝的治疗可以分为两个阶段,如下: 第一阶段:免疫系统重新格式化阶段 在有效抑制病毒复制,有效降低血液病毒抗原的基础上,使用糖皮质激素等免疫抑制剂,非特异杀死或者非特异诱导免疫细胞调亡之后,对患者加以营养或者血液、免疫系统兴奋剂后使免疫系统重新恢复,完成免疫系统的重新格式化。 第二阶段:免疫治疗阶段 在免疫系统完成重新格式化后,继续有效抑制病毒的复制,使用乙肝病毒特异性免疫治疗性疫苗,激活特异性体液免疫和细胞免疫,清除和治愈被感染的肝细胞,实现免疫系统主导的双向选择平衡。 具体方案 具体实施计划图(横坐标:weeks) :
  28. 28. 1~10 周为免疫系统重新格式化阶段, 周起为免疫治疗阶段。 11 ①基因重组表面抗原抗体或者 RNA 干扰类药物(目前还没有上市的药物)或者有抑制病毒抗原表达的中草药(苦味叶下珠等)降低病人外周血中的蛋白类抗原的水平。人源表面抗原抗体的制备可通过基因重组技术和杂交瘤技术制备,并且目前两种技术均较为成熟。 ②第 5 周开始使用糖皮质激素类药物。糖皮质激素通过淋巴细胞表面的糖皮质激素受体,诱导 T 细胞和 B 细胞等免疫细胞调亡。它还能抑制 DC 分化发育,增加 DC 内吞活性,抑制 DC 呈递抗原,降低共刺激分子表达和减少脾脏中 DC 数量,从而降低了 DC 刺激 T 细胞的活性。糖皮质激素与 DC 的调亡呈时间效应关系和剂量效应关系,但没有诱导巨噬细胞调亡的现象(65) 。糖皮质激素能截断负载有乙肝病
  29. 29. 毒抗原的 DC 对乙肝病毒特异性的幼稚 T 细胞持续的选择作用。 ③在免疫系统恢复期和免疫治疗期间,都必须充分保证营养的供给,使患者的体液免疫和细胞免疫处于一个较好的水平,如果经口和胃肠道吸收不良或者不便时,应考虑静脉营养等方式,但应减少促进纤维化的营养、氨基酸的供给(66) 。 ④特异性免疫治疗药物,使用免疫治疗的疫苗类药物必须大剂量和皮下多点给药.目前的治疗性乙肝疫苗多种多样,蛋白类、多肽类、HBV DNA 类、腺病毒载体类等等。但作者认为,HepG2 细胞产生的 Dane颗粒和核衣壳是理想的特异性免疫成分,将其灭活或部分灭活等处理制成疫苗,很可能要优于目前的种种设计方式。人体的 DC 能摄取病毒抗原,不支持乙肝病毒的复制和感染,乙肝病毒主要存在内含体中,在细胞质中无核细胞质转运,细胞浆内无复制(67),所以部分灭活的乙肝病毒很可能不会给病人带来严重的后果。DC 能通过交叉递呈的作用激活 CD8+和 CD4+的细胞免疫,所以并不需要采用 DNA 在人体肌肉细胞表达后,才能引起特异性的 CD8+的 T 细胞反应。并且作者对 DNA 疫苗诱导的特异性 T 细胞的流量水平是怀疑的,在慢性乙肝的治疗中,过低的特异性 T 细胞生成流量有时是无效的,甚至是有害的。 参考文献1 Zofia Błach-Olszewska.Innate immunity:cells, receptors, and signaling pathways. Arch Immunol Ther Exp, 2005, 53, 245 –253.2 Masanori Isogawa,Michael D.,at el.Toll-Like Receptor Signaling Inhibits Hepatitis B Virus Replication In Vivo.Journal of Virology,June 2005,p.7269-7272.3 Mark A Wallet, Pradip Sen, and Roland Tisch.Immunoregulation
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