Laporan Praktikum Bologi Sel Molekuler_Ma'ruf_P2BA09006

18,122 views

Published on

Published in: Education
1 Comment
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
18,122
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
3
Actions
Shares
0
Downloads
607
Comments
1
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Laporan Praktikum Bologi Sel Molekuler_Ma'ruf_P2BA09006

  1. 1. LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER KODE MATA KULIAH BIU 1102 Disusun oleh: MA’RUF P2BA09006 PROGRAM STUDI S2 BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2010 1
  2. 2. KATA PENGANTAR Praktikum mata kuliah Biologi Sel molekuler dilaksanakan guna memenuhi satuan kredit semester (SKS) yang dilaporkan berdasarkan hasil kegiatan sesuai dengan petunjuk praktikum. Pelaksanaan praktikum ini dilakukan dengan menyesuaikan pencapaian kompetensi mata kuliah dan ketersediaan fasilitas peralatan yang ada di laboratorium, oleh karena itu tentu hasil yang kami peroleh belum dapat memenuhi harapan yang ideal. Adapun tujuan dilaksanakan kegiatan praktikum adalah memperjelas materi perkuliahan, memberi sedikit bekal kepada kami tentang metode untuk mempelajari biologi sel molekuler, menumbuhkan semangat bekerja dalam tim serta melatih kami dalam hal penulisan laporan ilmiah. Atas dasar petunjuk praktikum mata kuliah Biologi Sel Molekuler, kegiatan praktikum ini terdiri lima acara yaitu : I. Isolasi DNA Plasmid II. Restriksi DNA Plasmid III. Elektroforesis Gel Agarosa IV. Ligasi DNA IV. Transformasi. Saran dan kritik dari semua pihak sangat kami hargai demi peningkatan kualitas kegiatan maupun laporan praktikum yang tentunya akan dapat menjadi bekal bagi kami dalam mencapai kompetensi mata kuliah Biologi Sel Molekuler. Purwokerto, Pebruari 2010 Praktikan 2
  3. 3. DAFTAR ISI Halaman Halaman sampul ........................................................................................................... 1 Kata Pengantar ............................................................................................................. 2 Daftar Isi ........................................................................................................................ 3 ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID ..................................................................... 4 ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID ................................................................ 20 ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ............................................... 23 ACARA IV. TRANSFORMASI ................................................................................ 31 3
  4. 4. ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID LANDASAN TEORI Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Berikut prosedur isolasi plasmid yang biasa dilakukan dalam praktikum: 1. PEMANENAN SEL Tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. 2. PELEPASAN PLASMID DARI SEL Setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar I, II, III diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ --> mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik. 4
  5. 5. STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ --> mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik Sodium Dodecyl Sulphate ( SDS ) dari Lar II dapat melubangi membran sel karena SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti)protein membran sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar. KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA saat dielektroforesis. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan. 5
  6. 6. 6
  7. 7. 7
  8. 8. PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan................
  9. 9. kira2 yang terjadi di dalam tube ...... etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid hasil setelah dielektroforesis. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html
  10. 10. RESTRIKSI DNA PLASMID Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Plasmid Plasmid merupakan DNA sirkuler untai ganda ekstra kromosomal dengan ukuran bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb ditemukan pada berbagai spesies bakteri yang dipakai sebagai unit gen untuk melakukan replikasi (Sambrook et al., 1989). Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih dan sering kali gena tersebut menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri tuan rumah (Brown, 2003). Plasmid membawa tipe gen yang sangat bervariasi fungsinya seperti resisten terhadap antibiotik, resisten terhadap logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resisten terhadap bakteriophage, produksi enzim retriksi, produksi asam amino, produksi toksin, penentu virulensi, katabolisme molekul organik yang komplek, kemampuan untuk membentuk hubungan simbiosis dan transfer DNA antar kingdom (Feinbaum, 1998). Berdasarkan sifat-sifat utama yang dikode oleh plasmid, plasmid dapat diklasifikasikan menjadi 5 jenis utama: a. Plasmid fertilitas atau plasmid “F” yang hanya membawa gena tra dan tidak mempunyai sifat lain kecuali kemampuan untuk melakukan transfer plasmid dengan cara konjugasi. b. Plasmid resistensi atau plasmid “R” membawa gena yang menyebabkan resistensi bakteri tuan rumah terhadap satu atau lebih agen antibakteri, seperti kloramfenikol, ampisilin dan merkuri.
  11. 11. c. Plasmid col mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain. d. Plasmid degradatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolism molekul yang tidak biasa, seperti toluen dan asam asetat. e. Plasmid virulensi menyebabkan patogenitas pada bakteri tuan rumah (Brown, 2003). Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid yang biasanya ditemukan dalam satu sel bakteri. Tiap-tiap plasmid mempunyai jumlah kopi antara 1-50 atau lebih (Brown, 2003). Berdasarkan jumlah kopi plasmid dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu: High Copy Number Plasmid dengan jumlah kopi lebih besar dari 20 kopi per sel bakteri dan Low Copy Number Plasmid dengan jumlah kopi lebih kecil dari 20 kopi per sel bakteri (Feinbaum, 1998). Kebanyakan plasmid yang berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilit (supercoiled). Pelilitan (supercoiling) terjadi karena heliks ganda DNA plasmid sebagian terbuka oleh enzim yang disebut topoisomerase selama replikasi plasmid. Bentuk berlilit hanya dapat dipertahankan bila kedua untai polinukleotid dalam keadaan utuh sehinggga disebut DNA sirkuler yang tertutup secara kovalen (covalently-closed-circular (ccc) DNA). Jika salah satu untai polinukleotid terputus maka heliks ganda akan kembali ke keadaan normalnya, yaitu berelaksasi, dan plasmid akan mengambil bentuk alternatif yang disebut sirkuler terbuka (open circular (oc)) (Brown, 2003). Lebih jelasnya model konformasi DNA tersebut seperti tersaji pada Gambar 2. Gambar 2. Model Konformasi DNA Keterangan: Bentuk lingkaran kovalen tertutup dan dua tipe lingkaran nick, tanda panah menunjukkan adanya torehan/nick. (Adaptasi dari Freifelder, 1983). Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada Gambar 3. Plasmid pUC19 mempunyai berbagai sisi
  12. 12. pemotongan untuk enzim BamHI. Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadapampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam,sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19menjadi resisten terhadap ampisilin (Sambrook et al., 1989). Gambar 3. Peta Restriksi Plasmid pUC19 (Sambrook et al., 1989). Fuji Lestari, (2008), Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Fraksi Protein Daun Kucing-Kucingan (Acalipha indica L) Terhadap pUC 19, Skipsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
  13. 13. metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno- blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul- molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel
  14. 14. yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Gel poliakrilamid vs gel agarose 1. Gel Poliakrilamid • Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp • Power: ekstrim tinggi • Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp • Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi. • Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan. 2. Gel Agarose • Power lebih rendah • Mempunyai laju pemisahan lebih cepat • Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan • Medan gerak biasanya horizontal Electroforesis migration rate Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose dipengaruhi oleh beberapa factor utama, sebagai berikut: 1. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa. 2. Konsentrasi gel agarose Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logµ=logµο-KrT
  15. 15. dimana µο adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta µ adalah electrophoretic mobility DNA. Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb) 1 0.3 60-5 2 0.6 20-1 3 0.7 10-0.8 4 0.9 7-0.5 5 1.2 6-0.4 6 1.5 4-0.2 7 2.0 3-0.1 3. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena: • terutama konsentrasi gel agarose • kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan • densitas kembaran superheliks pada bentuk I • pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III • tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I • konsentrasi EtBr kritis antara 0.1µg/ml-0.5µl/mg 4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga. 5. Komposisi basa DNA atau temperature Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar
  16. 16. 6. Keberadaan pewarna DNA Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator. 7. Konposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal: • Tris-acetate; umu dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi. • Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose. A C B Gambar 1. Peralatan elektroforesis dari iMupid (Japan). A. Gel tray, B. Cara mencetak gel agarose. C. Peralatan lengkap untuk running elektroforesis (dengan/tanpa ditambah power supply).
  17. 17. Gambar 2. Laju migrasi gel elektroforesis. Disampingnya adalah hasil elektroforesis DNA pada gel agarose dengan DNA ladder sebagai markernya. Gambar 3. Konsentrasi gel agarose dan hasil separasi dari marker DNA. Acuan: Maniatis T et al, 1982-Molecular cloning : A Laboratory Manual. CSH. TRANSFORMASI Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi
  18. 18. yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja. http://joelnaga.blogspot.com/2009/12/pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html HASIL PRAKTIKUM Hasil dari elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 90 volt dilihat dengan sinar UV: TUJUAN Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid BAHAN DAN ALAT 1.E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19 2.Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair 3.Ampisilin 4.QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) 5.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 6.Tabung mikrosentrifuga 7.Sarung tangan 8.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 9.Lemari pendingin 10.Kamera Digital CARA KERJA DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA). 1.Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).
  19. 19. 2.Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 3.Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 4.Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. 5.Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. 6.Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. 7.Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. 8.Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit. 9.Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit. 10.Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. 11.QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 12.Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 13.Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. 14.QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). 15.QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). HASIL
  20. 20. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg. Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma. Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah
  21. 21. mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasi. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant. Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.
  22. 22. ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID LANDASAN TEORI Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. TUJUAN Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid BAHAN DAN ALAT 1.Plasmid pUC19 2.Enzim restriski (PstI) 3.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 4.Tabung mikrosentrifuga 5.Sarung tangan 6.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 7.pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea) 8.termometer 9.Lemari pendingin (Frezer) 10.Kamera Digital
  23. 23. CARA KERJA 1.Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI. 2.Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI 3.Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. 4.Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. 5.Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). 0 6.Tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. 7.Larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer. HASIL Amatilah hasil pemotongan DNA palsmid dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA plasmid yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.) DAFTAR REFERENSI http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045
  24. 24. ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA LANDASAN TEORI Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda. TUJUAN Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa BAHAN DAN ALAT 1.DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 2.Sampel DNA, misalnya : a. DNA kromosom bakteri,
  25. 25. b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 2.Agarosa 3.Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 4.Akuades 5.Gelas Ukur 1000 ml 6.Labu Erlenmeyer 50 ml 7.Tabung mikrosentrifuga 8.Sarung tangan 9.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 10.Kertas parafilm 11.seperangkat alat elektroforesis 12.Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) 13.larutan Etidium Bromid (EtBr) 14.UV transluminator 15.Kaca mata UV 16.kamera digital CARA KERJA No. Keterangan Gambar 1 Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%, . timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan asisten) 2 Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20 . mL
  26. 26. 3 Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat . jernih. 4 Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC) . dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10 mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke dalam pencetak gel 5 Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke . dua ujung pencetak gel dan menempatkan sisir pada salah ujung pencetak gel 6 Tuangkan larutan agarosa ke dalam . pencetak gel. 7 Setelah gel memadat, pindahkankan gel . agarosa beserta pencetak gel ke dalam tangki elektroforesis.  Sebelum dipindahkan ke tangki elekstroforesis, selotip pada kedua ujung pencetak gel dilepas terlebih dahulu 8 Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah . dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke dalam sumur (well) gel agarosa 9 Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda . warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose bagian bawah.
  27. 27. 1 Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel 0 agarosa di atas UV transillumitor dan tutup . kaca pelindung dan amati pita DNA 1 Dokumentasikan pita DNA yang tampak 1 menggunakan kamera . . HASIL Gambarlah pita-pita dna hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan memsumuraningkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.
  28. 28. Keterangan: 9 = A4 (pUC) 1 = Marka (λ/hind III) 10 = K1 (pUC hasil isolasi) 2 = K1 (pUC + HindIII) 11 = K2 (pUC hasil isolasi) 3 = K2 (pUC + E. Cory I) 4 = K3 (pUC + Pst I) 5 = K4 (pUC + E. Cory I) 6 = A1 (pUC + E Cory I) 7 = A2 (pUC + Pst I) 8 = A3 (pUC + HindIII)
  29. 29. base distance(mm distance unknow bp pairs log 10 bp m*distance y value ) unknow value (bp) 23130 13 4.364176 36 -0.972 3.711 5140.436516 9416 25 3.973866 35 -0.945 3.738 5470.159629 6557 30 3.816705 33 -0.891 3.792 6194.410751 4361 40 3.639586 35 -0.945 3.738 5470.159629 43 -1.161 3.522 3326.595533 32 -0.864 3.819 6591.738952 35 -0.945 3.738 5470.159629 44 -1.188 3.495 3126.079367 45 -1.215 3.468 2937.649652 43 -1.161 3.522 3326.595533 Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pemsumuraning sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang dipengaruhi oleh ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis Berdasarkan hasil praktikum tersebut persamaan regresi logaritmik yang digunakan untuk DNA marker data yang diperoleh: y = -0,027x+4,683; R2 = 0,977 Persamaan
  30. 30. logaritmik menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1. Dengan menggunakan persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya: NO SUMURAN distance unknow unknow bp value 1. Marka (DNA λ/Hind III) 2. K1 (pUC + HindIII) 36 5140.436516 3. K2 (pUC + E. Cory I) 35 5470.159629 4. K3 (pUC + Pst I) 33 6194.410751 5. K4 (pUC + E. Cory I) 35 5470.159629 6. A1 (pUC + E Cory I) 43 3326.595533 7. A2 (pUC + Pst I) 32 6591.738952 8. A3 (pUC + HindIII) 35 5470.159629 9. A4 (pUC) 44 3126.079367 10. K1 (pUC hasil isolasi) 45 2937.649652 11. K2 (pUC hasil isolasi) 43 3326.595533 Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk
  31. 31. supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis. DAFTAR REFERENSI http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/ http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid
  32. 32. ACARA IV. TRANSFORMASI LANDASAN TEORI Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. BAHAN ADAN ALAT 1.strain E. coli JM 109 2.media LB cair 3.media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin 4.media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG 5.es batu 6.shaker-incubator 7.termometer 8.Tabung mikrosentrifuga 9.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 10.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) 11.pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea) 12.jarum ose 13.batang drugalsky 14.cawan Petri 15.Erlenmeyer 16.shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.) 17.kamera digital. CARA KERJA 1.Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).
  33. 33. 2.Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. 3.Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 4.Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. 5.Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. 6.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. 7.Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 8.Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. 9.Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. 10.Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).
  34. 34. 11.Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 12.Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC. 13.Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. 14.Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. 15.Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. 16.Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 17.Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. 18.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana, Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) HASIL Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.. Karena sel dalam E.coli tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten. Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan
  35. 35. garam kalsium klorida (CaCl2). Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel kompeten mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem. Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut. Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada gambar . Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadap ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19 menjadi resisten terhadap ampisilin. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni
  36. 36. yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja. Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti berikut: Hasil tersebut menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB- Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 274 koloni, sedangkan pada pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD). Pada Non-pUC LB non-Amp hasilnya juga terdapat banyak koloni (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong, namun hasil yang
  37. 37. didapat dari praktikum kita terdapat kontaminan. Hal ini dimungkinkan amphisilin telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril. Pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi. Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode standar CaCl2. Konsentrasi optimum CaCl2 adalah 75 mM. Sel kompeten yang disimpan dalan -20oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada -70oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang berisi tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl2, MgSO4, dan glukosa. Media ini mendukung pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG8000. Penambahan ini mampu meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat. DAFTAR REFERENSI http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode- cacl2/ http://etd.eprints.ums.ac.id/2340/1/K100040214.pdf
  38. 38. Lampiran 1. Peta Restriksi DNA pUC19
  39. 39. Lampiran 2. Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) @3 ml Inkubas E.coli 25 i 370C, transfor m shaker man 1 Sentrifugasi Sp 5.700xg Cai Kol ran dib om + 1 ml resuspen Sentri + 500 µl Sp fugasi dib 5000 Sentrifug + 50 µl asi 13.000 Cai Sentrifug + 250 µl asi ran Resuspensi (vortex, 13.000 + 250 µl Bolak-balik + 750 µl War Sentrifug na asi Cai 13.000 + 350 µl DN Bolak-balik ran A War na BIR Sentrifug Sentrifug asi asi 13.000 13.000 Sp dipi Sentrifug asi 13.000
  40. 40. Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005) No. Komponen P1 P2 P3 1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl 2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl 3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 4. DNA pUC19 20 µl 20 µl 20 µl 5. PstI 2 µl - - 6. HinfI - 2 µl - 7. HindIII - - 2 µl Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl 1 2 3 4 5 6 7 P1 P2 P3 Spin sebentar, 2” Ketuk-ketuk Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam Simpan di frezer Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit
  41. 41. Lampiran 4.Skema Keja Pembuatan Gel Agorosa Elektroforesis Dibuat TAE 1 X 250 ml (5 ml TAE 50Xke dalam 245 ml akuades) Agarosa dilarutkan dalam buffer TAE 1X hingga 20 ml dengan konsentrasi gel agarosa sebesar 1% Gel agarosa Dibuat larutan gel agarosa Dihomogenkan dengan pemanasan hingga mendidih Dibuat cetakan gel Diamkan hingga suhu ±50oC Ditambah 2 ml etidium Kedua ujung ditutup bromida selotip Larutan gel agarosa Sisir elektroforesis dipasang untuk dibuat sumur Dituang ke dalam cetakan gel Gel memadat didalam cetakan Sisir dan selotip dilepas 220 ml TAE 1X di dalam bejana buffer Elektroforesis Gel memadat beserta cetakan Dimasukkan hingga tenggelam
  42. 42. Lampiran 5. Skema Kerja Elektroforesis Gel Agarosa Sampel DNA Dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis Arus DC dialirkan dari power supply Migrasi DNA menuju electrode positif Dilihat pita DNA pada transiluminator UV Gambar 1. Gel Agarosa Elektroforesis
  43. 43. Lampiran 6. Skema Kerja Pembuatan Sel Kompeten E. coli JM 109 Sp E. coli JM 09 Sel kompeten, gliserol Medium LB Inkubasi ± 16 jam Overnight 37 0C Inkubasi ± 16 jam Overnight Shaker incubator Medium LB 150 rpm LB 25 ml 37 0C Overnight E.coli JM 09 Diambil 250 µl Inkubasi ± 2 jam Shaker incubator 150 rpm 37 0C LB cair 25 Masing-masing ml 1,5 ml Sentrifugasi 5.000 rpm Tabung 5 menit sentrifuga 1 2 3 4 5 6 Dibuang supernatannya + 500 CaCl2 (Vortex) Sentrifugasi 5.000 rpm, 5 Kerja menit Aseptis Dibuang supernatannya + 200 CaCl2 (Vortex) Inkubasi :es Tabung 1 dan 2 selama 2 jam Transformasi Tabung 3, 4 dan5 selama 16 jam
  44. 44. Lampiran 7. Skema Kerja Transformasi E. coli JM 109 Inkubasi 2 jam Tabung sentrifuga berisi E.coli JM 09 kompeten inkubasi 2 jam 1 2 Simpan di ES 2 Tabung sentrifuga treatment 1 2 dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl + ketuk-ketuk pUC 19 10 µl - 1 2 Simpan di ES selama 20 menit Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik Simpan segera di ES selama 10 menit Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl) Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm 100 µl 50 µl 1A 1B 1 2 PLATING 1 Medium LB Amp Medium LB inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit 2A 100 µl 50 µl 2B Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada 2 medium LB Amp cawan 2A Medium LB Amp Medium LB
  45. 45. Inkubasi 16 jam Tabung sentrifuga berisi E.coli JM 09 kompeten inkubasi 16 jam 3 4 5 3 5 Simpan di ES 4 Tabung sentrifuga treatment 3 4 5 dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl 200 µl + ketuk-ketuk pUC 19 10µl - - pUC 19 rekombinan - 2 µl - 3 4 5 Simpan di ES selama 20 menit Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik Simpan segera di ES selama 10 menit Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl) Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm PLATING Disentrifugasi 5.000 rpm, ± 5 menit 3 4 5 4 Supernatan dibuang, sisakan 100 µl 100 µl 3A 4A 3 100 µl 4 medium medium LB/Amp/X-Gal/IPTG LB/Amp/X-Gal/IPTG 5A 100 µl 50 µl 5B ∑ koloni × pengenceran = CFU [ pUC19] µg 5 Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu) medium Medium LB LB Amp [pUC 19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) Inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit Dihitung jumlah koloni putih pada cawan 4A untuk diketahui effisiensi transformasinya
  46. 46. Lampiran 8. Media Pertumbuhan Bakteri 1. Media Cawan Agar Luria-Bertani (LB) 100 ml - Bacto tryptone 1 gram - Bacto yeast extract 0,5 gram - NaCl 0,5 gram - Agar 2 gram Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf. 2. Media Cair Luria-Bertani (LB) 100 ml - Bacto tryptone 1 gram - Bacto yeast extract 0,5 gram - NaCl 0,5 gram Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf. 3. Media Cawan Agar Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml - Bacto tryptone 1 gram - Bacto yeast extract 0,5 gram - NaCl 0,5 gram - Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl - Agar 2 gram Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf. 4. Media Cair Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml - Bacto tryptone 1 gram - Bacto yeast extract 0,5 gram - NaCl 0,5 gram - Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf. 5. Media Cawan Agar LB/Amp/X-Gal/IPTG Buat media agar LB/Amp seperti diatas, kemudian ditambahkan 100 μl IPTG 100 mM dan 50 μl X-Gal 50 mg/ml. Ratakan dengan cara dispread hingga kering, inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit sebelum digunakan.
  47. 47. Komposisi Bufer dan Larutan 1. TAE bufer 50X (Annymous, http://www.6mgel.com/50x_tae_buffer_1_liter.htm) - Tris-base 242 g - Glacial acetic acid 57,1 g - EDTA 0,5 M pH 8,0 100 ml Semua komponen dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian tambahkan HCl untuk menentukan pH 7,6-7,8. Tera dengan akuades hingga volume akhir 1000 ml. Dapat disimpan pada suhu ruang. 2. Loading buffer 6X (Anonymous, http://www.bioron.net/products/dna-and-dna- markers/loading-buffer/) - Bromophenol blue 0,25% - Xylene cyanol 0,25% - Ficoll tipe 400 15% - EDTA 120 mM Semua komponen dilarutkan hingga homogen. Dapat disimpan pada suhu ruang. 3. Larutan stok IPTG (0,1 M) (Promega, 2003) - IPTG 1,2 g Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian simpan pada 4o C. 4. Larutan X-Gal (2 ml) (Promega, 2003) - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg Larutkan dalam 2 ml N,N'-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil kemudian simpan dalam -20o C.

×