CÈL·LULES MARE   PLURIPOTENTS I MEDICINA       REGENERATIVA               Begoña Aran          Banc de Línies Cel·lularsCe...
CÉLULAS MADRESe trata de células indiferenciadas que sehan localizado en la masa celular interna delblastocisto, en alguno...
Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad    Division             Autorenovación      Diferenciación...
CELULAS PLURIPOTENTES• Células madre     • CM embrionarias     • CM fetales     • CM adultas• Células pluripotencia induci...
Pluripotency
células madre adultas• son células indiferenciadas que se hallan  en tejidos adultos diferenciados y que  son capaces de r...
células madre    adultassu frecuencia es baja, son difíciles deidentificar y purificar, su proliferación eslimitada y son ...
células madre fetales• se trata de tipos celulares primitivos que se  hallan en el feto y que pueden desarrollarse  en cél...
células madre embrionarias son las que derivan de lamasa celular interna(MCI) de un blastocisto(día +5/6 de desarrollo,± 1...
In vivoIn vitro
Modelo de enfermedades             Estudio del desarrollo yy desarrollo de fármacos           organogénesis               ...
ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN  CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES  MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM  Alteraciones neurode...
Derivación células madre embrionarias• Descongelación de los embriones (centros RA)• Cultivo embrionario*  los embriones e...
Derivación células madre embrionarias                                        Cultivo hasta   Descongelación               ...
Derivación células madre embrionarias Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-...
Derivación ES[2] p0 d4 (10x)   p0 d7 (20x)   p0 d9 (20x)p0 d12 (10x)    p1 d2 (4x)   p1 d6 (4x)
Células somáticas de pluripotenciainducida (IPS)•   Paciente-compatible               Fibroblastos•   No problemas éticos•...
Método reprogramaciónLentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are stillmajor approaches for generation of iPS
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
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Caracterización Fosfatasa                         Actividad alcalina                          TelomerasaInmunocitoquimica ...
DIFERENCIACIÓNProceso mediante el cualuna célula madreindiferenciada setransforma en célulasespecializadas(diferenciadas) ...
DIFERENCIACIÓN• Cambios en la expresión de genes mediantemecanismos epigenéticos• Cambios fisiología: tamaño, forma, polar...
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro3 líneas germinales:- Ectodermo: neuronas- Mesodermo: cardiomiocitos- Endodermo: t...
3 days in suspension in differentiation mediaEctodermo             Endodermo                    MesodermoDMEM/F 12        ...
Diferenciación in vitro  Ectodermo: beta-tubulina
Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
Diferenciación in vitro  Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Teratomas              Ratones SCID de 8 semanas                        1millón cé...
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo   Mesodermo (Cartilago)               Endodermo (epitelio                         ...
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Diferenciación in vitro  Ectodermo: beta-tubulina
Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
Diferenciación in vitro  Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
Diferenciación de las CME•   ADIPOCITOS             •   PRECURSORES LINFOCITOS•   ASTROCITOS             •   MASTOCITOS•  ...
• Banqueo• Registro en el Banco Nacional de Líneas  Celulares
Criterios mínimos• Consentimiento informado• Trazabilidad• Aprobación Comité Ética•   Datos derivación (origen, métodos, e...
Terapia celular en medicina regenerativaTrasplante de células diferenciadas , obtenidasa partir de CM, destinado a reparar...
Terapia celular con CMPhacia la aplicación clínica:PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimiz...
PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y  purificaci...
TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICOComo evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatible...
TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICOComo evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatible...
Stojkovic et al, 2005
PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y  purificaci...
PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y  purificaci...
PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y  purificaci...
Funcionalidad y viabilidad post-trasplante• Es necesaria la integración y realización de  conexiones necesarias para resta...
Estudios funcionalidad• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000;  Kroon, 2008.• Neuronas, enfermedad de Parkin...
PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y  purificaci...
Aspectos metodológicos • Estandarización protocolos: procedencia material,   métodos de cultivo, preparación, almacenaje, ...
Primeros ensayos clínicos         • Geron corp.: Oligodendrocitos           derivados de CME, lesionados           medular...
Moltes gràcies per la vostra atenció         baran@cmrb.eu
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Cèl·lules mare pluripotents i medicina regenerativa

  1. 1. CÈL·LULES MARE PLURIPOTENTS I MEDICINA REGENERATIVA Begoña Aran Banc de Línies Cel·lularsCentre de Medicina Regenerativa de Barcelona
  2. 2. CÉLULAS MADRESe trata de células indiferenciadas que sehan localizado en la masa celular interna delblastocisto, en algunos tejidos fetales, en elcordón umbilical y la placenta y en variostejidos adultos.Son células pluripotentes (o en algunos casostotipotentes) que dan lugar a células ytejidos especializados.Su utilidad estriba en la utilización paratratamientos de patologías con pérdida defunción celular
  3. 3. Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad Division Autorenovación Diferenciación asimétrica
  4. 4. CELULAS PLURIPOTENTES• Células madre • CM embrionarias • CM fetales • CM adultas• Células pluripotencia inducida (iPS)
  5. 5. Pluripotency
  6. 6. células madre adultas• son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.• algunas pueden ser pluripotentes.• se encuentran en hígado, médula osea, pancreas, piel, cerebro, sangre…
  7. 7. células madre adultassu frecuencia es baja, son difíciles deidentificar y purificar, su proliferación eslimitada y son difíciles de mantener enun estado indiferenciado.
  8. 8. células madre fetales• se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitores de islotes pancreáticos.
  9. 9. células madre embrionarias son las que derivan de lamasa celular interna(MCI) de un blastocisto(día +5/6 de desarrollo,± 150 células). Lascélulas de la MCI danlugar a las 3 líneas delembrión: ectodermo,mesodermo y MCIendodermo.
  10. 10. In vivoIn vitro
  11. 11. Modelo de enfermedades Estudio del desarrollo yy desarrollo de fármacos organogénesis Terapia celular
  12. 12. ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM Alteraciones neurodegenerativas Accidentes vasculares Lesiones medulares Fallo cardíaco Diabetes mellitus
  13. 13. Derivación células madre embrionarias• Descongelación de los embriones (centros RA)• Cultivo embrionario* los embriones en distinto estadío embrionario deben cultivarse hasta blastocisto * Deben seguirse los protocolos utilizados en el laboratorio de FIV.
  14. 14. Derivación células madre embrionarias Cultivo hasta Descongelación blastocisto embriones D+5/6 Eliminación de la Eliminación del zona pellucida trofectodermo - 5mg/ml pronasa - Ac. Tyrode’s Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%) Feeders cells
  15. 15. Derivación células madre embrionarias Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)CULTIVOKO-DME Medium supplementado con:2 mmol/l Glutamax0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)1% non-essential amino acids20% KO-Serum Replacement0,5% penicillin-streptomycin
  16. 16. Derivación ES[2] p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)p0 d12 (10x) p1 d2 (4x) p1 d6 (4x)
  17. 17. Células somáticas de pluripotenciainducida (IPS)• Paciente-compatible Fibroblastos• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes Integración• Integración medianter vector (virus) genes (virus)• Segura? Activación oncogenes, transmisión línea germinal? Células ES-like Takahashi et al., 2007 Nakagawa et al., 2007 Park et al., 2007
  18. 18. Método reprogramaciónLentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are stillmajor approaches for generation of iPS
  19. 19. Modeling human disease with iPS cells
  20. 20. Modeling human disease with iPS cells
  21. 21. Modeling human disease with iPS cells
  22. 22. Modeling human disease with iPS cells
  23. 23. Modeling human disease with iPS cells
  24. 24. Caracterización Fosfatasa Actividad alcalina TelomerasaInmunocitoquimica Immunocitoquimicapara marcadores de para marcadores depluripotencialidad diferenciación In vitro Formación de cariotipo cuerpos embrioideos Inmunohistoquímica para marcadores de Microsatélites & HLA diferenciación In vivo (formación teratomas)
  25. 25. DIFERENCIACIÓNProceso mediante el cualuna célula madreindiferenciada setransforma en célulasespecializadas(diferenciadas) de undeterminado tipo celular.
  26. 26. DIFERENCIACIÓN• Cambios en la expresión de genes mediantemecanismos epigenéticos• Cambios fisiología: tamaño, forma, polaridad, actividadmetabólica…• capacidad proliferativa diferenciación c.madre c precursora c. diferenciada
  27. 27. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro3 líneas germinales:- Ectodermo: neuronas- Mesodermo: cardiomiocitos- Endodermo: tejido glandular Embryoid bodies
  28. 28. 3 days in suspension in differentiation mediaEctodermo Endodermo MesodermoDMEM/F 12 KO DMEM KO DMEMNeural basal medium FBS FBSN2 Glutamax GlutamaxB27 Amino acidos no-esenciales Amino acidos no-esencialesGlutamax P/S P/SP/S β-mercaptoetanol β-mercaptoetanol Ac. Ascórbico 0,5 mM PA6 Gelatine 14-16 days 15-20 days
  29. 29. Diferenciación in vitro Ectodermo: beta-tubulina
  30. 30. Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
  31. 31. Diferenciación in vitro Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
  32. 32. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Teratomas Ratones SCID de 8 semanas 1millón células • intramuscular • subcutáneo • en algunos órganos 2 meses
  33. 33. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio) Endodermo (epitelio respiratorio) Mesodermo (Cartilago)
  34. 34. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
  35. 35. Diferenciación in vitro Ectodermo: beta-tubulina
  36. 36. Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
  37. 37. Diferenciación in vitro Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
  38. 38. Diferenciación de las CME• ADIPOCITOS • PRECURSORES LINFOCITOS• ASTROCITOS • MASTOCITOS• CARDIOMIOCITOS • NEURONAS• CONDROCITOS • OLIGODENDROCITOS• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS • OSTEOBLASTOS• CÉL. DENDRÍTICAS • ISLOTES PANCREÁTICOS• CÉL. ENDOTELIALES • MÚSCULO LISO• KERATINOCITOS • MÚSCULO ESTRIADO• HEPATOCITOS • TROFECTODERMO • GAMETOS
  39. 39. • Banqueo• Registro en el Banco Nacional de Líneas Celulares
  40. 40. Criterios mínimos• Consentimiento informado• Trazabilidad• Aprobación Comité Ética• Datos derivación (origen, métodos, etc)• Disponibilidad• Cariotipo• Modificación genética• Marcadores celulares de pluripotencia• Diferenciación a las 3 líneas germinales (in vitro y/o in vivo)
  41. 41. Terapia celular en medicina regenerativaTrasplante de células diferenciadas , obtenidasa partir de CM, destinado a reparar tejidos enlos que se ha perdido la funcionalidad.
  42. 42. Terapia celular con CMPhacia la aplicación clínica:PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
  43. 43. PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
  44. 44. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICOComo evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración previa de material embrionario o hematológico del donante• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear
  45. 45. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICOComo evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración previa de material embrionario o hematológico del donante• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear
  46. 46. Stojkovic et al, 2005
  47. 47. PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-trasplante• Aspectos metodológicos
  48. 48. PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
  49. 49. PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
  50. 50. Funcionalidad y viabilidad post-trasplante• Es necesaria la integración y realización de conexiones necesarias para restablecer la funcionalidad del órgano.• Estudio mecanismos control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular• Estudios de restauración de la funcionalidad en modelos animales• Órgano: varios tipos celulares
  51. 51. Estudios funcionalidad• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000; Kroon, 2008.• Neuronas, enfermedad de Parkinson. Sonntag, 2007; Cho, 2008.• Precursores neuroectodérmicos, lesiones medulares. Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Kumagai, 2009.• Precursores miocárdicos, accidentes vasculares. Kehat, 2004; Menard, 2005; Laflamme, 2007; van Laake, 2009.• Epitelio pigmentado de retina. Retinitis pigmentosa. Idelson, 2009.• Neuronas estriadas. Enfermedad de Huntington. Aubry, 2008.
  52. 52. PROBLEMAS TÉCNICOS• Rechazo inmunológico• Formación de tumores• Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
  53. 53. Aspectos metodológicos • Estandarización protocolos: procedencia material, métodos de cultivo, preparación, almacenaje, banqueo, transporte. • Eliminación xenobióticos • Condiciones GMP • Control de calidad • Supervisión por comités externos de protocolos y ensayos clínicos. Valoración riesgos. • Consentimiento informado ISSCR: guidelines for clinical translation of stem cells. http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRGLClinicalTrans. pdf
  54. 54. Primeros ensayos clínicos • Geron corp.: Oligodendrocitos derivados de CME, lesionados medulares • Advanced Cell Technologies: Epitelio pigmentado de retina derivado de CME, distrofia macular de Stangerdt’s.
  55. 55. Moltes gràcies per la vostra atenció baran@cmrb.eu

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