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  • 1. MÓDULO I Electroforese
  • 2. Electroforese: uma técnica electrizante Laboratório Virtual de Biotecnologia Introdução moléculas de DNA que se encontrem A electroforese é uma das técnicas em suspensão numa solução básicas da Biologia molecular e é uma electrolítica (isto é, que possua iões das mais utilizadas pelos cientistas no livres) podem ser separadas através seu técnica da aplicação de uma dada voltagem. permite a separação de moléculas de No final do processo, as cadeias de diferentes tamanhos. Antes do seu DNA aparecimento, de (eléctrodo fragmentos de DNA, por exemplo, era moléculas feita entanto, o objectivo desta técnica é trabalho diário. a separação recorrendo laborioso: a Esta a um método ultracentrifugação por estarão separar próximas de os carga ânodo que positivo), do atrai negativa. fragmentos de No várias velocidade de sedimentação. Neste moléculas por tamanho. A solução é método, as amostras de DNA eram “peneirar” esses fragmentos utilizando sujeitas a uma centrifugação de alta para esse efeito crivos moleculares. velocidade envoltas num gradiente de As sal através ou açúcar que separava os fragmentos por tamanho. electroforese poliacrilamida em pela corrente gel de dos poros do crivo, passam ou são retidas. O crivo utilizado é o gel de agarose separar solidificar, este gel forma uma rede fragmentos de DNA. A partir daí esta através da qual passam as moléculas técnica disseminou-se de tal modo de DNA. e rápida uma crivo “empurradas” técnica simples como desse são eléctrica, e, de acordo com o tamanho Em 1970, Daniel Nathans utilizou a moléculas para ou de poliacrilamida. Ao que, actualmente, ela é utilizada em Para que se possa utilizar esta virtualmente todos os laboratórios de técnica, é necessário montar todo o biologia molecular. material necessário: Primeiro, é necessário preparar o gel O que é a electroforese? de agarose (mais utilizado do que o Electroforese significa literalmente gel de poliacrilamida). Para isso, “transportar através de electricidade”. dissolve-se agarose (uma forma muito Tem pura de agar, substância obtida a por base o princípio que determina que a carga global de uma partir cadeia de DNA é negativa. Portanto, solução-tampão que necessariamente de algas marinhas) com a 2
  • 3. irá cobrir o gel na montagem final do pH da solução estáveis. Só depois de material. Normalmente, tudo electroforese de coberto pela solução- -tampão é que se retira o pente, solução-tampão Tris-Acetato de EDTA ficando os poços onde se vão colocar (TAE). as amostras devidamente delimitados Aquece-se a a utiliza-se estar a facilitar DNA, na mistura dissolução e para deita-se no gel (Fig.1). cuidadosamente a mistura na tina de electroforese, recipiente que dará Quanto às amostras que serão forma ao gel e onde irá ocorrer a carregadas electroforese. realçar solidifique, Antes que que elas é são importante previamente misturadas com o tampão de amostra adequado o pente que fará os poços (Loading dye), que tem como principal onde se colocarão as amostras. Após função ter solidificado, obtém-se o gel que amostra e, assim, impedir que esta servirá de suporte à electroforese e comece a flutuar no tampão antes que de crivo para as moléculas que irão a voltagem seja aplicada ao sistema. migrar. De seguida, preenche-se a Além disso, o tampão de amostra tina de electroforese com solução- possui um corante, o que possibilita a -tampão até o gel ficar totalmente visualização coberto é electroforese (uma vez que o DNA não razões: é visível a olho nu). Normalmente possibilita a passagem da corrente utiliza-se como tampão de amostra eléctrica e mantém as moléculas e o uma mistura de azul de bromofenol importante esta. por Esta duas no gel gel, local por coloca-se o no solução aumentar do a densidade progresso da da Figura 1 – Montagem do material necessário para realizar a electroforese. 3
  • 4. (Corante), xileno-cianol e glicose ou O gel corado é posteriormente glicerol (para aumentar a densidade), exposto a luz ultravioleta (UV). O dissolvidos na solução-tampão. complexo Quando todo etídio, quando observado sob a luz UV, preparado e todas as amostras são torna-se fluorescente indicando a sua carregadas nos devidos poços, inicia- posição no gel. É importante perceber -se a electroforese: liga-se a fonte de que uma banda de DNA observada no energia, o que faz com que seja gel de agarose não corresponde a fornecida corrente a cada um dos uma única molécula de DNA mas sim eléctrodos presentes de ambos os a lados idênticas, todas do mesmo tamanho. tina material de está da o DNA-brometo de electroforese, vários milhões de moléculas criando-se um campo eléctrico ao longo do gel. Os fragmentos de DNA iniciam a sua migração, abandonando os poços e movendo-se através do gel de agarose. O negativamente, DNA, migra carregado através dos poros do gel em direcção ao eléctrodo carregado positivamente (ânodo). O movimento visível das moléculas do corante (que também migram em direcção ao ânodo) permite controlar a migração relativa das moléculas de DNA, que, nesta fase, não se conseguem visualizar. Figura 2 – Moléculas de brometo de etídio Após a electroforese, é necessário intercaladas na dupla hélice do DNA. corar o DNA para podermos visualizar os resultados. Para isso, mergulha-se Aplicações o electroforese gel numa solução diluída de brometo de etídio. O brometo de etídio difunde-se através do gel A da técnica electroforese diversas áreas, é de aplicada sempre que em é onde necessário proceder à separação de estão os fragmentos de DNA. Uma vez fragmentos de DNA ou de outras que o brometo de etídio moléculas. Dada a sua simplicidade e concentrando-se molécula planar, moléculas de (Fig.2). nas regiões é uma nas facilidade corando-as substituiu intercala-se DNA, de uso, outras esta técnica técnicas de separação. É utilizada para visualizar fragmentos provenientes da digestão 4
  • 5. de enzimas visualizar de restrição ou para produtos da reacção de PCR. A análise dos padrões de bandas obtidos no gel de agarose é muito importante no diagnóstico de várias doenças genéticas, por exemplo. Questões de análise No Laboratório Virtual de Biotecnologia encontrará dois vídeos que ilustram e explicam algumas etapas da electroforese (canal 4 e 5 da LVBtv). 1 – Descreva o que ocorre durante uma electroforese. 2 – Enumere as principais vantagens desta técnica relativamente a outras utilizadas anteriormente para separar moléculas de DNA. 3 – Faça necessário uma para lista do realizar material uma experiência utilizando esta técnica. 4 – Indique duas aplicações desta técnica. 5
  • 6. ALA METODOLÓGICA 6 ALA CONCEPTUAL Teoria: Durante a electroforese Conclusões: as moléculas de DNA Princípios: migram todas à mesma velocidade? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Tamanho da molécula de DNA 300 pb 900 pb 1700 pb Pista 1 Pista 2 Pista 2
  • 7. ALA METODOLÓGICA 7 ALA CONCEPTUAL Teoria: A concentração em Conclusões: agarose do gel Princípios: influencia a migração das moléculas de DNA? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Tamanho da molécula de DNA 300 pb 900 pb 1700 pb Pista 1 Pista 2 Pista 2
  • 8. ALA METODOLÓGICA 8 ALA CONCEPTUAL Teoria: A migração de um Conclusões: fragmento de DNA Princípios: influencia a migração de outro? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Tamanho da molécula de DNA 300 pb 900 pb 1700 pb Pista 1 Pista 2 Pista 2

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