Western Blot Sebagai Tes Konfirmasi HIV  Diah Puspita Rini Siswanto Darmadi
<ul><li>PENDAHULUAN </li></ul>
AIDS <ul><li>Disebabkan oleh HIV </li></ul><ul><li>HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983 </li></ul><ul><li>H...
STRUKTUR HIV
PEMERIKSAAN LAB HIV <ul><li>Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah  ELISA , mempunyai  sensitivitas...
Tes diagnostik untuk infeksi HIV <ul><li>Skrening </li></ul><ul><li>Enzyme-linked immunoassay  (EIA, ELISA), HIV-1/2  Aglu...
Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV <ul><li>Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology </li></ul>
<ul><li>Prinsip Pemeriksaan  </li></ul><ul><li>WESTERN BLOT </li></ul>
WESTERN BLOT <ul><li>Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis </li></ul><ul><li>Menggabungkan selektivitas elektrofores...
PRINSIP PEMERIKSAAN <ul><li>Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida </li></ul><ul><li>Fraksi...
PRINSIP PEMERIKSAAN <ul><li>4.  Membran direaksikan dengan antibodi primer </li></ul><ul><li>5.  Membran direaksikan denga...
<ul><li>PROSEDUR      PEMERIKSAAN </li></ul>
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN  <ul><li>Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel el...
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <ul><li>3. Alat transfer dipasang dengan  membran menghadap anode  dan  gel menghadap   katod...
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <ul><li>Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M T...
BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI <ul><li>Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikata...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><li>Memblok  membran </li></ul><ul><li>  larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaC...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><ul><li>Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuci   untuk membuang antibodi...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><ul><li>Cuci membran dengan TBS  menghilangkan  Tween </li></ul></ul><ul><ul><li>...
<ul><li>INTERPRETASI </li></ul><ul><li>WESTERN BLOT </li></ul>
INTERPRETASI WESTERN BLOT <ul><li>Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC)  </li></ul><ul><li>NEGATIF  ...
 
RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) <ul><li>Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip  indirect solid phase-...
RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) <ul><li>Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah  te...
PRINSIP REAKSI RIBA
INTERPRETASI HASIL Negative No spot No spot gp41 or gp120 ang/or gp36 No spot Indeterminate 1 No spot or gp120 gp24 and/or...
PERBEDAAN WB dan RIBA <ul><li>WESTERN BLOT </li></ul><ul><li>Inti : p17,p24,p55 </li></ul><ul><li>Polimerase : p21, p51,  ...
FOR YOUR ATTENTION Thank You !
RIBA TEST INSTRUCTION <ul><ul><li>1. Antigen-antibody reaction (row A) </li></ul></ul><ul><ul><li>2. First wash (row B) </...
HASIL NEGATIF PALSU <ul><li>Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada popula...
 
INDETERMINATE <ul><li>Penyebab : </li></ul><ul><li>Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi </li></ul><ul><li>Infeksi...
<ul><li>HIV-1  adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis ( str...
SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN <ul><li>Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh,  subtipe B...
<ul><li>subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya,  subtipe B  dengan hubungan  ho...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Tibaru11

1,378 views
1,208 views

Published on

Published in: Health & Medicine
0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
1,378
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
6
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Tibaru11

  1. 1. Western Blot Sebagai Tes Konfirmasi HIV Diah Puspita Rini Siswanto Darmadi
  2. 2. <ul><li>PENDAHULUAN </li></ul>
  3. 3. AIDS <ul><li>Disebabkan oleh HIV </li></ul><ul><li>HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983 </li></ul><ul><li>HIV-2, tahun 1984 yang diisolasi dari pasien di Afrika Barat </li></ul><ul><li>HIV : famili retrovirus, termasuk virus RNA BM 9,7 kb </li></ul><ul><li>Khas : enzim reverse transkriptase </li></ul>
  4. 4. STRUKTUR HIV
  5. 5. PEMERIKSAAN LAB HIV <ul><li>Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA , mempunyai sensitivitas 93-98% dan spesifisitas 98-99%. </li></ul><ul><li>Pemeriksaan serologi HIV sebaiknya dilakukan dengan 3 metode berbeda. Dapat dilanjutkan dengan pemeriksaan yang lebih spesifik Western Blot. </li></ul>
  6. 6. Tes diagnostik untuk infeksi HIV <ul><li>Skrening </li></ul><ul><li>Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 Aglutinasi latek untuk HIV-1 </li></ul><ul><li>Konfirmasi </li></ul><ul><li>Western Blot (WB) , HIV-1 dan HIV-2 </li></ul><ul><li>Indirect immunofluorescence antibody assay (IFA),HIV-1 </li></ul><ul><li>Radioimmunoprecipitation antibody assay (RIPA),HIV-1 </li></ul><ul><li>Lain-lain </li></ul><ul><li>ELISA untuk HIV-1 p24 antigen </li></ul><ul><li>Polymerase chain reaction (PCR), HIV-1 </li></ul>
  7. 7. Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV <ul><li>Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology </li></ul>
  8. 8. <ul><li>Prinsip Pemeriksaan </li></ul><ul><li>WESTERN BLOT </li></ul>
  9. 9. WESTERN BLOT <ul><li>Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis </li></ul><ul><li>Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas immunoassay </li></ul>
  10. 10. PRINSIP PEMERIKSAAN <ul><li>Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida </li></ul><ul><li>Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-fraksi protein </li></ul><ul><li>Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik </li></ul>
  11. 11. PRINSIP PEMERIKSAAN <ul><li>4. Membran direaksikan dengan antibodi primer </li></ul><ul><li>5. Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim </li></ul><ul><li>6. Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang akan menghasilkan produk berwarna </li></ul>
  12. 12. <ul><li>PROSEDUR PEMERIKSAAN </li></ul>
  13. 13. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <ul><li>Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis ), setelah selesai dicuci dengan buffer 25mM Tris-Cl pH 8.3/20% methanol (atau pH 7.0 - 8.8) </li></ul><ul><li>Membran nitoselulosa dipotong dan direndam dalam larutan buffer selama 15 menit </li></ul>
  14. 14. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <ul><li>3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadap katode . Pastikan tidak ada gelembung, elektrotransfer dilakukan dengan menjalankan unit selama 1 jam dengan voltase 500mA </li></ul>
  15. 15. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <ul><li>Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH 7,5) </li></ul>
  16. 16. BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI <ul><li>Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik </li></ul><ul><li>Digunakan antibodi primer dan sekunder untuk mendeteksi protein spesifik yang dicari </li></ul>
  17. 17. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><li>Memblok membran </li></ul><ul><li> larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non- fat milk powder dan 0.05% Tween-20 30-60 menit pada suhu 37 0 C atau 2 hari pada suhu kamar </li></ul><ul><li>Cuci membran 2 x 5 menit </li></ul><ul><li> larutan pencuci 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl pH 7.4 (atau saline ) yang mengandung 0,05% Tween-20 (TTBS) </li></ul><ul><li>Membran diinkubasi dengan antibodi primer </li></ul><ul><li>selama 1-2 jam pada suhu kamar </li></ul>
  18. 18. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><ul><li>Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuci untuk membuang antibodi primer </li></ul></ul><ul><ul><li>Membran diinkubasi pada antibodi sekunder konjugasi alkali fosfatase ,1-2 jam suhu kamar </li></ul></ul><ul><ul><li>Cuci membran 2 x 5 menit dengan TTBS </li></ul></ul>
  19. 19. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi <ul><ul><li>Cuci membran dengan TBS menghilangkan Tween </li></ul></ul><ul><ul><li>Inkubasi dengan substrat selama 1 jam, cuci dengan air </li></ul></ul><ul><ul><li>Inkubasi membran 20 menit dengan TBS mengandung 0,3 % Tween 20, cuci dengan air 5 menit </li></ul></ul><ul><ul><li>Masukkan membran ke dalam zat warna emas koloid/ Amido Black/ India ink/ Ponceau S selama 4 jam. </li></ul></ul>
  20. 20. <ul><li>INTERPRETASI </li></ul><ul><li>WESTERN BLOT </li></ul>
  21. 21. INTERPRETASI WESTERN BLOT <ul><li>Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC) </li></ul><ul><li>NEGATIF : tidak terbentuk pita </li></ul><ul><li>POSITIF : terdeteksi dua pita dari gp 120/160 dan gp41 atau gp 24 </li></ul><ul><li>INDETERMINATE : terdapat satu pita saja yang positif yaitu p24, gp41, gp120/160, p66, p55, p51, p31 atau p17 </li></ul>
  22. 23. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) <ul><li>Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzyme immunoassay (EIA) . </li></ul><ul><li>Fase solidnya adalah kartu dengan 12 tonjolan (“gigi” ). Masing-masing kartu memiliki enam pasang gigi, dengan enam titik antigen (3 titik pada masing-masing gigi). </li></ul>
  23. 24. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) <ul><li>Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah terdapat internal control , dan dua protein marker p24 (gag) dan p 31 (pol). Pada bagian kanan terdapat tiga protein dari bagian env virus yaitu gp41, gp 120 dan gp 36. </li></ul>
  24. 25. PRINSIP REAKSI RIBA
  25. 26. INTERPRETASI HASIL Negative No spot No spot gp41 or gp120 ang/or gp36 No spot Indeterminate 1 No spot or gp120 gp24 and/or p31 HIV-2 only, or coinfection with HIV-1 gp36 and gp41 and gp 120 gp24 and/or p31 HIV- 2 gp36 only or with gp 41 gp24 and/or p31 gp41 and gp120 No spot HIV- 1 gp41 p24 and/or p31 Positive for Right tooth Left tooth Interpretation Pattern of HIV spots present on
  26. 27. PERBEDAAN WB dan RIBA <ul><li>WESTERN BLOT </li></ul><ul><li>Inti : p17,p24,p55 </li></ul><ul><li>Polimerase : p21, p51, p66 </li></ul><ul><li>Envelope : gp41, gp120, gp 160 </li></ul><ul><li>RIBA </li></ul><ul><li>Inti : p24 </li></ul><ul><li>Polimerase : p31 </li></ul><ul><li>Envelope : gp 120 </li></ul><ul><li>gp 41 </li></ul>
  27. 28. FOR YOUR ATTENTION Thank You !
  28. 29. RIBA TEST INSTRUCTION <ul><ul><li>1. Antigen-antibody reaction (row A) </li></ul></ul><ul><ul><li>2. First wash (row B) </li></ul></ul><ul><ul><li>3. Binding of conjugate (row C) </li></ul></ul><ul><ul><li>4. Second wash (row D) </li></ul></ul><ul><ul><li>5. Third wash (row E) </li></ul></ul><ul><ul><li>6. Color reaction / chromogenic substrate containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) (row F) </li></ul></ul><ul><ul><li>7. Stop reaction (row E) </li></ul></ul>
  29. 30. HASIL NEGATIF PALSU <ul><li>Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi prevalensi rendah </li></ul><ul><li>Penyebab: </li></ul><ul><li>Window period </li></ul><ul><li>Serokonversi </li></ul><ul><li>Agammaglobulinemia </li></ul><ul><li>Atypical host response </li></ul><ul><li>Strain N atau O atau HIV-2 </li></ul>
  30. 32. INDETERMINATE <ul><li>Penyebab : </li></ul><ul><li>Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi </li></ul><ul><li>Infeksi HIV stadium lanjut </li></ul><ul><li>Reaksi silang antibodi nonspesifik, multiple skelosis, psx vaskular-kolagen, limfoma, penyakit liver </li></ul><ul><li>HIV vaccine recipients </li></ul>
  31. 33. <ul><li>HIV-1 adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis ( strain ) HIV-1 yang berbeda-beda. Jenis ini digolongkan menurut golongan ( group ) dan subtipe ( subtype ). Ada dua golongan, yaitu golongan M dan golongan O. </li></ul><ul><li>Pada September 1998 , peneliti dari Perancis mengumumkan penemuan jenis HIV baru pada seorang wanita dari Kamerun di Afrika Barat. Jenis ini tidak termasuk dalam golongan M atau pun golongan O , dan hanya ditemukan pada tiga orang lainnya, semua di Kamerun. </li></ul><ul><li>Saat ini dalam golongan M sedikitnya diketahui ada sepuluh subtipe HIV-1 yang secara genetis berbeda. Subtipe ini terdiri dari A sampai J. Tambahan pula, golongan O terdiri dari beberapa golongan yang berbeda dari virus yang sangat beraneka ragam. Subtipe di golongan M dapat berbeda antar subtipe sebanyak perbedaan golongan M dengan golongan O. </li></ul>
  32. 34. SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN <ul><li>Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh, subtipe B kebanyakan ditemukan di sekitar Amerika (utara dan selatan), Jepang, Australia, Karibia, dan Eropa ; subtipe A dan D adalah yang paling sering ditemukan di Afrika sub-Sahara; subtipe C di Afrika Selatan dan India ; dan subtipe E di Republik Afrika Tengah, Thailand, dan negara lainnya di Asia Tenggara . Subtipe F (Brazil dan Rumania), G dan H (Rusia dan Afrika Tengah), I (Siprus), dan golongan O (Kamerun) mempunyai prevalensi sangat rendah. Di Afrika, sebagian besar subtipe ditemukan, walaupun subtipe B kurang umum. </li></ul>
  33. 35. <ul><li>subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya, subtipe B dengan hubungan homoseksual dan penggunaan narkotik secara suntikan (pada intinya, melalui darah) dan subtipe E dan C, melalui hubungan heteroseksual (melalui jalur mukosal). </li></ul><ul><li>Penelitian di laboratorium yang dilakukan oleh Dr. Max Essex dari Harvard School of Public Health di Boston, AS, menunjukkan subtipe C dan E menularkan dan menggandakan diri lebih efisien dibandingkan dengan subtipe B pada sel Langerhans yang ada dalam mukosa vagina, leher rahim, dan kulup penis, tetapi tidak pada dinding dubur. Data memperlihatkan HIV subtipe E dan C lebih mudah menyebar secara heteroseksual dibandingkan dengan subtipe B. </li></ul>

×