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  1. 1. MÓDULO V Chips de DNA
  2. 2. Chips de DNA: janelas para o genoma das células Laboratório Virtual de Biotecnologia Introdução Em cientistas 1995, uma utilizem esta ferramenta equipa revolucionária nas suas investigações, multidisciplinar da Universidade de abordando de uma nova forma os Stanford problemas da sua área científica. publicou um artigo que descrevia uma nova tecnologia que revolucionou cientistas a forma abordam o como os estudo da O que são chips de DNA? Os chips de DNA são ferramentas expressão e regulação génica. Essa modernas nova tecnologia baseia-se nos chips possibilitam a análise da expressão de DNA e permite a monitorização génica de uma ou mais amostras. da Biotecnologia que simultânea da expressão de centenas Existem vários tipos de chips de ou milhares de genes em diferentes DNA (Fig.1). Alguns são “caseiros”, ou tipos de células. seja, são feitos em laboratórios de O impacto desta tecnologia na investigação científica investigação para serem utilizados deve-se nos vários grupos de investigação do principalmente ao facto dos chips de próprio laboratório, enquanto outros DNA da são comercializados por empresas de expressão do genoma de uma célula Biotecnologia que os produzem a um no seu todo. ritmo intenso. No entanto, todos se permitirem Antes do a análise desenvolvimento dos baseiam no mesmo princípio: uma chips de DNA, a investigação era feita sequência de tal modo que eram necessários tendência a procurar e a ligar-se à vários dias para analisar a expressão sua de um único gene. Os chips de DNA fenómeno denominado hibridação. permitem, num único dia, a análise simultânea de milhares de genes. Segundo muitos de DNA sequência investigadores, entendimento colocados milhares funcionamento onde de são pontos ordenados de tal modo que todos presentes num organismo. As suas estão à mesma distância dos seus aplicações são já numerosas, sendo pontos vizinhos. Em cada um desses de pontos está adsorvida uma sequência que cada os e silicone) genes esperar todos complementar, uma lâmina de microscópio ou uma de de tem uma placa de suporte (normalmente membrana interacção RNA Um chip de DNA é constituído por esta tecnologia será a chave para o do ou vez mais 2
  3. 3. de DNA (denominada sonda) que que, numa experiência real, é pode corresponder a um gene, ou a necessário um passo adicional para parte da sua sequência. que se possam observar e analisar os resultados. Normalmente, chips de DNA a utilização numa de experiência envolve as seguintes etapas: Isolamento do mRNA – a primeira etapa de uma experiência deste tipo corresponde à selecção das células A B Figura 1 – Chip de DNA produzido pela empresa Affymetrix (A) e chip de DNA “caseiro” (B). Para que possa expressar um gene, uma célula tem que fazer a sua transcrição (construindo uma “cópia” da sequência de DNA do gene, ou seja, construindo uma molécula de mRNA) para depois poder recorrer aos ribossomas, que farão a tradução do mRNA numa proteína funcional. Esta sucessão de acontecimentos processa-se do seguinte modo: que se pretendem estudar. Se, por exemplo, se estiver a analisar a expressão génica num tipo de cancro, iremos extrair o mRNA de uma célula cancerosa mas também de uma célula normal para termos um controlo, um termo de comparação. A extracção do mRNA deve ser bem efectuada, ou seja, a solução extraída não deve conter proteínas ou DNA, pois estas moléculas podem interferir nos resultados finais. Formação do cDNA – de modo a DNA (gene) → mRNA → proteína Assim, é possível concluir que prevenir que o mRNA se degrade, é necessário produzir molécula cada gene que esteja a ser expresso mais num determinado momento vai ter o através do uso de uma enzima, a seu mRNA correspondente presente transcriptase reversa. Os nucleótidos na célula. Extraindo esse mRNA e que formam o cDNA são ligados a colocando-o num chip de DNA que uma molécula de corante fluorescente contenha e, assim, toda a molécula de cDNA mesma todos célula, os genes poderemos dessa esperar fica estável, uma corada, denominada o que cDNA, permitirá a que esse mRNA se ligue à sequência posterior visualização. É necessário de DNA complementar presente no que os cDNA’s das duas amostras chip. sejam Sabendo a que gene corados com corantes comprimento corresponde aquele ponto poderemos diferente saber que ele está a ser expresso na Normalmente utiliza-se um corante célula. Deve no entanto referir-se verde para a amostra de de de onda. células 3
  4. 4. normais (controlo) e um corante vermelho para a amostra em estudo. Isto permitirá a distinção entre os resultados de ambas as amostras. Hibridação no chip de DNA – após terem sido corados, os cDNA’s de ambas as amostras são misturados e postos em contacto com o chip de DNA. Nessa altura, o chip é posto a incubar a uma temperatura de 42 ºC. Cada cDNA que encontre a Figura 2 – Parte da imagem final de um chip de DNA. sua sequência complementar vai hibridar. Como se pode observar, existem Após 12 horas, o chip de DNA é alguns pontos do chip de DNA que lavado para retirar os cDNA’s que não surgem vermelhos (correspondem a hibridaram genes expressos exclusivamente nas com a sua sequência complementar. células Aquisição da imagem – para que se surgem possa saber que cDNA’s hibridaram e, genes expressos exclusivamente nas consequentemente, que genes estão a células ser em observam-se pontos de cor amarela. análise, temos que obter uma imagem Estes pontos correspondem a genes dos pontos do chip de DNA. Para isso que são expressos de igual modo em temos que recorrer a um scanner. O ambos os tipos de células. De notar scanner emite dois laser’s por toda a ainda que nem todos os pontos têm a área do chip de DNA. Cada laser mesma excita corantes intensidade o ponto apresenta, mais fluorescentes que estão ligados aos cDNA está presente nesse ponto e, nucleótidos consequentemente, expressos um pelas dos dos células dois cDNA’s. Esses cancerosas) verdes e outros que (correspondem normais). No intensidade: entanto, quanto mais a o mais gene corantes emitem então luminosidade correspondente está a ser expresso num comprimento de onda diferente: na célula. Os pontos que se mantêm um dos corantes emite na zona dos pretos representam genes que não verdes e o outro emite na zona dos são expressos por nenhum dos tipos vermelhos. Ambas as imagens são de células, não havendo qualquer recolhidas cDNA e combinadas pelo que hibride com essas computador, obtendo-se uma imagem sequências. final semelhante à que se apresenta Análise dos resultados – após se ter na figura 2: obtido a imagem do chip de DNA, é necessário interpretar os resultados 4
  5. 5. obtidos. Como facilmente se imagina, variação das condições a que estão analisar os resultados de milhares de sujeitas as células. genes um a um pode tornar-se uma Outra abordagem possível é a tarefa muito morosa. Deste modo, os análise de padrões genéticos. Essa cientistas análise é muito importante em várias têm que recorrer a programas informáticos desenvolvidos áreas para essa função e que processam estudo toda a informação contida num chip envelhecimento, estudo da progressão de DNA principalmente através do de certas doenças, estudo dos efeitos tratamento estatístico dos resultados. dos fármacos sobre as células-alvo de desse Aplicações dos chips de DNA de DNA são praticamente ilimitadas. das abordagens da divisão fármaco, tais celular como: e do identificação de substâncias carcinogénicas, etc. As potenciais aplicações dos chips Uma investigação tornada Além destas áreas, este tipo de abordagem tem-se revelado muito útil na comparação entre tecidos normais possível através do uso dos chips de e DNA é a possibilidade de poder “ver o padrões que acontece” numa célula após uma situações de cancro. perturbação específica tecidos cancerosos, genéticos identificando indiciadores de ou, A utilização de chips de DNA no simplesmente, poder comparar o que diagnóstico e classificação de certas acontece doenças em diferentes tipos de genéticas é considerada células. Os chips de DNA permitirão a como uma prioridade uma vez que os observação chips têm muitas vantagens quando de anteriormente fenómenos impossíveis de comparados com os métodos de observar, tal como ocorreu após a diagnóstico tradicionais actualmente invenção utilizados. do telescópio e do microscópio. Através dos chips de DNA, os cientistas conseguem abrir uma janela que permite observar O futuro dos chips de DNA Se tivermos em conta o directamente o genoma das células e desenvolvimento o modo como este é utilizado por últimos cinco anos, podemos afirmar estas em cada situação específica. com algum grau de confiança que Os chips de DNA podem ainda ser tecnológico dos esta tecnologia estará cada vez mais utilizados para descobrir novos genes. acessível Chips que incluam genes de função utilizada. Não é difícil prever que actualmente desconhecida permitirão dentro de pouco tempo os chips de descodificar essa função através da DNA estarão presentes em todos os e consultórios será cada médicos vez e mais serão 5
  6. 6. utilizados para prever certas doenças genéticas de manifestação tardia. Além disso, o seu uso na investigação irá muito provavelmente revolucionar o nosso modo de pensar sobre o processo de desenvolvimento de doenças e sobre o próprio diagnóstico molecular. 4.1. Interprete os resultados obtidos, Questões de análise No Laboratório Biotecnologia de identificando os genes mais expressos uma nas células tipo A e tipo B e os genes Virtual encontrará animação que ilustra e explica como expressos em ambos os tipos. funcionam os chips de DNA (canal 3 da LVBtv). 1 – Descreva as diferentes etapas de uma experiência que envolva utilização dos chips de DNA. 2 – Refira investigativas duas abordagens tornadas possíveis através do uso dos chips de DNA. 3 – Indique as principais áreas onde se podem aplicar os chips de DNA. 4 – Foi realizada uma experiência utilizando um chip de DNA para analisar a expressão génica de dois tipos de células diferentes: tipo A e tipo B. A amostra obtida a partir das células tipo A foi corada a verde e a amostra obtida a partir das células tipo B foi corada a vermelho. Obtiveram-se os seguintes resultados: 6
  7. 7. ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA Teoria: Princípios: uma amostra é 7 O resultado obtido para Conclusões: influencido pela análise simultânea de outra amostra? Registos/Observações: A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico Fígado (verde) Epiderme (verde) Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde) Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho) Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho) Tubo B C D E F G H I J K L
  8. 8. Teoria: Princípios: ALA METODOLÓGICA 8 ALA CONCEPTUAL Conclusões: Todas as células do organismo expressam os mesmos genes? Registos/Observações: A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico Fígado (verde) Epiderme (verde) Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde) Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho) Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho) Tubo B C D E F G H I J K L
  9. 9. Teoria: Princípios: ALA METODOLÓGICA Uma célula normal e 9 ALA CONCEPTUAL Conclusões: uma célula cancerosa expressam os mesmos genes? Registos/Observações: A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico Fígado (verde) Epiderme (verde) Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde) Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho) Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho) Tubo B C D E F G H I J K L

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