• Save
Tibaru11
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Tibaru11

on

  • 1,311 views

 

Statistics

Views

Total Views
1,311
Views on SlideShare
1,311
Embed Views
0

Actions

Likes
1
Downloads
0
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Tibaru11 Tibaru11 Presentation Transcript

    • Western Blot Sebagai Tes Konfirmasi HIV Diah Puspita Rini Siswanto Darmadi
      • PENDAHULUAN
    • AIDS
      • Disebabkan oleh HIV
      • HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983
      • HIV-2, tahun 1984 yang diisolasi dari pasien di Afrika Barat
      • HIV : famili retrovirus, termasuk virus RNA BM 9,7 kb
      • Khas : enzim reverse transkriptase
    • STRUKTUR HIV
    • PEMERIKSAAN LAB HIV
      • Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA , mempunyai sensitivitas 93-98% dan spesifisitas 98-99%.
      • Pemeriksaan serologi HIV sebaiknya dilakukan dengan 3 metode berbeda. Dapat dilanjutkan dengan pemeriksaan yang lebih spesifik Western Blot.
    • Tes diagnostik untuk infeksi HIV
      • Skrening
      • Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 Aglutinasi latek untuk HIV-1
      • Konfirmasi
      • Western Blot (WB) , HIV-1 dan HIV-2
      • Indirect immunofluorescence antibody assay (IFA),HIV-1
      • Radioimmunoprecipitation antibody assay (RIPA),HIV-1
      • Lain-lain
      • ELISA untuk HIV-1 p24 antigen
      • Polymerase chain reaction (PCR), HIV-1
    • Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV
      • Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology
      • Prinsip Pemeriksaan
      • WESTERN BLOT
    • WESTERN BLOT
      • Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis
      • Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas immunoassay
    • PRINSIP PEMERIKSAAN
      • Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida
      • Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-fraksi protein
      • Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik
    • PRINSIP PEMERIKSAAN
      • 4. Membran direaksikan dengan antibodi primer
      • 5. Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim
      • 6. Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang akan menghasilkan produk berwarna
      • PROSEDUR PEMERIKSAAN
    • PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
      • Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis ), setelah selesai dicuci dengan buffer 25mM Tris-Cl pH 8.3/20% methanol (atau pH 7.0 - 8.8)
      • Membran nitoselulosa dipotong dan direndam dalam larutan buffer selama 15 menit
    • PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
      • 3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadap katode . Pastikan tidak ada gelembung, elektrotransfer dilakukan dengan menjalankan unit selama 1 jam dengan voltase 500mA
    • PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN
      • Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH 7,5)
    • BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI
      • Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik
      • Digunakan antibodi primer dan sekunder untuk mendeteksi protein spesifik yang dicari
    • Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
      • Memblok membran
      • larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non- fat milk powder dan 0.05% Tween-20 30-60 menit pada suhu 37 0 C atau 2 hari pada suhu kamar
      • Cuci membran 2 x 5 menit
      • larutan pencuci 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl pH 7.4 (atau saline ) yang mengandung 0,05% Tween-20 (TTBS)
      • Membran diinkubasi dengan antibodi primer
      • selama 1-2 jam pada suhu kamar
    • Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
        • Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuci untuk membuang antibodi primer
        • Membran diinkubasi pada antibodi sekunder konjugasi alkali fosfatase ,1-2 jam suhu kamar
        • Cuci membran 2 x 5 menit dengan TTBS
    • Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi
        • Cuci membran dengan TBS menghilangkan Tween
        • Inkubasi dengan substrat selama 1 jam, cuci dengan air
        • Inkubasi membran 20 menit dengan TBS mengandung 0,3 % Tween 20, cuci dengan air 5 menit
        • Masukkan membran ke dalam zat warna emas koloid/ Amido Black/ India ink/ Ponceau S selama 4 jam.
      • INTERPRETASI
      • WESTERN BLOT
    • INTERPRETASI WESTERN BLOT
      • Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC)
      • NEGATIF : tidak terbentuk pita
      • POSITIF : terdeteksi dua pita dari gp 120/160 dan gp41 atau gp 24
      • INDETERMINATE : terdapat satu pita saja yang positif yaitu p24, gp41, gp120/160, p66, p55, p51, p31 atau p17
    •  
    • RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)
      • Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzyme immunoassay (EIA) .
      • Fase solidnya adalah kartu dengan 12 tonjolan (“gigi” ). Masing-masing kartu memiliki enam pasang gigi, dengan enam titik antigen (3 titik pada masing-masing gigi).
    • RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)
      • Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah terdapat internal control , dan dua protein marker p24 (gag) dan p 31 (pol). Pada bagian kanan terdapat tiga protein dari bagian env virus yaitu gp41, gp 120 dan gp 36.
    • PRINSIP REAKSI RIBA
    • INTERPRETASI HASIL Negative No spot No spot gp41 or gp120 ang/or gp36 No spot Indeterminate 1 No spot or gp120 gp24 and/or p31 HIV-2 only, or coinfection with HIV-1 gp36 and gp41 and gp 120 gp24 and/or p31 HIV- 2 gp36 only or with gp 41 gp24 and/or p31 gp41 and gp120 No spot HIV- 1 gp41 p24 and/or p31 Positive for Right tooth Left tooth Interpretation Pattern of HIV spots present on
    • PERBEDAAN WB dan RIBA
      • WESTERN BLOT
      • Inti : p17,p24,p55
      • Polimerase : p21, p51, p66
      • Envelope : gp41, gp120, gp 160
      • RIBA
      • Inti : p24
      • Polimerase : p31
      • Envelope : gp 120
      • gp 41
    • FOR YOUR ATTENTION Thank You !
    • RIBA TEST INSTRUCTION
        • 1. Antigen-antibody reaction (row A)
        • 2. First wash (row B)
        • 3. Binding of conjugate (row C)
        • 4. Second wash (row D)
        • 5. Third wash (row E)
        • 6. Color reaction / chromogenic substrate containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) (row F)
        • 7. Stop reaction (row E)
    • HASIL NEGATIF PALSU
      • Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi prevalensi rendah
      • Penyebab:
      • Window period
      • Serokonversi
      • Agammaglobulinemia
      • Atypical host response
      • Strain N atau O atau HIV-2
    •  
    • INDETERMINATE
      • Penyebab :
      • Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi
      • Infeksi HIV stadium lanjut
      • Reaksi silang antibodi nonspesifik, multiple skelosis, psx vaskular-kolagen, limfoma, penyakit liver
      • HIV vaccine recipients
      • HIV-1 adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis ( strain ) HIV-1 yang berbeda-beda. Jenis ini digolongkan menurut golongan ( group ) dan subtipe ( subtype ). Ada dua golongan, yaitu golongan M dan golongan O.
      • Pada September 1998 , peneliti dari Perancis mengumumkan penemuan jenis HIV baru pada seorang wanita dari Kamerun di Afrika Barat. Jenis ini tidak termasuk dalam golongan M atau pun golongan O , dan hanya ditemukan pada tiga orang lainnya, semua di Kamerun.
      • Saat ini dalam golongan M sedikitnya diketahui ada sepuluh subtipe HIV-1 yang secara genetis berbeda. Subtipe ini terdiri dari A sampai J. Tambahan pula, golongan O terdiri dari beberapa golongan yang berbeda dari virus yang sangat beraneka ragam. Subtipe di golongan M dapat berbeda antar subtipe sebanyak perbedaan golongan M dengan golongan O.
    • SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN
      • Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh, subtipe B kebanyakan ditemukan di sekitar Amerika (utara dan selatan), Jepang, Australia, Karibia, dan Eropa ; subtipe A dan D adalah yang paling sering ditemukan di Afrika sub-Sahara; subtipe C di Afrika Selatan dan India ; dan subtipe E di Republik Afrika Tengah, Thailand, dan negara lainnya di Asia Tenggara . Subtipe F (Brazil dan Rumania), G dan H (Rusia dan Afrika Tengah), I (Siprus), dan golongan O (Kamerun) mempunyai prevalensi sangat rendah. Di Afrika, sebagian besar subtipe ditemukan, walaupun subtipe B kurang umum.
      • subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya, subtipe B dengan hubungan homoseksual dan penggunaan narkotik secara suntikan (pada intinya, melalui darah) dan subtipe E dan C, melalui hubungan heteroseksual (melalui jalur mukosal).
      • Penelitian di laboratorium yang dilakukan oleh Dr. Max Essex dari Harvard School of Public Health di Boston, AS, menunjukkan subtipe C dan E menularkan dan menggandakan diri lebih efisien dibandingkan dengan subtipe B pada sel Langerhans yang ada dalam mukosa vagina, leher rahim, dan kulup penis, tetapi tidak pada dinding dubur. Data memperlihatkan HIV subtipe E dan C lebih mudah menyebar secara heteroseksual dibandingkan dengan subtipe B.