analisis stabilitas-literatur
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Like this? Share it with your network

Share

analisis stabilitas-literatur

on

  • 208 views

 

Statistics

Views

Total Views
208
Views on SlideShare
208
Embed Views
0

Actions

Likes
0
Downloads
1
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

analisis stabilitas-literatur Document Transcript

  • 1. BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. TANAMAN TOMAT 1. Klasifikasi dan ciri morfologi Menurut Lawrence (1951: 354, 370, 438, 676, & 693), Backer dan Backhuizen van den Brink, Jr. (1965: 476--477) serta Heywood (1974: 15) tanaman tomat diklasifikasikan sebagai berikut: Divisio : Spermatophyta Subdivisio : Angiospermae Class : Dicotyledoneae Superorder : Asteridae Order : Polemoniales Family : Solanaceae Genus : Lycopersicon Species : Lycopersicon esculentum Mill. Tomat merupakan tanaman herba semusim yang tumbuh tegak dengan tinggi berkisar antara 0,5--2,5 m dan bercabang (Tindall 1968: 242). Tomat memiliki akar tunggang. Batang berbentuk silinder dan bercabang. Kulit batang berwarna hijau dan berambut. Warna daun hijau tua dan merupakan daun majemuk menyirip ganjil (Backer & Backhuizen van den Brink, Jr. 1965: 476--477). Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 2. Bunga tomat berwarna kuning dan tersusun dalam tandan-tandan bunga yang disebut rasemosa dan terdiri atas 4--12 bunga per tandan (Tindall 1968: 242). Menurut Michael dan King (1981: 330), tanaman tomat memiliki bunga hermafrodit dan bersimetri banyak (aktinomorfik). Calyx dan corolla masing-masing terdiri atas 5 sepal dan 5 petal yang saling berlekatan (Tindall 1983: 355). Buah tomat termasuk buah buni, berdaging, dan beragam dalam bentuk maupun ukurannya. Buah beruang dua atau lebih yang mengandung sejumlah biji. Diameter buah 2--8 cm. Kulit buah berwarna merah atau kuning ketika masak. Warna buah ditentukan oleh pigmen likopen dan beta- karoten. Likopen menyebabkan warna merah pada buah, sedangkan beta- karoten bertanggung jawab terhadap warna kuning (Jaya 1997: 38--41). Berdasarkan tipe pertumbuhan, tanaman tomat dibedakan menjadi 2 kelompok, yaitu: a. Tipe indeterminate (tidak terbatas), yaitu tanaman tomat yang mampu tumbuh terus sampai menjadi tua dan tidak berbuah lagi, misalnya varietas Money maker, Gondol, Santa, Belgia, dan Apel. Umur panen relatif lama dan pertumbuhan batangnya relatif lama. Tinggi pohon mencapai 1,6--2 meter. b. Tipe determinate (terbatas), yaitu tanaman tomat yang pertumbuhannya akan terhenti pada ketinggian tertentu dan biasanya diakhiri dengan tandan, misalnya varietas Opal, Ratna, Intan, dan Berlian. (Gillivray 1961: 317; Risaketta 2006: 110). Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 3. 2. Varietas Opal Tanaman tomat varietas Opal merupakan salah satu varietas yang dihasilkan oleh Departemen Pertanian. Varietas tersebut memiliki bentuk buah lonjong, berat buah 25--27 g, rasa manis agak asam, dan toleran terhadap penyakit layu bakteri. Polinasi pada tomat varietas Opal dapat terjadi sendiri (self pollination). Secara genetis, varietas Opal cocok ditanam di dataran tinggi dengan potensi daya hasil 30--50 ton/ha. Keunggulan varietas tersebut adalah umur panen yang pendek (58--61 hari) dan daya simpan buah hingga 9 hari (Litbang Hortikultura 2006: 8). 3. Faktor-faktor lingkungan yang memengaruhi produktivitas tanaman tomat Terdapat tiga faktor lingkungan utama yang memengaruhi produktivitas tanaman tomat, yaitu ketinggian tempat, suhu, dan kelembapan udara. Ketiga faktor tersebut mengatur sejumlah proses pertumbuhan dan perkembangan hingga terjadinya polinasi, fertilisasi, serta pembentukan buah dan biji (Moore & Janick 1983: 52). Tanaman tomat dapat tumbuh di dataran rendah dengan ketinggian 200-- 500 m di atas permukaan laut, tetapi biasanya tumbuh lebih baik di dataran tinggi (> 900 m dpl) (Supriati dkk. 2008: 12). Relf dkk. (2004: 428) menyatakan bahwa titik kritis pada pembentukan buah tomat adalah suhu malam hari. Kisaran suhu malam hari yang optimal untuk tanaman tomat adalah 15 -- 20o C. Suhu malam hari yang rendah (< 13o C) akan Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 4. menurunkan produksi dan viabilitas polen, sedangkan suhu tinggi (> 32o C) bersamaan dengan kelembapan yang rendah disertai angin kering, dapat menghambat polinasi dan fertilisasi sehingga buah tidak dapat terbentuk. Sebaliknya kelembapan udara yang tinggi akan menyebabkan tanaman tomat banyak diserang penyakit busuk daun. Kelembapan relatif yang optimal untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman tomat adalah 80% (Relf dkk. 2004: 428). 4. Manfaat Buah tomat kaya vitamin, mineral, dan asam organik sehingga sangat berguna bagi kesehatan tubuh manusia (Garg dkk. 2006: 275). Buah tomat mengandung alkaloid solanin (0,007%), saponin, asam folat, asam malat, asam sitrat, bioflavonoid, protein, lemak, gula (glukosa, fruktosa), adenin, trigonelin, kholin, tomatin, mineral (Ca, Mg, P, K, Na, Fe, S, Cl), dan vitamin (B1, B2, B6, C, E, likopen, niasin) (Cox 2000: 3). Buah tomat dapat dikonsumsi segar misalnya untuk campuran salad atau sebagai buah-buahan pencuci mulut. Tomat untuk konsumsi segar dipilih yang berwarna kemerahan dan masak secara alami. Buah tomat juga dapat dikonsumsi setelah melalui proses pengolahan terlebih dahulu seperti jus, saus, sarden, pasta, sirup, dan puree. Sup tomat sangat baik untuk proses remediasi bagi penderita konstipasi (Kusumo & Sunarjono 1992: 28; Garg dkk. 2006: 275--276). Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 5. 5. Penyakit Serangan penyakit akan mengganggu metabolisme tanaman tomat, sehingga memengaruhi pertumbuhan dan perkembangan. Penyakit pada akar dan batang akan memengaruhi penyerapan air dan transportasi zat-zat makanan pada jaringan-jaringan, sehingga pertumbuhan tanaman terganggu. Penyakit pada tanaman tomat mempunyai kemampuan merusak tanaman sejak dari biji sampai masa panen sehingga mengakibatkan nilai ekonomisnya menurun (Soewito 1987: 29). Penyakit pada tanaman tomat yang umum ditemukan adalah kelayuan yang disebabkan oleh kapang Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Syder & Hansen (Fusarium wilt). Penyakit tersebut menyebabkan dedaunan yang dekat dengan tanah berubah warna menjadi kuning, layu, dan akhirnya mati. Penyakit tersebut menjalar ke arah batang dan seluruh bagian tanaman, sehingga akhirnya menyebabkan kematian tanaman tomat (Damicone dkk. 2003: 2). Penyakit lain yang sering menyerang tanaman tomat adalah busuk leher akar yang disebabkan oleh Corticium rolfsii (Sacc.) Curzi dan busuk batang yang disebabkan oleh Thanatephorus cucumeris (Frank.) Donk. Kedua penyakit tersebut lebih sering menyerang tanaman tomat pada kondisi tanah yang basah (Tindall 1983: 248; William dkk. 1993: 222). Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 6. B. PEMBUAHAN Bhatnagar dan Bhojwani (1974: 86, 88, 91--92 & 100) menyatakan bahwa pembentukan buah normal dimulai dengan adanya polinasi, yaitu menempelnya polen di stigma. Selanjutnya polen berkecambah dan membentuk tabung polen untuk mencapai ovul. Peristiwa bertemunya polen dengan ovul di dalam ovari disebut fertilisasi. Kemudian ovari akan membesar dan berkembang menjadi buah bersamaan dengan pembentukan biji. Mekanisme polinasi dan fertilisasi menghasilkan buah fertil yang memiliki biji. Pertumbuhan buah tomat disertai perubahan kandungan hormon auksin di dalam ovari. Auksin merupakan salah satu hormon tanaman yang dapat meregulasi banyak proses fisiologis, seperti pertumbuhan, pembelahan dan diferensiasi sel serta sintesis protein (Salisbury & Ross 1995: 37). Auksin yang dikenal juga dengan indole-3-acetic acid (IAA) dibiosintesis dari asam amino prekursor triptofan. Biosintesis tersebut menghasilkan senyawa perantara yang secara alami analog dengan IAA tetapi mempunyai aktifitas lebih kecil, seperti indole-3-acetinitrile (IAN), indole-3-pyruvic acid (IpyA) dan indole-3-acetodehyde (IAAld). Proses biosintesis auksin dibantu oleh enzim IAA-oksidase (Swain & Koltunow 2006: 2). Tanaman tomat memiliki kompleks protein yang berfungsi sebagai regulator dalam produksi auksin untuk inisiasi pertumbuhan dan perkembangan buah. Kompleks tersebut terdiri atas protein IAA9, auxin Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 7. response factor 8 (ARF8), dan satu protein yang belum teridentifikasi. Kompleks tersebut secara tidak langsung menginaktifkan peran ARF8 sebagai aktivator transkripsi gen-gen yang berperan dalam produksi auksin. Peristiwa polinasi dan fertilisasi akan menginisiasi auksin untuk berikatan dengan reseptornya yaitu transport inhibitor response 1 (TIR1). Mekanisme tersebut menyebabkan IAA9 terdegradasi, sehingga ARF8 menjadi molekul protein yang bebas. Molekul ARF8 selanjutnya akan menjadi aktif dan menstimulasi ekspresi dari gen-gen penyandi auksin yang akan digunakan untuk inisiasi pembentukan dan perkembangan buah (Gambar 1) (Goetz dkk. 2007: 362--363). Inisiasi pembentukan buah diawali dengan produksi auksin dalam jumlah yang relatif sedikit pada butir-butir polen. Pertumbuhan tabung polen setelah polinasi akan meningkatkan aktivitas pembentukan auksin. Auksin tersebut merangsang pembentukan auksin berikutnya pada biji. Selanjutnya, auksin yang dihasilkan biji akan merangsang pembelahan sel sekaligus merangsang pembentukan auksin pada buah. Konsentrasi auksin terus bertambah dalam beberapa hari setelah polinasi dan fertilisasi. Hal tersebut menyebabkan buah tumbuh secara aktif hingga mencapai ukuran optimal (Mondong dkk. 1983: 215). C. PARTENOKARPI Partenokarpi ialah mekanisme pembentukan buah tanpa melalui proses polinasi dan fertilisasi (Ficcadenti dkk. 1998: 463). Buah partenokarpi Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 8. biasanya tanpa biji (seedless) atau berbiji sedikit (Pandolfini dkk. 2002: 2). Partenokarpi kurang menguntungkan bagi program produksi benih atau biji, tetapi sangat bermanfaat bagi peningkatan kualitas dan produktivitas buah, terutama pada jenis tanaman komersial (Rotino dkk. 2005: 33). Sebagai contoh, partenokarpi pada terung dapat meningkatkan kualitas buah, sedangkan pada kiwi dapat meningkatkan produktivitas buah dan tidak membutuhkan serangga penyerbuk (polinator) (Donzella dkk. 2000: 85). 1. Jenis-jenis partenokarpi Menurut Gustafson tahun 1942 (lihat Rotino dkk. 2005: 2), partenokarpi dapat terjadi secara alami (genetik) atau buatan (induksi). Partenokarpi alami dibedakan menjadi dua tipe yaitu obligator dan fakultatif. Kedua tipe partenokarpi alami tersebut sangat jarang dijumpai pada tanaman (Rotino dkk. 2005: 33). Tipe obligator adalah partenokarpi alami yang terjadi tanpa adanya faktor atau pengaruh dari lingkungan. Hal tersebut dapat terjadi karena secara genetik tanaman memiliki gen penyebab partenokarpi (Swain & Koltunow 2006: 3--4). Tanaman tomat dapat membentuk buah partenokarpi secara alami karena memiliki gen mutan parthenocarpic fruit (pat). Perkembangan ovari pada tomat normal akan terjadi pada hari ke-2 setelah pembungaan, yaitu pada saat kantung embrio telah matang serta telah terjadi polinasi dan fertilisasi. Namun pada tanaman tomat yang memiliki gen mutan pat, Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 9. mekanisme tersebut terjadi 1--3 hari sebelum pembungaan. Ekspresi gen pat menyebabkan jaringan perikarp yang membatasi lokul, berproliferasi dan tumbuh ke arah dalam. Jaringan plasenta dan septum juga berproliferasi menjadi lebih lebar dan tebal. Ovul tereduksi sehingga gagal berkembang menjadi biji. Selanjutnya ketiga jaringan yang berproliferasi tersebut menjadi lunak dan berdaging sehingga terbentuk struktur buah (Mazzucato dkk. 1998: 112). Aktifnya gen pat akan memberikan sinyal pada kompleks protein IAA9/ARF8, yang berfungsi sebagai regulator dalam inisiasi pertumbuhan dan perkembangan buah, untuk menghasilkan auksin di ovari. Mekanisme tersebut menyebabkan buah memiliki kadar auksin yang cukup untuk kelangsungan pertumbuhan dan perkembangannya, meskipun tanpa adanya biji (Goetz dkk. 2007: 361). Tipe fakultatif adalah partenokarpi alami yang terjadi karena pengaruh lingkungan. Lewis (1942) (lihat Bhatnagar & Bhojwani 1983: 271) berhasil mendapatkan buah pir tanpa biji dengan cara memaparkan bunga pir pada suhu rendah selama 3--19 jam. Cochran (1936) (lihat Bhatnagar & Bhojwani 1983: 271) dapat meningkatkan pembentukan buah partenokarpi pada Capsicum dengan memaparkan tanaman yang sedang berbunga pada suhu 10o --16o C. Osborne dan Went (1953) (lihat Bhatnagar & Bhojwani 1983: 271) menyatakan bahwa pembentukan buah partenokarpi pada tanaman tomat dapat diinduksi dengan suhu rendah dan intensitas cahaya tinggi. Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 10. Partenokarpi buatan dapat diinduksi melalui aplikasi zat pengatur tumbuh, seperti auksin dan giberelin. Zat pengatur tumbuh sintetis yang umum digunakan untuk menginduksi pembentukan buah partenokarpi adalah 2-napthalene acetic acid (NAA), 3-indole butyric acid (IBA), 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid (2,4,5-T) dan dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). Senyawa-senyawa tersebut telah umum digunakan pada tanaman tomat, strawberry, blackberry, anggur, apricot, peach, cherry, apel, dan jeruk (Swamy & Khrishnamurthy 1980: 142). Menurut Gustafson tahun 1942 (lihat Pardal 2001: 46), pemberian auksin eksogen dapat menggantikan polinasi dan fertilisasi pada proses pembentukan dan perkembangan buah pada beberapa spesies tanaman. Hasil penelitian Foz dkk. (1999: 474) juga menunjukkan bahwa pemberian 2 g giberelin (GA) di ovari menyebabkan terbentuknya buah partenokarpi pada tomat non partenokarpi galur Madrigal dan Cuarenteno. Partenokarpi buatan juga dapat dilakukan dengan memanipulasi jumlah ploidi pada tanaman. Hal tersebut dapat ditempuh dengan persilangan biasa. Kihara (1951: 229) berhasil menyilangkan tanaman semangka diploid (induk jantan) dengan tanaman tetraploid (induk betina) menghasilkan tanaman hibrid (T1) triploid yang buahnya tanpa biji. Metode terbaru yang dicoba dan dikembangkan untuk menghasilkan partenokarpi buatan adalah melalui rekayasa genetik. Pembentukan buah partenokarpi melalui teknik rekayasa genetik dapat ditempuh melalui dua pendekatan. Pendekatan pertama dengan cara menghambat perkembangan Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 11. embrio atau biji tanpa memengaruhi pertumbuhan buah (Kosuge dkk. 1966: 3739), sedangkan pendekatan kedua dengan mengekspresikan fitohormon pada bagian ovari atau ovul untuk memacu perkembangan buah partenokarpi (Rotino dkk. 1997: 1398). Cara pendekatan pertama ditempuh melalui penggunaan gen yang bersifat merusak sel (sitotoksik), misalnya kombinasi gen iaaM dan iaaH dari bakteri Agrobacterium tumefaciens. Gen tersebut menghasilkan senyawa toksik terhadap sel-sel embrio atau biji. Pertumbuhan buah tetap berlangsung, tetapi tidak menghasilkan biji (Kosuge dkk. 1966: 3739). Cara pendekatan kedua dalam menghasilkan partenokarpi adalah melalui pengekspresian senyawa fitohormon IAA atau analognya pada bagian bakal buah (Rotino dkk. 1997: 1398). Cara tersebut didasari oleh pengetahuan bahwa aplikasi fitohormon sejenis auksin atau giberelin dapat menggantikan peran biji dalam merangsang pembentukan dan perkembangan buah (Pardal 2001: 46). 2. Gen partenokarpi DefH9-iaaM Rotino dkk. (1997: 1399) telah berhasil mengembangkan suatu metode baru agar tanaman mampu menghasilkan buah tanpa melalui tahap fertilisasi sehingga akan terbentuk buah tanpa biji. Metode tersebut dilakukan dengan menginsersikan gen partenokarpi DefH9-iaaM ke dalam genom tanaman. Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 12. Gen DefH9-iaaM terdiri atas dua sekuen gen yang spesifik. Sekuen pertama yaitu gen iaaM, berukuran 600 pb dan diisolasi dari bakteri Pseudomonas syringae vs savastanoi . Gen iaaM menghasilkan auksin dalam jaringan tanaman. Sekuen kedua ialah daerah promoter DefH9 (deficiens homologue 9) yang diisolasi dari Antirrhinum majus dan berukuran 1.350 pb (Gambar 2) (Ficcadenti dkk. 1998: 463). Gen partenokarpi DefH9-iaaM menyandi enzim indolasetamida monooksigenase yang mengkonversi triptofan menjadi indolasetamida (prekursor auksin IAA) yang diekspresikan pada ovul dan plasenta. Akibat ekspresi gen tersebut maka terbentuk buah partenokarpi tanpa melalui polinasi dan fertilisasi (Donzella dkk. 2000: 80). Bagian regulator DefH9 (promoter) dapat mengontrol ekspresi iaaM (pengkode IAA) hanya pada bagian plasenta dan ovul. Ekspresi IAA pada bagian plasenta memastikan bahwa partenokarpi terjadi sebelum polinasi, sedangkan pada ovul ditujukan untuk menggantikan peran biji dalam memacu pertumbuhan buah (Donzella dkk. 2000: 80). Gen DefH9-iaaM mampu menginduksi buah partenokarpi pada tanaman seperti tomat (Rotino dkk. 1997: 1398), terung (Donzella dkk. 2000: 81--83), strawberry dan raspberry (Mezzetti dkk. 2004: 1477--1479). Ekspresi gen DefH9-iaaM spesifik pada plasenta dan ovul meningkatkan produktivitas tomat karena 90--95% bunga mampu membentuk buah (Rotino dkk. 1997: 1398). Tanaman hibrid tomat yang mengandung gen Defh9-iaaM menunjukkan peningkatan produksi buah pada musim dingin (Acciari dkk. Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 13. 2000: 119). Insersi Gen DefH9-iaaM juga meningkatkan produktivitas buah terung hingga 30--35% dan memperbaiki kualitas buah (Donzella dkk. 2000: 81). Menurut Rotino dkk. (1997: 1399), tanaman tomat partenokarpi dengan insersi gen DefH9-iaaM menghasilkan buah yang mengandung sedikit biji atau bahkan tanpa biji (seedless) sehingga cocok untuk industri pembuatan saus atau pasta. Buah tomat tanpa biji dapat menurunkan biaya produksi untuk penyaringan biji dan meningkatkan kualitas saus atau pasta yang dihasilkan. D. UJI STABILITAS GEN SECARA MOLEKULER Salah satu metode yang dikembangkan untuk memperbaiki sifat tanaman adalah modifikasi genetik melalui rekayasa genetik. Rekayasa genetik ialah pembentukan kombinasi material genetik baru melalui penyisipan DNA ke dalam genom inang sehingga sisipan tersebut dapat diekspresikan di dalam inang. Tanaman hasil rekayasa genetik disebut tanaman transgenik (De Block dkk. 1984: 1681). Perakitan tanaman transgenik melalui rekayasa genetik dilakukan dengan metode teknologi transformasi genetik. Teknologi transformasi genetik adalah proses pengambilan molekul DNA donor dari lingkungan luar kemudian digabungkan ke dalam genom resipien (Yongbiao & Zhihong 2002: 161). Teknik transformasi yang umum digunakan adalah transformasi secara tidak langsung yaitu melalui media vektor A. tumefaciens. Gen asing yang akan ditransformasikan tersebut diletakkan pada segmen transfer DNA Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 14. (T-DNA) yang terletak pada plasmid Ti (tumor inducing) (Gama dkk. 1996: 440). Tanaman transgenik yang stabil memiliki transgen yang telah terintegrasi ke dalam genom dan diwariskan ke generasi berikutnya. Rasio individu transgenik dan nontransgenik yang terbentuk pada generasi berikutnya harus memenuhi rasio penyilangan monohibrid Mendel yaitu 3:1 (Christou dkk. 1992: 288). Kestabilan insersi transgen dalam tanaman transgenik dapat diketahui dengan melakukan uji stabilitas gen. Uji stabilitas gen dilakukan dengan mendeteksi transgen pada turunan tanaman transgenik menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Teknik PCR dapat mengamplifikasi fragmen transgen menggunakan primer spesifik, sehingga tanaman yang yang memiliki insersi transgen dapat terdeteksi (Hadiarto dkk. 2003: 165). Teknik tersebut terdiri atas tiga tahap utama yaitu isolasi deoxyribonucleic acid (DNA) genom, PCR, dan elektroforesis. 1. Isolasi DNA genom tanaman tomat transgenik partenokarpi Genom DNA merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme, termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA (Weaver & Hedrick 1997: 616). Isolasi DNA genom terdiri atas tiga tahap penting yaitu mengeluarkan kromosom dari dalam sel dengan suatu reaksi kimiawi, mendenaturasi protein dengan enzim proteinase, dan merusak ribonucleic acid (RNA) menggunakan enzim RNAse. Setelah tahap- Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 15. tahap tersebut, akan diperoleh DNA genom yang siap untuk dianalisis lebih lanjut (Muladno 2002: 9). Salah satu metode yang digunakan untuk isolasi DNA adalah single- step extraction genome DNA merupakan. Prosedur tersebut menggunakan Extract-N-AmpTM Plant PCR kit [Invitrogen] yang terdiri atas extraction solution, dilution solution, dan PCR reaction mix. Ketiga komponen kit tersebut mengandung semua bahan yang dibutuhkan untuk isolasi DNA genom dari daun tanaman sekaligus amplifikasi sekuens target (Wang dkk. 2008: 2). Komposisi bahan yang terdapat pada extraction solution menyebabkan beberapa prosedur isolasi DNA secara konvensional tidak perlu dikerjakan. Prosedur-prosedur tersebut meliputi pembekuan sampel dengan nitrogen cair, ekstraksi organik, purifikasi, dan presipitasi DNA. Dillution solution mengandung komposisi bahan yang dapat menetralisir substansi-substansi utama yang menghambat reaksi PCR. Polymerase chain reaction (PCR) reaction mix diformulasikan secara khusus untuk amplifikasi langsung DNA hasil isolasi. Formulasi tersebut dapat menghambat aktivitas polimerase selama persiapan reaksi PCR, menekan aktivitas polimerase sebelum siklus PCR, mengurangi amplifikasi non spesifik, dan meningkatkan produk target. Polymerase chain reaction (PCR) reaction mix juga memiliki formula REDextract-N-AmpTM plant PCR kit. Formula tersebut mengandung dye yang berfungsi sebagai tracking dyes Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 16. sehingga memungkinkan loading produk amplifikasi PCR secara langsung ke gel agarosa (Wang dkk. 2008: 3--4). 2. Amplifikasi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) Polymerase chain reaction (PCR) merupakan metode in vitro untuk mengamplifikasi fragmen nukleotida tertentu (DNA atau RNA). Teknik PCR menggunakan Taq DNA polymerase, template (DNA atau RNA), dan primer oligonukleotida. Primer akan menempel pada segmen amplifikasi (Davis dkk. 1994: 114). Metode PCR terdiri atas tiga tahap utama, yaitu denaturasi, annealing, dan polimerisasi (Klug & Cummings 1994: 402). Tahap denaturasi berlangsung pada suhu sekitar 94o C. Suhu yang tinggi tersebut digunakan untuk menghentikan semua reaksi enzimatik dan merusak ikatan hidrogen sehingga DNA untai ganda yang stabil akan terurai menjadi untai tunggal. Tahap annealing menggunakan suhu yang cukup rendah sehingga primer oligonukleotida dapat menempel pada situs yang tepat pada DNA template. Tahap terakhir adalah polimerisasi yang berlangsung pada suhu 72o C. Menurut Palumbi (1996: 209), enzim Taq DNA polymerase dapat bekerja secara optimum untuk mensintesis segmen DNA target dengan lengkap pada suhu tersebut. Primer merupakan bahan penting untuk menentukan keberhasilan amplifikasi. Primer berupa untai tunggal pendek yang mengandung nukleotida-nukleotida spesifik. Primer akan berikatan dengan sekuens Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 17. tertentu pada DNA template jika suhu yang digunakan pada tahap annealing sesuai. Primer didesain khusus untuk fragmen yang akan diamplifikasi. Desain primer spesifik dapat mengurangi produk PCR yang tidak diharapkan (Sambrook & Russell 2001: 85). Menurut Sharrocks (1994: 6), terdapat beberapa parameter yang dapat digunakan untuk memilih primer yang baik. Pertama, panjang primer sekitar 18--25 basa. Kedua, komposisi basa GC pada primer sekitar 45--55%. Kondisi tersebut akan menghasilkan suhu leleh (Tm) yang efisien sehingga menyebabkan terjadinya proses annealing yang spesifik terhadap fragmen target. Ketiga, primer tidak mengandung sekuen basa yang berulang. Keempat, lima basa terakhir pada ujung 3’ primer tidak mengandung lebih dari dua nukleotida G atau C yang letaknya berurutan. Kelima, pasangan primer didesain agar tidak terbentuk primer dimer. Primer dimer merupakan interaksi antara primer forward dan primer reverse sehingga membentuk struktur untai ganda DNA (Real Time PCR Info 2007: 1). 3. Elektroforesis Elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan berbagai macam molekul organik seperti DNA, RNA, dan protein (Klug & Cummings 1994: 397). Prinsip kerja elektroforesis adalah berdasarkan pergerakan molekul- molekul bermuatan negatif (anion) menuju kutub positif (katoda), sedangkan Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 18. molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda) (Russell 1994: 499). Elektroforesis gel adalah teknik pemisahan molekul organik dengan menggunakan matriks gel sebagai media terjadinya migrasi dari molekul- molekul organik tersebut. Matriks gel berupa pori-pori yang menyediakan ruang untuk pergerakan molekul organik sekaligus pemisahan molekul tersebut berdasarkan ukurannya. Pergerakan molekul organik pada matriks gel dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu ukuran molekul, jenis gel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, serta arus listrik (Ausubel dkk. 1998: 2.5A.5--2.5A.6 ). Elektroforesis dapat digunakan untuk mengamati produk amplifikasi. Elektroforesis menunjukkan hasil positif jika terlihat pita-pita (bands) DNA yang jelas pada gel. Pita-pita DNA tersebut hanya dapat dilihat di bawah sinar UV dengan pewarnaan fluoresens etidium bromida (Klug & Cummings 1994: 397). Etidium bromida (EtBr) mewarnai molekul DNA dengan cara menyisip di antara partikel basa DNA. Penyisipan etidium bromida akan meningkatkan daya fluoresensi DNA sehingga terlihat jelas di bawah sinar UV (Birren & Lai 1993: 79). Pita-pita yang terlihat pada gel elektroforesis menunjukkan ukuran molekul DNA. Molekul DNA tersebut dapat diketahui ukurannya dengan cara membandingkan posisi pita yang terbentuk dengan posisi pita marka DNA pada gel. Marka DNA yang biasa digunakan dalam analisis genetika Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008
  • 19. molekuler adalah (lambda) HindIII, BstEII, dan BstNI (Ausubel dkk. 1998: 2.5A.7). E. UJI EKSPRESI FENOTIPIK Uji ekspresi fenotipik pada tanaman hasil transformasi genetik dilakukan untuk mengetahui tingkat ekspresi gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman resipien. Hasil uji ekspresi fenotipik secara tidak langsung juga dapat digunakan untuk memilih strategi transformasi terbaik (Garg dkk. 2006: 276). Parameter fenotipik partenokarpi yang harus dianalisis meliputi jumlah tandan, jumlah bunga per tandan, jumlah buah per tandan, diameter buah, berat per buah, dan jumlah biji (Hidayat 2003: 8). Parameter jumlah bunga, jumlah buah, dan berat buah merupakan parameter yang menunjukkan produktivitas buah. Paramater jumlah biji akan menunjukkan ekspresi gen partenokarpi DefH9-iaaM pada tanaman tomat transgenik (Pardal 2001: 45). Gen DefH9-iaaM meningkatkan jumlah rata-rata bunga majemuk per tandan pada anggur (Constantini dkk. 2007: 1690). Gen DefH9-iaaM meningkatkan berat strawberry transgenik sebesar 24% dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan berat juga diimbangi dengan peningkatan ukuran buah (Mezzetti dkk. 2004: 5). Buah positif partenokarpi umumnya seedless dan memiliki ciri yang sama dengan buah normal, yaitu bentuk buah tidak cacat dan warna buah cerah (Gorguet dkk. 2007: 756). Analisis Stabilitas..., Sutini, FMIPA UI, 2008