Tutor imunologi lulut

1,813 views
1,587 views

Published on

Published in: Technology, Business
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,813
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
98
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Tutor imunologi lulut

  1. 1. 1 Tutor Imunologi Pemeriksaan ANA denganMetode Imunofluoresens Indirek Lulut Kusumawati – Betty A Tambunan
  2. 2. 2 PENDAHULUANSystemic Lupus Erythematosus atau SLE :  Penyakit autoimun sistemik kronis  Pembentukan berbagai antibodi yang membentuk kompleks imun  Inflamasi pada berbagai organ
  3. 3. 3 Gejala klinis SLE Kulit GinjalKardiopulmonal Limfadenopati Gastrointestinal Otot-tulang Neuropsikiatri
  4. 4. 4 Diagnosis SLEKlinis LaboratoriumKriteria Hematologi ACR Imunologi
  5. 5. 5 • Autoantibodi spesifik terhadap asam nukleat dan nukleoprotein • Antibodi yang sering ditemukan dalam serum dan jaringan penderita SLE • Spesifik terhadap antigen determinannyaANA
  6. 6. 6 Pemeriksaan ANA Pemeriksaan skrining Sensitivitas 95%. Spesifitas 90%Beberapa metode : ELISA, IFA , imunobloting
  7. 7. 7Pemeriksaan ANA dengan Metode Imunofluoresens Indirek Mendeteksi berbagai macam antigen nukleus, termasuk DNA, RNA dan protein
  8. 8. 8Pemeriksaan ANA dengan Metode Imunofluoresens Indirek 4 tipe pola fluoresens : Homogen • Inti sel berfluoresens homogen • Inti sel berfluoresensi, sebagian besar pada daerah Perifer atau melingkar tepi inti. • Inti sel tidak berfluoresens secara rata dan nukleoli Speckled atau bercak tidak tercat. • Nukleoli dapat homogen atau tidak teratur. Nukleolar
  9. 9. 9Pemeriksaan ANA dengan Metode Imunofluoresens Indirek
  10. 10. 10EUROIMMUN
  11. 11. Prinsip Pemeriksaan 11 EUROIMMUN Dengan metode imunofluoresens indirek Antibodi antinuklear berikatan dengan antigen (pada sel HEp-20-10 dan hati primata) membentuk kompleks Ag-Abdideteksi menggunakan Ig berlabel fluoresens dan diperiksa dengan mikroskop fluoresens.
  12. 12. 12 Bahan dan Alat• Slide BIOCHIPS• Larutan konjugat , volume 1,5 ml.• Kontrol positif, volume 0,25 ml.• Kontrol negatif, volume 0,1 ml.• Garam untuk PBS, pH 7,2• Tween 20, volume 2 ml.• Embedding medium, volume 3 ml.• Cover glass
  13. 13. 13 Peralatan lain Reagent tray Moist Chamber Pipet otomatis 1000 µl Pipet otomatis variabel 5-10 µl Tip Bak perendam berisi larutan PBS-Tween.
  14. 14. 14 Sampel Pemeriksaan Serum atau plasma EDTA, heparin atau sitras. Stabil pada penyimpanan 2-80C selama 14 hari. Sampel yang sudah diencerkan harus dikerjakan pada hari yang sama.
  15. 15. 15 Persiapan Pemeriksaan Slide BIOCHIPs : membuka pelindung slide inkubasi pada suhu ruang (15 menit) Meletakkan larutan konjugat, kontrol positif, kontrol negatif dan sampel pada suhu ruangan (20-260C), dicampur sampai homogen. PBS-Tween. 1 bungkus garam PBS + 1 liter aqua destilata + 2 ml Tween 20. Mengencerkan larutan kontrol dengan PBS-Tweeen. Mengencerkan serum sampel dengan PBS-Tween dengan perbandingan 1:100.
  16. 16. 16 Tahap PemeriksaanEUROIMMUN - Teknik TITERPLANE1. Prepare 6. Pipette2. Dilute 7. Incubate3. Pipette 8. Wash4. Incubate 9. Embed5. Wash 10.Evaluate
  17. 17. 17 Tahap Pemeriksaan EUROIMMUN - Teknik TITERPLANEPREPARE Mengecek reagent tray dan mempersiapkan slide BIOCHIPs.DILUTE Mengencerkan serum sampel sesuai dengan prosedurPIPETTE Meneteskan 25 µl sampel pada reagent tray, jangan sampai terbentuk gelembung udara.
  18. 18. 18 Tahap Pemeriksaan EUROIMMUN - Teknik TITERPLANEINCUBATE Meletakkan slide BIOCHIPs pada reagent tray untuk memulai reaksi dan inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan (18-250C) dalam moist chamber.WASH Membilas slide BIOCHIP dengan PBS-Tween selama 1 detik, kemudian merendam slide dalam larutan PBS-Tween selama 5 menit. Goyang-goyangkan slide beberapa kali dan mengeringkan slide.
  19. 19. 19 Tahap Pemeriksaan EUROIMMUN - Teknik TITERPLANEPIPETTE Meneteskan 20 µl larutan konjugat pada reagent tray yang bersih, jangan sampai terbentuk gelembung udara.INCUBATE Meletakkan slide BIOCHIPs pada reagent tray untuk memulai reaksi dan inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan (18-250C) dalam moist chamber.
  20. 20. Tahap Pemeriksaan EUROIMMUN - 20 Teknik TITERPLANEWASH Membilas slide BIOCHIP dengan PBS-Tween selama 1 detik, kemudian merendam slide dalam larutan PBS-Tween selaa 5 menit. Goyang-goyangkan slide beberapa kali dan mengeringkan slide.EMBED Meneteskan 10 µl embedding medium pada cover glass dan menempatkan slide BIOCHIP pada cover glassEVALUATE Membaca dengan mikroskop fluoresens dengan pembesaran 200x dan 450x
  21. 21. 21 Hasil Pemeriksaan Pemeriksaan dengan mikroskop fluoresens dilakukan dengan segera. Lapangan pandang pemeriksaan harus dicari dengan tepat dimana sel terdistribusi dengan rata dan berfluoresensi dengan rata.
  22. 22. 22 Hasil PemeriksaanHomogen Perifer
  23. 23. 23 EUROIMMUNSpeckled/bercak Nukleolar
  24. 24. 24
  25. 25. 25 PENDAHULUANGejala klinis bervariasi : Kulit : makolupapular, “butterfly Rash”, purpura, urtikaria. Ginjal : glomerulonefritis akut / kronis, gagal ginjal. Limpadenopati perifer dan aksila, splenomegali. Kelainan kardiopulmonar : persisten takikardi, perdarahan alveoli akut. Kelainan gastrointestinal : perforasi pada saluran cerna. Kelainan pada otot dan tulang : poliartritis, osteonekrosis. Kelainan neuropsikiatri : penurunan daya ingat, mania, bahkan sampai terjadi shcizoprenia. Kelainan pada saat kehamilan.
  26. 26. 26 Pemeriksaan ANA dengan Metode Imunofluoresens Indirek Pola fluoresensi nukleus menunjukkan jenis antibodi yang terdapat dalam serum pasien, dan dikenal adanya empat pola dasar.  Pewarnaan homogen atau difus, biasanya mencerminkan antibodi terhadap kromatin, histon dan DNA rantai ganda.  Pola pewarnaan melingkar atau perifer, paling sering menunjukkan adanya antibodi terhadap DNA rantai ganda.  Pola bercak, adalah pola yang paling umum dan menunjukkan adanya bercak yang berukuran seragam atau berbeda-beda. Pola ini menggambarkan adanya antibodi terhadap unsur nukleus non-DNA, misalnya antibodi terhadap histon dan ribonukleoprotein. Contohnya antigen SS-A dan SS-B.  Pola nukleolar, menggambarkan adanya sedikit bintik-bintik fluoresensi yang terputus di dalam nukleus yang memperlihatkan antibodi terhadap RNA nukleolus. Pola ini paling sering dilaporkan terhadap para pasien sklerosis sistemik.
  27. 27. 27 EUROIMMUN - Prinsip pemeriksaan : Substrat yang terdiri dari kombinasi HEp-20-10 dan hati primata diinkubasi dengan serum penderita yang telah diencerkan. Jika reaksi positif, antibodi spesifik kelas IgA, IgG dan IgM akan berikatan dengan antigen. Selanjutnya antibodi yang terikat diwarnai dengan antibodi anti-human yang dilabel fluoresens dan dilihat dengan mikroskop fluoresens.
  28. 28. 28 Bahan dan Alat• Slide BIOCHIPS, terdiri dari 5 x 2 BIOCHIPS yang dilapisi HEp-10-20 dan hati primata.• Larutan konjugat yang berisi Fluorescein-labelled anti human IgG dari kambing, volume 1,5 ml.• Kontrol positif, berisi autoantibodi antinuklear (ANA) dari manusia, volume 0,25 ml.• Kontrol negatif, berisi autoantibodi negatif dari manusia, volume 0,1 ml.• Garam untuk PBS, pH 7,2• Tween 20, volume 2 ml.• Embedding medium, volume 3 ml.• Cover glass
  29. 29. 29 Persiapan Pemeriksaan Mengencerkan larutan kontrol dengan PBS-Tweeen. Larutan kontrol tahan selama 6 bulan pada suhu penyimpanan 2-80C Mengencerkan serum sampel dengan PBS-Tween dengan perbandingan 1:100. Caranya menambahkan 10 µl serum dengan 990 µl PBS-Tween, kemudian dicampur dengan vortex selama 4 detik. PBS-Tween. Melarutkan satu bungkus garam PBS dengan 1 liter aqua destilata, ditambah 2 ml Tween 20. Larutan PBS-Tween yang sudah jadi dapat disimpan selama 1 minggu pada suhu 2-80C, dan jika tampak berkabut atau terkontaminasi larutan harus dibuang.
  30. 30. 30 EUROIMMUNTahap PemeriksaanEUROIMMUN mengembangkan teknik TITERPLANE untuk menstandardisasi uji imunologi ini. Meneteskan 25 µl sampel pada reagent tray, jangan sampai terbentuk gelembung udara. Meletakkan slide BIOCHIP pada reagent tray untuk memulai reaksi. Inkubasi slide selama 30 menit pada suhu ruangan (18-250C) dalam moist chamber. Membilas slide BIOCHIP dengan PBS-Tween selama 1 detik, kemudian merendam slide dalam larutan PBS-Tween selama 5 menit. Menggoyang-goyangkan slide beberapa kali pada awal, pertengahan dan akhir perendaman. Mengeringkan slide dengan cara meletakkan slide pada posisi miring. Meneteskan 20 µl larutan konjugat pada reagent tray yang bersih, jangan sampai terbentuk gelembung udara. Meletakkan slide BIOCHIP pada reagent tray untuk memulai reaksi. Inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan (18-250C) dalam moist chamber. Membilas slide BIOCHIP dengan PBS-Tween selama 1 detik, kemudian merendam slide dalam larutan PBS-Tween selama 5 menit. Menggoyang-goyangkan slide beberapa kali pada awal, pertengahan dan akhir perendaman. Mengeluarkan slide BIOCHIP dari PBS-Tween dan keringkan. Meneteskan 10 µl embedding medium pada cover glass dan menempatkan slide BIOCHIP pada cover glass Membaca dengan mikroskop fluorosens dengan pembesaran 200x dan 450x.
  31. 31. 1. Ruam malar2. Ruam discoid Kriteria 313. Fotosensitivitas4. Ulkus mulut ACR5. Artritis6. Serositis : a. Pleuritis b. Pericarditis7. Gangguan ginjal : a. Proteinuria > 0,5 gr/24 jam atau + 3 persisten b. Adanya cast seluler8. Gangguan neurologi : a. Kejang atau b. Psikosis9. Gangguan hematologi : a. Anemia hemolitik b. Leukopeni < 4.000/mm3 pada 2 kali pemeriksaan c. Limfopeni < 1.500/mm3 pada 2 kali pemeriksaan d. Trombopeni < 100.000/mm310. Gangguan imunologi : a. Peningkatan kadar anti-dsDNA atau b. Antibodi anti-Sm c. Antibodi antifosfolipid positif berdasar pada : 1. Peningkatan kadar IgG atau IgM antibodi antifosfolipid 2. Lupus koagulan positif dengan metode standar yang dianjurkan 3. Positif palsu untuk sifilis ada selama 6 bulan11. Peningkatan antibodi antinuclear
  32. 32. 32AUTOIMMUNE DISEASESConnective Tissue Diseases (CTD) 1. Rheumatoid Arthritis 2. Systemic Lupus Erythematosus 3. Antiphospholipid Antibody Syndrome 4. Raynaud Phenomenon 5. Systemic Sclerosis ( Scleroderma ) 6. Idiopathic Inflammatory Myopathies (Polymyositis & Dermatomyositis) 7. Sjögren Syndrome 8. Wegner Granulomatosis
  33. 33. Frequency (%) of autoantibodies in rheumatic diseases 33 RA SLE SjS DS LS PD WG ANA 30-60 95-100 95 80-95 80-95 80-95 0-15 Anti-native DNA 0-5 60 0 0 0 0 0Rheumatoid Fact 80 20 75 30 30 33 50 Anti-Sm 0 10-25 0 0 0 0 0 Anti-SS-A 0-5 15-20 65 0 0 0 0 Anti-SS-B 0-2 5-20 65 0 0 0 0 Anti SCL-70 0 0 0 33 20 0 0 Anti centromere 0 0 0 1 50 0 0 Anti Jo-1 0 0 0 0 0 20-30 0 ANCA 0 0-1 0 0 0 0 93-96 RA = Rheumatoid arthritis SLE = Systemic lupus erythematosus SjS = Sjögren’s syndrome DS = Diffuse scleroderma LS = Limited scleroderma (CREST syndrome ) PD = Polymyositis / dermatomyositis WG = Wegener’s granulomatosis
  34. 34. 34
  35. 35. 35
  36. 36. 36 Kriteria Laboratorium Hematologi LE sel positif Adanya gangguan hematologi :  Anemia hemolitik  Leukopeni < 4.000/mm3 pada 2 kali pemeriksaan  Limfopeni < 1.500/mm3 pada 2 kali pemeriksaan  Trombopeni < 100.000/mm3
  37. 37. 37 Anti dsDNA Antibodies to dsDNA react with epitopes which are situated in the deoxyribophosphat framework of the DNA (outer region Antibodies to dsDNA are found exclusively in cases of systemic lupus erythematosus Because of the correlation between antibody concentration and disease activity, measurement of antibody titre provides a suitable means of monitoring therapy
  38. 38. 38 Anti SmithAnti-Sm are highly specific for a diagnosis of SLE (>99%),but only about 25% of SLE patients have this antibodiesAnti-Sm are not strongly associated with specific clinicalfeatures of SLE, but might appear with disease evolutionTiters can fluctuate with disease activity & treatment, butserial monitoring does not effectively predict relapsImmunodiffusion (ID) has been the standard technique fordetermination of anti-Sm
  39. 39. 39 Anti RNP Anti-nRNP are detected in 100% of patients with MCTD & approximately 30% of patients with SLE The presence of anti-nRNP is usually associated with sclerodactily, Raynaud’s phenomenon, esophageal dysmotility, pulmonary dysfunction, arthritis, myositis, & low incidence of renal disease
  40. 40. 40 Anti Ro/SS-A dan Anti La/SS-BAnti-Ro (SS-A) are present in about 50% of patients withSjogren’s syndrome & 30% of patients with SLE, associatedwith subacute cutaneous LE & with congenital heart blockThe incidence of anti-La in SLE & Sjogren’s syndrome isapproximately half that of anti-Ro
  41. 41. 41 Anti Ro/SS-A dan Anti La/SS-BAnti-Ro & anti-La testing may help to confirm the diagnosisof Sjogren’s syndrome. Neither is specific for SLE, but bothare very useful when anti-dsDNA is absentTiters of anti-Ro & anti-La increase more slowly than anti-dsDNA in relapse & quantitative reporting is unlikely to beusefulThe EIA now has become the most widely used method todetect anti-Ro & anti-La
  42. 42. 42 Anti Jo 1Anti-Jo-1 are directed againts the enzyme histidyl tRNAsynthetaseAnti-Jo-1 are detected in 30% of patients with polymyositisor dermatomyositisThe presence of Anti-Jo-1 is often associated withpulmonary involvement (pulmonary fibrosis)
  43. 43. 43 Anti Scl 70 Anti-Scl-70 are a specific marker for scleroderma, because these antibodies occur rarely in patient with other CTD Anti-Scl-70 are found in 22-40% of patients with scleroderma Its presence is correlated with diffuse cutaneous disease, pulmonary fibrosis, cardiac involvement & longer disease duration
  44. 44. 44 BIOCHIPs SLIDEBIOCHIP Technology and Mosaics. BIOCHIP Technology: cover glasses coated with biological substrates are cut into millimetre-sized fragments (BIOCHIPs) on a machine. This makes it possible to obtain ten or more first-class preparations of homogeneous quality per tissue section, in the case of cultured cell substrates even several thousands. BIOCHIP Mosaics™: using several BIOCHIPs coated with different substrates side by side on one and the same reaction field, antibodies against various organs or infectious agents can be investigated simultaneously. Detailed antibody profiles can thus be established with comparatively little effort, allowing the reciprocal determination of the results on different substrates.
  45. 45. 45BIOCHIPs SLIDE
  46. 46. 46FITC
  47. 47. 47 Primate Liver – Hep-2 HEp-2 cells contain human antigens, while frozen sections can generally only be produced from tissue of animal origin Earlier, frozen sections of primate liver were considered to be the standard substrate for the identification of autoantibodies against cell nuclei
  48. 48. 48 Primate Liver Negative results can be more securely identified using liver tissue. The cell nuclei are unquestionably free of fluorescence, where as a green shimmer can often still be seen in HEp-2 cells Antibodies against liver-specific antigens can be identified at the same time Primate liver provides a first-class substrate for the identification of antibodies against granulocyte cytoplasm (cANCA, pANCA) and against endomyslum, with the result that valuable additional information can often be obtained concerning other related areas of diagnostics
  49. 49. 49 Hep 2 cell Corresponds more closely to the specificity of the human antibodies being tested Cells can be propagated in definitely by cell culture with the result that the substrate can be more easily standardised Hep 2 cell have larger and more impressive cell nuclel in which the various cell nucleus antibodies can be more easily differentiated by means of their fluorescence pattern Cells display a much higher proportion of mitoses than does liver tissue.This allows identification of antibodies against mitosis-specific structures and a more secure diagnosis of antibodies against centromere
  50. 50. 50 Hep-20-10 Compared to standard HEp-2 cells, HEp-20-10 cells demonstrate 10-fold more mitotic cells. Antibodies against mitotic-specific structures (centromeres, spindle fibers, midbody, centrioles, NOR) can be more easily identified than with conventional preparations. The cell line HEp-20-10 offers the full antigen spectrum for cell nuclei antibody diagnostics. The BIOCHIP with HEp-20-10 can be supplemented with additional substrates, for example, primate liver as well as rat kidney and rat stomach
  51. 51. 51Mikroskop Fluorescen
  52. 52. 52
  53. 53. Flow Chart for Clinical Antinuclear Antibody Testing 53 Clinician suspects LE or other rheumatic condition. ANA test Table 2 is not Yes No indicated Perform ANA test Test positive Test negative No further autoantibody testing is indicated. Follow patient clinically & How should a (+) result be interpreted ? consider repeat test if indicated clinicallyDoes the patient have one of the conditions in Table 2 ?Is further testing indicated ? Further testing for other autoAb is driven by specific clinical findingsSusp. LE but SLE has Susp. Susp. polymyositis Susp. Susp.the diagnosis been Sjogren’s or dermatomyositis scleroderma drugneeds to be diagnosed syndrome or has established or has LEconfirmed this diagnosis established Disease this Susp. Information activity anti- diagnosis MCTD anti- regarding needs to Ro/SS-AdsDNA & anti- No further prognosis is be & anti- anti-anti-Sm Jo-1 testing is desired assessed La/SS-B anti-Scl-70 RNP serially indicated anti-dsDNA Anti-Ro/SS-A Correlate with clinical findings Kavanaugh (2000). Arch Pathol Lab Med 124, 71-81
  54. 54. 54 Beda ANA-ELISA dan ANA-IFA ANA IFA ANAELISA• Dapat menentukan jenis • Bersifat kualitatif autoantibodinya • Objektif, meminimalkan• Keterbatasan : subyektif, risiko human error, kurang memerlukan tenaga membutuhkan tenaga terampil dengan risiko trampil dan ketelitian peme- human error yang tinggi. riksa, sebab semua prosedur dikerjakan secara otomatis oleh alat.
  55. 55. 55
  56. 56. 56
  57. 57. Bagian-Bagian Inti Sel• Membran inti Bagian terluar dari inti sel. Fungsi membran inti sel secara keseluruhan adalah mengadakan pertukaran zat dengan sitoplasma..• Anak Inti (Nukleolus) Nukleolus tersusun atas fosfoprotein, ortofosfat, DNA, dan berbagai jenis enzim. Nukleolus berfungsi dalam proses sintesis RNA.• Nukleoplasma Cairan inti atau karotin yang bersifat transparan dan semisolid (kental). Di dalam nukleoplasma, terdapat kromatin, granula, nukleoprotein dan mengandung senyawa kimia kompleks• Asam Nukleat dan protein Inti Asam Nukleat dibedakan menjadi DNA dan RNA. DNA merupakan komponen pembawa informasi genetik (gen). DNA tersusun dalam kromosom. DNA merupakan susunan kimia makromolekular kompleks yang terdiri atas 3 macam molekul, yaitu gula deoksiribosa, asam fosfat dan basa nitrogen. Protein inti merupakan struktur yang kompleks. Protein inti terdiri atas beberapa komponen, meliputi protamin, histon, protein non histon dan nukleohiston.
  58. 58. HISTON• Bagian dari protein inti yang berfungsi untuk mengikat DNA• Histon mengandung 20% hingga 30% arginin dan lisin. Selain itu, histon juga mengandung histidin. protein nonhiston adalah protein yang bersifat asam.
  59. 59. Figure 19. Diagram of histones binding DNA. HISTON
  60. 60. Antibody Origin of the nameanti-CENP-B centromer-protein Banti-ds-DNA double stranded DNAanti-ss-DNA single stranded DNAanti-histone histone proteinanti-Jo-1 patient nameanti-Ku or anti-SL patient name or sicca lupus antigenanti-PM-Scl (PM1) polymyositis sclerodermie antigen 100 kDaanti-Scl-70 scleroderma antigen 70 kDaanti-Sm Smith-antigenanti-SS-A/Ro Robert-antigen or soluble substance A nuclear antigenanti-SS-B/La Lane-antigen or soluble substance B nuclear antigenant-U1-snRNP small nuclear uridine-rich ribonucleoproteinsPCNA proliferating cell nuclear antigen
  61. 61. Antibody Function of the antigen Localizationanti-CENP-B 80 kD protein of the centromer nucleusanti-ds-DNA tamplate for transcription and replication nucleusanti-histone components of chromatin nucleusanti-Jo-1 histidyl-tRNA synthetase nucleus and cytoplasmaanti-Ku or anti-SL ? repair DNA termini nucleusanti-PM-Scl (PM1) Unknown nucleusanti-Scl-70 DNA topoisomerase I nucleusanti-Sm spliceosome components nucleusanti-SS-A/Ro Unknown nucleus and cytoplasmaanti-SS-B/La transcription termination factor nucleus and cytoplasmaant-U1-snRNP spliceosome components nucleusPCNA auxiliary protein of DNA polymerase a nucleus
  62. 62. PBS• is a buffer solution commonly used in biological research.• It is a water-based salt solution containing sodium chloride (NaCl), sodium phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate.• The buffer helps to maintain a constant pH. The osmolarity and ion concentrations of the solution usually match those of the human body (isotonic).
  63. 63. PBSOne of the common composition of PBS Salt Concentration Concentration (—) (mmol/L) (g/L)NaCl 137 8.00KCl 2.7 0.20Na2HPO4 • 2 H2O 8.1 1.44KH2PO4 1.76 0.24pH 7.4 7.4
  64. 64. Fluorofor• FITC : hijau apel Mempunyai puncak eksitasi dan emisi pada panjang gelombang 495 nm/521 nm• Rhodamine isothiocyanate : jingga• Umbelliferone• Lanthanide chelates

×