• Save
Tibaru11
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Like this? Share it with your network

Share

Tibaru11

on

  • 1,453 views

 

Statistics

Views

Total Views
1,453
Views on SlideShare
1,453
Embed Views
0

Actions

Likes
1
Downloads
0
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

Tibaru11 Presentation Transcript

  • 1. Western Blot Sebagai Tes Konfirmasi HIV Diah Puspita Rini Siswanto Darmadi
  • 2.
    • PENDAHULUAN
  • 3. AIDS
    • Disebabkan oleh HIV
    • HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983
    • HIV-2, tahun 1984 yang diisolasi dari pasien di Afrika Barat
    • HIV : famili retrovirus, termasuk virus RNA BM 9,7 kb
    • Khas : enzim reverse transkriptase
  • 4. STRUKTUR HIV
  • 5. PEMERIKSAAN LAB HIV
    • Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA , mempunyai sensitivitas 93-98% dan spesifisitas 98-99%.
    • Pemeriksaan serologi HIV sebaiknya dilakukan dengan 3 metode berbeda. Dapat dilanjutkan dengan pemeriksaan yang lebih spesifik Western Blot.
  • 6. Tes diagnostik untuk infeksi HIV
    • Skrening
    • Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 Aglutinasi latek untuk HIV-1
    • Konfirmasi
    • Western Blot (WB) , HIV-1 dan HIV-2
    • Indirect immunofluorescence antibody assay (IFA),HIV-1
    • Radioimmunoprecipitation antibody assay (RIPA),HIV-1
    • Lain-lain
    • ELISA untuk HIV-1 p24 antigen
    • Polymerase chain reaction (PCR), HIV-1
  • 7. Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV
    • Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology
  • 8.
    • Prinsip Pemeriksaan
    • WESTERN BLOT
  • 9. WESTERN BLOT
    • Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis
    • Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas immunoassay
  • 10. PRINSIP PEMERIKSAAN
    • Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida
    • Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-fraksi protein
    • Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik
  • 11. PRINSIP PEMERIKSAAN
    • 4. Membran direaksikan dengan antibodi primer
    • 5. Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim
    • 6. Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang akan menghasilkan produk berwarna
  • 12.
    • PROSEDUR PEMERIKSAAN
  • 13. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
    • Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis ), setelah selesai dicuci dengan buffer 25mM Tris-Cl pH 8.3/20% methanol (atau pH 7.0 - 8.8)
    • Membran nitoselulosa dipotong dan direndam dalam larutan buffer selama 15 menit
  • 14. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
    • 3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadap katode . Pastikan tidak ada gelembung, elektrotransfer dilakukan dengan menjalankan unit selama 1 jam dengan voltase 500mA
  • 15. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
    • Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH 7,5)
  • 16. BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI
    • Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik
    • Digunakan antibodi primer dan sekunder untuk mendeteksi protein spesifik yang dicari
  • 17. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
    • Memblok membran
    • larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non- fat milk powder dan 0.05% Tween-20 30-60 menit pada suhu 37 0 C atau 2 hari pada suhu kamar
    • Cuci membran 2 x 5 menit
    • larutan pencuci 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl pH 7.4 (atau saline ) yang mengandung 0,05% Tween-20 (TTBS)
    • Membran diinkubasi dengan antibodi primer
    • selama 1-2 jam pada suhu kamar
  • 18. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
      • Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuci untuk membuang antibodi primer
      • Membran diinkubasi pada antibodi sekunder konjugasi alkali fosfatase ,1-2 jam suhu kamar
      • Cuci membran 2 x 5 menit dengan TTBS
  • 19. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
      • Cuci membran dengan TBS menghilangkan Tween
      • Inkubasi dengan substrat selama 1 jam, cuci dengan air
      • Inkubasi membran 20 menit dengan TBS mengandung 0,3 % Tween 20, cuci dengan air 5 menit
      • Masukkan membran ke dalam zat warna emas koloid/ Amido Black/ India ink/ Ponceau S selama 4 jam.
  • 20.
    • INTERPRETASI
    • WESTERN BLOT
  • 21. INTERPRETASI WESTERN BLOT
    • Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC)
    • NEGATIF : tidak terbentuk pita
    • POSITIF : terdeteksi dua pita dari gp 120/160 dan gp41 atau gp 24
    • INDETERMINATE : terdapat satu pita saja yang positif yaitu p24, gp41, gp120/160, p66, p55, p51, p31 atau p17
  • 22.  
  • 23. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)
    • Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzyme immunoassay (EIA) .
    • Fase solidnya adalah kartu dengan 12 tonjolan (“gigi” ). Masing-masing kartu memiliki enam pasang gigi, dengan enam titik antigen (3 titik pada masing-masing gigi).
  • 24. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)
    • Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah terdapat internal control , dan dua protein marker p24 (gag) dan p 31 (pol). Pada bagian kanan terdapat tiga protein dari bagian env virus yaitu gp41, gp 120 dan gp 36.
  • 25. PRINSIP REAKSI RIBA
  • 26. INTERPRETASI HASIL Negative No spot No spot gp41 or gp120 ang/or gp36 No spot Indeterminate 1 No spot or gp120 gp24 and/or p31 HIV-2 only, or coinfection with HIV-1 gp36 and gp41 and gp 120 gp24 and/or p31 HIV- 2 gp36 only or with gp 41 gp24 and/or p31 gp41 and gp120 No spot HIV- 1 gp41 p24 and/or p31 Positive for Right tooth Left tooth Interpretation Pattern of HIV spots present on
  • 27. PERBEDAAN WB dan RIBA
    • WESTERN BLOT
    • Inti : p17,p24,p55
    • Polimerase : p21, p51, p66
    • Envelope : gp41, gp120, gp 160
    • RIBA
    • Inti : p24
    • Polimerase : p31
    • Envelope : gp 120
    • gp 41
  • 28. FOR YOUR ATTENTION Thank You !
  • 29. RIBA TEST INSTRUCTION
      • 1. Antigen-antibody reaction (row A)
      • 2. First wash (row B)
      • 3. Binding of conjugate (row C)
      • 4. Second wash (row D)
      • 5. Third wash (row E)
      • 6. Color reaction / chromogenic substrate containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) (row F)
      • 7. Stop reaction (row E)
  • 30. HASIL NEGATIF PALSU
    • Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi prevalensi rendah
    • Penyebab:
    • Window period
    • Serokonversi
    • Agammaglobulinemia
    • Atypical host response
    • Strain N atau O atau HIV-2
  • 31.  
  • 32. INDETERMINATE
    • Penyebab :
    • Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi
    • Infeksi HIV stadium lanjut
    • Reaksi silang antibodi nonspesifik, multiple skelosis, psx vaskular-kolagen, limfoma, penyakit liver
    • HIV vaccine recipients
  • 33.
    • HIV-1 adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis ( strain ) HIV-1 yang berbeda-beda. Jenis ini digolongkan menurut golongan ( group ) dan subtipe ( subtype ). Ada dua golongan, yaitu golongan M dan golongan O.
    • Pada September 1998 , peneliti dari Perancis mengumumkan penemuan jenis HIV baru pada seorang wanita dari Kamerun di Afrika Barat. Jenis ini tidak termasuk dalam golongan M atau pun golongan O , dan hanya ditemukan pada tiga orang lainnya, semua di Kamerun.
    • Saat ini dalam golongan M sedikitnya diketahui ada sepuluh subtipe HIV-1 yang secara genetis berbeda. Subtipe ini terdiri dari A sampai J. Tambahan pula, golongan O terdiri dari beberapa golongan yang berbeda dari virus yang sangat beraneka ragam. Subtipe di golongan M dapat berbeda antar subtipe sebanyak perbedaan golongan M dengan golongan O.
  • 34. SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN
    • Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh, subtipe B kebanyakan ditemukan di sekitar Amerika (utara dan selatan), Jepang, Australia, Karibia, dan Eropa ; subtipe A dan D adalah yang paling sering ditemukan di Afrika sub-Sahara; subtipe C di Afrika Selatan dan India ; dan subtipe E di Republik Afrika Tengah, Thailand, dan negara lainnya di Asia Tenggara . Subtipe F (Brazil dan Rumania), G dan H (Rusia dan Afrika Tengah), I (Siprus), dan golongan O (Kamerun) mempunyai prevalensi sangat rendah. Di Afrika, sebagian besar subtipe ditemukan, walaupun subtipe B kurang umum.
  • 35.
    • subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya, subtipe B dengan hubungan homoseksual dan penggunaan narkotik secara suntikan (pada intinya, melalui darah) dan subtipe E dan C, melalui hubungan heteroseksual (melalui jalur mukosal).
    • Penelitian di laboratorium yang dilakukan oleh Dr. Max Essex dari Harvard School of Public Health di Boston, AS, menunjukkan subtipe C dan E menularkan dan menggandakan diri lebih efisien dibandingkan dengan subtipe B pada sel Langerhans yang ada dalam mukosa vagina, leher rahim, dan kulup penis, tetapi tidak pada dinding dubur. Data memperlihatkan HIV subtipe E dan C lebih mudah menyebar secara heteroseksual dibandingkan dengan subtipe B.