Ti2

539 views

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
539
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Ti2

  1. 1. Tutor Kimia Klinik<br /> 15 Maret 2010<br />Elektroforesis Protein<br />ResnaHermawati<br />Dra. Soehartini B.S., MS, Apt<br />
  2. 2. 2<br />Tutor kimia klinik<br />
  3. 3. Elektroforesis protein<br />3<br />Tutor kimia klinik<br />
  4. 4. PrinsipDasarElektroforesis<br />A. Partikelbermuatanpada media penyanggaakanbermigrasimenujuelektrodadenganmuatan yang <br />berlawanan. <br /> B. Molekulorganikbanyak yang bersifat<br />amfoterik. <br />Muatandanbesarnyamuatanpartikel<br />dipengaruhipH.Misalnya protein akan<br />bermuatannetralpada pH isoelektrik (pI)<br />bermuatanbermuatan + pH < pI<br />bermuatan - pH > pI<br />Power supply<br />/Wicks<br />4<br />Tutor kimia klinik<br />
  5. 5. C. KecepatanMigrasiLanjutanprinsipdasar…<br />5<br />Tutor kimia klinik<br />
  6. 6. D. ResolusiLanjutanprinsipdasar…kemampuanmemisahkanfragmen. Makin resolusinyajarakantarfragmen yang miripmakinlebar<br />Resolusitergantungbeberapafaktor :<br />6<br />Tutor kimia klinik<br />
  7. 7. E. KualitaselektroforesisLanjtanprinsipdasar…<br />Voltase, <br />arus,panas<br />pH, kekuatan ion <br />7<br />Tutor kimia klinik<br />
  8. 8. KOMPONEN SISTEM ELEKTROFORESIS<br />Alatelektroforesis :<br />Power supply<br />Media Penyangga<br />Sampel<br />Wicks<br />8<br />Tutor kimia klinik<br />
  9. 9. SAMPEL<br />Tergantung Media penyangga<br />diataskertas, dilubangi, well<br />9<br />Tutor kimia klinik<br />
  10. 10. BUFER<br />Fungsi<br /> 1. Menentukandanmenjaga pH konstan<br /> 2. Mengalirkanlistrik<br />Syarat<br /> a. Tidakbereaksidengansampel<br /> b. pH optimal dantidakmendenaturasipartikel(protein pH 8-9 <br />muatan - )<br /> c. Kekuatan ion bufer(ionic strength)<br />rendahmempercepatmigrasi<br />tinggimemperlambatmigrasiresolusitinggi(panas- <br />denaturasi protein)<br />Seringdipakai :<br />Bufer barbital, trisboric acid -EDTA<br />10<br />Tutor kimia klinik<br />
  11. 11. Media Penyangga<br />Tidakjernih, pita lebar<br />Absorpsi protein<br />Ukuranporitidakseragam<br />Pita lebar, resolusirendah<br />11<br />Tutor kimia klinik<br />
  12. 12. Lanjutan Media Penyangga…<br />12<br />Tutor kimia klinik<br />
  13. 13. Lanjutan Media penyangga…..<br />ENDOSMOSIS<br />.<br />13<br />Tutor kimia klinik<br />
  14. 14. Power Supply<br />0- 500 volts<br />0- 100 miliampere<br />Voltaseatauaruskonstan<br />Pemisahan < 30 menit : voltasekonstan<br />Pemisahanlebih lama : aruskonstan ( minimalisasikenaikansuhu)<br />14<br />Tutor kimia klinik<br />
  15. 15. Pewarna<br />Merahterang, serapsinar 525 nm<br />15<br />Tutor kimia klinik<br />
  16. 16. Pembacaanhasil<br />.Pita dipotong<br />.Dieluasikan<br />.fotometer<br />. Pita lgsdiukurdlmsistemoptik<br />. Area dibawahpuncakkurva<br />.Otomatis<br />16<br />Tutor kimia klinik<br />
  17. 17. Lanjutanpembacaanhasil…<br />Serum electrophoregram normal<br />17<br />Tutor kimia klinik<br />
  18. 18. Lanjutanpembacaanhasil…<br />Nilairujukan protein serum( A manual of laboratory and diagnostic test, 2000)<br />18<br />Tutor kimia klinik<br />
  19. 19. Lanjutanpembacaanhasil…<br />19<br />Tutor kimia klinik<br />
  20. 20. Gambaran abnormal elp<br />Peningkatanα1 : inflamatory state (α1 antiprotease ), kehamilan.<br />Peningkatanα2 : nephrotic syndrome, inflamatory state, terapi steroid, kontrasepsi oral, hipertiroidisme, hemolisis in vivo, penyakit liver.<br />Peningkatan ß : hiperlipidemia, hemoglobinemia,anemiadefisiensibesi.<br />Peningkatan Ƴ polyclonal gammopathies : penyakitliver,sirosis, infeksikronis, penyakitautoimun.<br />Peningkatan Ƴ monoclonal gammopathies : multiple myeloma, waldenstormmacroglobulinemia, lymphoid malignancies.<br />20<br />Tutor kimia klinik<br />
  21. 21. Lanjutangbranabn<br />Penurunanα1 : defisiensiα1 antiprotease<br />Penurunanα2: hemolisis in vivo, penyakit liver<br />Penurunanß : hypo ßlipoproteinemia.<br />Penurunan Ƴ : Defisiensiimun<br />21<br />Tutor kimia klinik<br />
  22. 22. Lanjutangambaranabn…<br />B<br />22<br />Tutor kimia klinik<br />
  23. 23. Lanjutangambaranabn…<br />23<br />Tutor kimia klinik<br />
  24. 24. ELEKTROFORESIS DI LAB PK<br />Alat : SebiaHydragel Protein(E) K 20<br /> K 20 electroporesis chamber<br /> Applicators<br /> applicators carriers<br />24<br />Tutor kimia klinik<br />
  25. 25. Lanjutanalatelp PK…<br />Media penyangga : <br />Agarose gel (agarose 0,8 g/dl) &<br />Tris barbital bufer<br />pH :<br />basa<br />Filter paper thin<br />25<br />Tutor kimia klinik<br />
  26. 26. Lanjutanalatelp PK…<br />Bufer : Tris barbital bufer, pH 8,5 ± 0,3<br />A. Fixative solution<br />etanol, as asetat, aquabidest<br />B. Staining :Amidoblack<br />C. Destaining<br /> as sitrat<br />C<br />C<br />C<br />B<br />A<br />26<br />Tutor kimia klinik<br />
  27. 27. Lanjutanalatelp PK…<br />Power supply<br />Incubator dryer IS 80<br />27<br />Tutor kimia klinik<br />
  28. 28. Lanjutanalatelp PK…<br />Scanner ג 570 nm atau filter kuning<br />Komputer<br />28<br />Tutor kimia klinik<br />
  29. 29. PROSEDUR<br />4 tahap :<br />29<br />Tutor kimia klinik<br />
  30. 30. MIGRASI<br />30<br />Tutor kimia klinik<br />
  31. 31. Lanjutanmigrasi…<br />Terendam 1 cm<br />Waktu 15`, 165 V, 7 ± 2 mA(set alat 60 mA) <br />Volbufer 300 ml <br /> pH 8,5 ± 0,3<br />31<br />Tutor kimia klinik<br />
  32. 32. FIKSASI<br />Biarkandingin ± 1`<br />32<br />Tutor kimia klinik<br />
  33. 33. Staining-destaining<br />Gel menghadapkebawah, λ 570 nm<br />33<br />Tutor kimia klinik<br />
  34. 34. Hasil scanning<br />konsentrasirelatif (persentase).<br />34<br />Tutor kimia klinik<br />
  35. 35. DaftarPustaka<br /> <br />1. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical chemistry: Principles, <br />procedurs, correlations. 5th edition. Baltimore: Lippincott <br />Williams&Wilkins; 2005. 105-07, 207-11.<br />2. Word KM, Lehmann CA, Leiken AM. Clinical laboratory instrumentation and automation : principles, application and selection. Philadelphia: WB Sunders Company; 1994. 158-70.I. <br />3. Merck E. Clinical laboratory. 11th edition. Germany; 1974. 145-60.<br />4. Henry JB. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th edition. Philadelphia : WB Saunders Company;2001. 249-61.<br />5. Sebia. Instruction manual. Sebia. 2002.<br />
  36. 36. TERIMAKASIH<br />
  37. 37. Quality control<br />Komersial kit (assayed control serum, Sebia PN 4783).<br />Membuatsendiridari 90 orangdewasasehat (priadanwanita) mencarinilaimean± 2 SD<br />37<br />Tutor kimia klinik<br />
  38. 38. Tambahan<br />Tris barbital buffer: pH 8,5 ± 0,3<br /> 0,92 % barbital<br /> 5,15 % Na barbital<br /> 0,10 % sodium azide<br /> 1 vial dilarutkandalam I liter aquadesttahanhingga 1 tahun, suhuruangan.<br />Amidoblack stain, PH 2<br />Amidoblack0,4 g/dl danEthylene glycol 6,7 %<br />Gantitiap staining 10 gel<br />Larutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest.<br /> Working solution stabilhinggasetahun.<br />38<br />Tutor kimia klinik<br />
  39. 39. Destaining solution<br /> 0,05 g/dl citric acid<br /> 1 ml stock solutiondalam 1 liter<br /> Working solution stabil 1 minggudalamsuhuruangan, padabotoltertutup<br />Bilaterjadiperubahanwarnakontaminasibakteri<br /> + 5 uL/dl Proclin 300<br />Fixation solution<br /> 60 % etanol<br /> 10 % asamasetat<br /> 30 % aquadest<br />Tutuprapatuntukmencegahevaporasi. Gantisetiap 3 bulan. Janganmencampur > 4 gel dalamfixation solution.<br />39<br />Tutor kimia klinik<br />
  40. 40. Endosmosis<br />ketika media penyanggabermuatannegatif<br />Muatan - menarikmuatan + daribufer. <br />Ketikadialirilistrik ion + kekatoda, berlawananarahdengangerakanmuatan - (misalnya protein) yang bergerakkearahanoda. <br />Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerakatauterdorongkearahkatoda.<br />40<br />Tutor kimia klinik<br />
  41. 41. Wick flow<br />Wick flow :<br />1.Gerakan keatasdarilarbufer<br />melaluikeduatepimembran<br /> yang terendam<br />2.Menggantikan kelembaban<br /> yang hilangakibat<br />pemanasan<br />3.Memperlambat gerakan<br />partikelpada media <br />penyangga<br />41<br />Tutor kimia klinik<br />
  42. 42. Konsentrasi normal protein serum<br />α1 globulin : 0,1 – 0,3 g/dl <br />α1 Globulin : α1 antiprotease(90 %),α1 acid glycoprotein, α1 lipoprotein<br />α2 globulin : 0,6-1,0 g/dl<br /> α2 globulin : α2macroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin.<br />β globulin : 0,7-1,4 g/dl <br />ß globulin : transfferin, hemopexin, complement C3, ß lipoprotein.<br />γ globulin : 0,7-1,6 g/dl<br />Ƴ globulin : immunoglobulin G, A, D, E, dan M<br />42<br />Tutor kimia klinik<br />
  43. 43. TahapPersiapan<br />Preparasireagenpada The Hydragel protein(E) K20 kits <br />Agarose gels<br />Siappakai<br />Disimpanpadaposisi gel <br />horizontal danmenghadapkeatas<br />Bisadisimpanpadasuhu<br />ruang/refrigeranated (2-8 ⁰C)<br /> <br />Tris Barbital Buffer<br /> a. Setiap vial stock buffer solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest.<br /> b. Contoh 50 ml stock diencerkansampai 500 cc aquabidest<br /> c. Vial yang sudahdiencerkandapattahanselama 1 tahunpadasuhuruang<br />43<br />Tutor kimia klinik<br />
  44. 44. d. Setelahpemakaian(di chamber), larutaninidisimpanpadatempat lain untukmenghindarikerusakanelektrodapada chamber.<br />e. Ganti buffer pada chamber setelah 1 minggupemakaianatausetiap 1 kali migrasi( 1 full gel <br />agarose) <br />f. 0,05 M Na barbital 10,309 gram<br /> o,o1 M Barbital 1,842 gram<br />Aqaudest 1 liter.<br /> <br />Amidoblack Stain<br /> a. Setiap vial stock amidoblack stain(botolcoklat) ditambahkandengan<br /> staining solution diluents(60 cc) laludiencerkansampai<br /> 200 cc denganaquabidest.<br /> b. Stabilselama 1 bulan<br />44<br />Tutor kimia klinik<br />
  45. 45. c. Menggantiamidoblack stain setiapbuka kit baru.<br />Destaining solution<br /> a. Setiap vial sock destaining solutiondiencerkan<br />sampai 100 L denganaquabidest<br /> b. Contohuntuk 1 ml stock solution diencerkansampai 1 <br /> L denganaquabidest.<br /> c. Working reagenstabilsampai 1 minggubila<br />disimpanpadasuhuruangdandisimpanpadabotol<br />tertutup.<br /> e. Digantisetiapselesaidestaininguntuk 1 kali <br />migrasi(chamber I)<br />45<br />Tutor kimia klinik<br />
  46. 46. Applicators<br /> a. Siappakai<br /> b. Disimpanpadatempat yang keringpadasuhuruang  <br />Filters papers thin<br />Siappakai<br />Fixative solution<br /> a. Etanol 180 ml, acetic acid 30 ml, aquabidest 90 ml<br /> b. Disimpanpadasuhuruang, ganti 3 bulan/ setelah<br />pemakaian 4-6 gel untuktiap 300 cc<br />46<br />Tutor kimia klinik<br />
  47. 47. Migrasi<br />TempatkanHydragel K-20 aplicatorcarierpadapermukaan yang datar<br />Tambahkan 10 μl serum padasumuranaplicators, patahkanujungaplictor<br />47<br />Tutor kimia klinik<br />
  48. 48. Buka pack hydragelagarose plate<br />Serap buffer padaagarose gel dengan paper filter thin secukupnya(harus rata) janganterlalukering<br />48<br />Tutor kimia klinik<br />
  49. 49. Tempatkanagarose gel padahydragel K-20 aplicatordenganposisikutub (+) beradadiatas<br />Tempatkanaplicator yang telahberisi serum padaaplicator carrier diposisi 6<br />49<br />Tutor kimia klinik<br />
  50. 50. Turunkanaplicatorsampaimenyentuhpermukaanagarose gel denganmemutar switch perlahan-lahan<br />Setelah 40 detik, angkatperlahan-lahanaplicator<br />50<br />Tutor kimia klinik<br />
  51. 51. Pindahkanagarose gel ke chamber denganposisikutub(+) kearahkutub(+) pada chamber. <br />Agarose gel harusterendam 1 cm padamasing-masingujungnyadidalambufer<br />51<br />Tutor kimia klinik<br />
  52. 52. Nyalakan power supply dengan setting sbb :<br /> Volume bufer per compartement 150 ml<br /> Total volume bufer 300 ml<br />Waktumigrasi 15 menit<br />Voltase 165 volt<br />Arus 7 ± 2 mA ( set padaalat 60 mA)<br />52<br />Tutor kimia klinik<br />
  53. 53. FIKSASI<br />Setelahmigrasi, pindahkan gel untukdifiksasi<br />Fiksasi gel dalamlarutanfiksasiselama 15 menit<br />53<br />Tutor kimia klinik<br />
  54. 54. Keringkan gel dalaminkubator IS 80 padasuhu 80 selama 10 menit(sampaikering)<br />Biarkandinginsekitar 1 menit<br />54<br />Tutor kimia klinik<br />
  55. 55. Staining-destaining<br />Lakukanpewarnaanpadalarutan staining selama 4 menit<br />Lakukandestainingpadalardestainingdlm 3 kali rendamansampaibenar-benarbersih<br />55<br />Tutor kimia klinik<br />
  56. 56. Keringkan pd IS 80 incubator dryer <br />56<br />Tutor kimia klinik<br />
  57. 57. Scanning<br />Lakukanpembacaanhasilpadascanner denganposisi gel menghadapkescanner(kebawah) dengan λ 570 nm atau filter kuning.<br />57<br />Tutor kimia klinik<br />
  58. 58. 58<br />Tutor kimia klinik<br />
  59. 59. Sampel : serum yang baru, bisadisimpansuhu 20 – 80 C segerasetelah sampling maksimalsatuminggu. Sampel plasma: fibrinogen memberigambaranmonoclonal gammopathydanmerubahpersentasedari zone ELP<br />Fraksi beta 2 akanhilangsetelah 3 hari.<br />Penyimpananbekustabilsampai 1 bulan (sodium azide0,02 g/dl).<br />Sampel yang hemolisis me alpha 2 dan beta zones<br />Sampel serum yang mengandungcryoglobulinataucryogelsangatkentalmengganguprosesdifusi.<br /> + fluidil 25 uLuntuk 75 ul serum.<br />59<br />Tutor kimia klinik<br />
  60. 60. 60<br />Tutor kimia klinik<br />
  61. 61. 61<br />ELP protein urine (Sebia K20)<br />Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria<br />Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin<br />Tutor kimia klinik<br />
  62. 62. 62<br />Tabel 3. Interpretasi ELP protein urine<br />Tutor kimia klinik<br />
  63. 63. 63<br />Interpretasi…….<br />Tutor kimia klinik<br />
  64. 64. 64<br />Media Penyangga<br />1. Paper<br /> Terdiri dari serabut-serabut selulose,murah dan mudah, perlu waktu >16 jam, memisahkan fraksi protein serum menjadi 5 fraksi <br />2. Starch gel (tepung kanji)<br /> Perlu persiapan, harus dipurifikasi (pemurnian dulu), mempunyai pori-pori tertentu sehingga dapat memisahkan 20 fraksi, endosmosis flow besar<br />Agarose gel<br /> Mengandung agarose dan agar opectin. Tidak mengandung asam sulfat dan carboxylic acid sehingga efek endosmosis kecil. Agarose Sebia K20 mengandung agarose 0,8 g/dl, 0,61 % barbital. Penyimpanan suhu ruangan atau 2 – 8 C. stabil hingga tanggal kadaluarsa. Jangan digunakan bila ada cristal, pertumbuhan bakteri, cairan eksudasi dari gel.<br />Tutor kimia klinik<br />
  65. 65. 65<br />3. Agar gel<br /> Perlu persiapan, lebih murni dari starch gel, endosmosis flow besar, waktu separasi protein ± 60 menit.<br />4. Polyacrylamide gel<br /> Inert, muatan netral sehingga endosmosis flow -, pori - pori yang bermacam – macam (25 fraksi protein), interpretasi sukar.<br />5. Cellulose acetat<br /> Banyak dipakai, tanpa persiapan khusus, sampel sedikit, waktu separasi 30 menit, pemisahan fraksi baik, dapat dibuat trasnparan, hasil dibaca dengan densitometer.<br />Tutor kimia klinik<br />
  66. 66. 66<br />b.Sellulosaasetathasilreaksiantaracellulosedanacetic anhydride. Keuntunganband lebihtajam, protein terpisahlebihcepat, dapatdisimpandalamwaktu lama.<br />Kerugiannya hasilakhirburamharusditambahkancairan yang melarutkanseratcellulose asetatfraksi protein yang tercatdenganlatarbelakangtransparan.<br />Tutor kimiaklinik<br />
  67. 67. 67<br />c.Starch gel  amilosedanamilopectin.<br />Kerugian hasilburamdanharusdirendamsemalamuntukhasil yang jernih ,kuantitasterkadangmasihtidakakurat.<br />d.Poliacrylamide gel pemisahanalkalinphospataseisoenzim<br />Keuntungan : stabilpadapemanasan,transparan, tidakbermuatanmenghilangkanefek endosmosis.<br />Kerugiannyaacrylamideberpotensikarsinogenik.<br />Tutor kimia klinik<br />
  68. 68. 68<br />e. Agar gel agarosedanagaropectinbermuatannegatif.<br /> - Agarosefraksiimmobile.<br /> - Agaropectinberikatansecarareversibledengansebagianasam amino dan hemoglobin padapermukaanluar. Hemoglobin-agaropectinkompleksbermigrasikeanoda, hemoglobin yang tidakterikatbergerakkekatoda.<br />Tutor kimia klinik<br />
  69. 69. 69<br />f. Agarose gel lebihmurnidibanding agar gel karenatidakmengandungagaropectin. <br />Keuntunganefek endosmosis kecil,resolusibaik ,hasilakhirjernih , waktulebihsingkat.<br />Kerugiannya tidakdapatdisimpan lama.<br />Tutor kimia klinik<br />
  70. 70. 70<br />Tutor kimia klinik<br />
  71. 71. 71<br />Tutor kimia klinik<br />
  72. 72. 72<br />Endosmosis flow<br />Endosmosis (electroendosmosis/wick flow) terjadiketika media penyanggabermuatannegatifakibatadsorbsi ion hidroksildari buffer. Muatan - menarikmuatan + dari buffer, ketikadialirilistrik ion + bergerakkekatoda yang berlawananarahdenganpergerakanmuatan -. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerak.<br />Efekinidapatdikurangi : penambahansukrosaatausorbitol yang meningkatkanosmolalitasdan gel hampirbebasdari endosmosis (agarose gel).<br />Tutor kimia klinik<br />
  73. 73. 73<br />Teknik Elusi<br />Tanpa dilakukan clearing, masing –masing band dipotong, masukkan tablet elusi (larutan Na2CO 3 0,5 %). Masing – masing larutan elusi baca dengan fotometer 590 nm, kolorimeter dengan filter oranye. OD (optical density) sesuai dengan konsentrasi protein.<br />Kesalahan teknik ini besar:<br /> Pemotongan band, elusi yang tidak sempurna, pembacaan fotometer.<br />Tutor kimia klinik<br />
  74. 74. 74<br />Barbital buffer<br />Tidak mengadakan interaksi dengan protein, tidak menyebabkan denaturasi dari protein<br />0,05 M Na barbital 10,309 gram<br /> o,o1 M Barbital 1,842 gram<br />Aqaudest 1 liter.<br />Tutor kimia klinik<br />
  75. 75. 75<br />Staining solution<br />Yang sering dipakai: Ponceau, Sudan Black, Coomasie, Brilliant blue.<br />Ponceau S 0,5 gram<br /> Trichloracetic acid 5 gram<br /> Aquadest 100 ml<br />Tutor kimia klinik<br />
  76. 76. 76<br />Prosedur ELP cellulose acetat<br />Alat dan reagensia :<br />Cellulose acetat membran<br />Kertas saring<br />Applicator/mikropipet<br />Beberapa kotak pengecatan<br />Kotak kaca untuk clearing solution<br />Obyek glass<br />Oven/hair dyer<br />8. Power supply<br />9. Electrophoresis chamber.<br />10. Densitometer <br />Tutor kimia klinik<br />
  77. 77. 77<br />Prosedur….<br />Running phase.<br /><ul><li>Penjenuhan cell. Acetat membran dalam larutan buffer PH 8,6 selama 5 menit.
  78. 78. Persiapan sampel, serum dengan sedikit bromphenol blue dengan applicator letakkan pada 1/3 tepi cell. Acetat membran
  79. 79. Letakkan pada supporting plate dalam electrophoresis chamber
  80. 80. Pengaturan power supply voltage 20 V (panjang strip), 0,8 mA (lebar strip) selama ± 20 menit</li></ul>Tutor kimia klinik<br />
  81. 81. 78<br />2. Staining phase.<br /> 1 2 3 4 5 6 7<br /> Ponceauacetic acid dehydration clearing <br /> solution solution<br />Prosedur….<br />Tutor kimia klinik<br />
  82. 82. 79<br />Prosedur….<br />cell. Acetat membran direndam dalam staining solution 5 menit.<br />Lakukan destaining (2,3,4 dan 5) untuk melarutkan sisa cat yang tidak terikat oleh protein<br />Masukkan dalam dehydration solution (6)<br />Tempelkan cell. Acetat membran pada obyek glass (hindari gelembung udara)<br />Masukkan dalam clearing solution (7) sehingga menjadi trasparan<br />3. Pembacaan (kualitatif dan kuantitatif)<br />Tutor kimia klinik<br />
  83. 83. 80<br />Tris barbital buffer: PH 9,2 ± 0,3<br />0,92 % barbital<br />5,15 % Na barbital<br />0,10 % sodium azide<br />1 vial dilarutkan dalam I liter aquadest tahan hingga 1 tahun, suhu ruangan.<br />Tutor kimia klinik<br />
  84. 84. 81<br />Amidoblack stain, PH 2,<br />Amidoblack 0,4 g/dl dan Ethylene glycol 6,7 %<br />Ganti tiap staining 10 gel<br />Larutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest.<br /><ul><li>Working solution stabil hingga setahun.</li></ul>Destaining solution<br /><ul><li>0,05 g/dl citric acid</li></ul>1 ml stock solution dalam 1 liter<br />Working solution stabil 1 minggu dalam suhu ruangan, pada botol tertutup<br />Bila terjadi perubahan warna kontaminasi bakteri<br />+ 5 uL/dl Proclin 300<br />Tutor kimia klinik<br />
  85. 85. 82<br />Fixation solution<br />60 % etanol<br />10 % asam asetat<br />30 % aquadest <br />Tutup rapat untuk mencegah evaporasi. Ganti setiap 3 bulan. Jangan mencapur > 4 gel dalam fixation solution.<br />Tutor kimia klinik<br />
  86. 86. 83<br />PROTEIN<br />CONC.RANGE (g/L)<br />M.WEIGHT<br />ACTIONS<br />CHARACTERISTIC OF MAJOR PLASMA PROTEINS<br />Prealbumin<br />Albumin<br /> <br />1-Antitrypsin<br />2-Macroglobulin<br />Haptoglobin<br /> <br />-Lipoprotein<br />Transferrin<br />C3<br />Fibrinogen<br />IgA<br />IgD<br />IgE<br /> <br />IgG<br />IgM<br />0.15-0.36<br />39-51<br /> <br />2.0-4.0<br />1.5-3.5<br />0.4-2.9<br /> <br />2.7-7.4<br />2.0-4.0<br />0.6-1.4<br />1.0-4.0<br />0.4-3.5<br />0.1-0.4<br />50-600(g/L)<br /> <br />7-15<br />0.25-2.0<br />62,000<br />66,000<br /> <br />54,000<br />725,000<br />100,000<br />type1-1<br />380,000<br />80,000<br />185,000<br />340,000<br />160,000<br />180,000<br />180,000<br /> <br />150,000<br />850,000<br />Binds thyroxine: transport vit.A<br />Oncotic pressure: amino acid reservoir: carries small molecules<br />Protease inhibitor<br />Protease inhibitor<br />Binds hemoglobin<br /> <br />Lipid transport<br />Transport Iron<br />Component of complement system<br />Clot formation<br />Surface immunity<br /> <br />Binds to mast cell: hypersensitivity reactions<br />Humoral immunity<br />Humoral immunity primary response<br /> <br />Tutor kimia klinik<br />
  87. 87. 84<br />pendahuluan<br />Hemoglobin merupakan konjugasi komplek protein yang mempunyai BM mendekati 64.500.<br />Hemoglobin:<br /> - Heme : komplek dari fe (II) dan<br /> protoporphyrin.<br /> - Globin : 2 pasang rantai polipeptida<br /> dari asam amino.<br />Tutor kimia klinik<br />
  88. 88. 85<br />Tutor kimia klinik<br />
  89. 89. 86<br />pendahuluan<br />Kelainan Hemoglobin terdiri:<br /> 1. Kualitatif -> struktural, substitusi <br /> asam amino dari rantai polipeptida<br /> ( Hemoglobinopati ).<br /> Hb S -> α2β26 glutamic->valin<br /> Hb C -> α2 β26 glutamic -> lysin<br />Tutor kimia klinik<br />
  90. 90. 87<br />2. Kuantitatif :<br /> Penurunan sintesis dari 1 atau <br /> beberapa rantai globin.<br /> Talasemia α, kelainan pada rantai alfa.<br /> Talasemia β, kelainan pada rantai beta. <br />Tutor kimia klinik<br />
  91. 91. 88<br />Elektroforesis dalam suasana asam memakai media agar gel (Citrate agar electrophoresis pH 6,2 ) dapat memisahkan Hb S dari Hb D dan Hb G juga Hb C dari Hb E dan Hb O. <br />Tutor kimia klinik<br />
  92. 92. 89<br />ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN( Indikasi )<br />Anamnesis : mempunyai riwayat Anemi dan ikterik serta kelainan yang berhubungan dengan darah.<br />Riwayat keluarga<br />Pemeriksaan fisik didapati Hepatosplenomegali.<br />Anemia,MCV↓, MCHC↓,MCH↓,RDW↑.<br />Tutor kimia klinik<br />
  93. 93. 90<br />prinsip<br />Hemoglobin bersifat amfoter ( dapat bermuatan positif dan negatif ).<br />Pada pH basa akan bermuatan negatif dan akan bergerak ke kutub positif ( anoda ).<br />Pada PH asam akan bermuatan positif dan akan begerak ke kutub negatif ( katoda ).<br />Tutor kimia klinik<br />
  94. 94. 91<br />Macam – macam metode pemisahan hemoglobin <br />Elektroforesis basa -> starch gel, polyacrylamide gel, cellulose asetat, agarose gel. Pada pH 8,6.<br />Elektroforesis pada suasana asam -> agarose gel dan agar gel/ agar citrat. Pada pH 6,2.<br />Tutor kimia klinik<br />
  95. 95. 92<br />Macam – macam metode pemisahan hemoglobin <br />Globin chain elektroforesis -> cellulose asetat, agar citrat. Pada pH basa dan asam.<br />Isoelectric focusing ( IEF ) -> polyacrilamide gel dan agarose gel. Pada pH gradient.<br />Tutor kimia klinik<br />
  96. 96. 93<br />PROSEDUR KERJA<br /> 1. Pembuatan sampel<br /> 2. Fase migrasi<br /> 3. Fase fiksasi<br /> 4. Staining dan Destaining<br /> 5. Scanning<br />Tutor kimia klinik<br />
  97. 97. 94<br />SAMPEL<br />Darah + antikoagulan ( EDTA, Citrat, Heparin ).<br />Dibuat Hemolisat :<br /> 1. Sentrifuse sampel 5000 rpm, 5 menit.<br /> 2. Buang plasmanya.<br /> 3. Cuci eritrositnya 2 x dengan 10 volume <br /> saline, sentrifuse 5000 rpm, 5 menit.<br /> 4. Buat hemolisat 10 µl sel darah merah dengan <br /> 130 µl Hemolizing solution.<br /> 5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi 5 <br />menit pada suhu ruangan.<br />Tutor kimia klinik<br />
  98. 98. 95<br />Elektroforesis Hemoglobin (Sebia K20)<br />Sampel : darah + antikoagulan (EDTA, Citrat, atau <br />heparin). Penyimpanan maksimal 5 hari 20 – 80 C. <br />Persiapan hemolisat :<br />1. Sentrifus sampel 5000 rpm ,5 menit.<br />2. Buang bagian plasma.<br />3. Cuci eritrosit 3 X dengan 10 volume saline;sentrifus masing – masing 5000 rpm, 5 menit.<br />4. Buat hemolisat 10 uL sel darah merah dengan 130 uL Hemolizing solution.(1 : 13)<br />5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi suhu ruangan 5 menit.<br />Tutor kimia klinik<br />
  99. 99. 96<br />Prosedur ELP Hb (Sebia K20)<br />1. Tempatkan hydragel K20 applicator carrier<br /> pada permukaan datar.<br />2. + 120 uL aquabidest pada applicator carrier.<br />3. Tempatkan aplikator pada permukaan datar.<br />4. + 10 uL hemolisat pada masing sumuran pada aplikator, patahkan ujungnya<br />5. Buka bungkus hydragel agarose gel plate.<br />6.Serap buffer pada agarose gel dengan filter paper .<br />7. Tempatkan agarose gel pada hydragel K 20 applicator dengan posisi kutub + diatas<br />Tutor kimia klinik<br />
  100. 100. 97<br />Lanjutan……. <br />8. Tempatkan applicator pada applicator carrier diposisi no 4.<br />9. Turunkan applicator sampai menyentuh permukaan agarose gel dengan memutar switch perlahan –lahan,<br />10.Tunggu 1 menit, kemudian angkat perlahan – lahan.<br />11.Pindah agarose gel ke chamber dengan posisi kutub + kearah kutub + pada chamber. Posisi agarose gel menghadap kebawah.<br />12. Nyalakan power supply dengan kondisi:<br /> - volume buffer per compartement 150 ml<br /> - total volume buffer 300 ml<br />Tutor kimia klinik<br />
  101. 101. 98<br />Lanjutan……..<br /> - waktu migrasi 5 menit<br /> - Voltage 165 Volt<br /> - Arus ampere 7 ± 2 mA<br />13. Pindah gel untuk difiksasi 15 menit.<br />14. Keringkan gel (inkubator IS 80),suhu 800 C, 10 menit. Biarkan dingin selama 1 menit.<br />15. Pewarnaan (staining) selama 5 menit.<br />16. Destaining 3 tahap .<br />17. Keringkan pada inkubator IS 80.<br />18. Pembacaan hasil (posisi menghadap kebawah)<br />Tutor kimia klinik<br />
  102. 102. 99<br />Hasil ELP Hb (Sebia K20)<br />Gambar 14.<br />Tutor kimia klinik<br />
  103. 103. 100<br />Nilai normal Hb electrophoresis<br /> Dewasa <br /> Hb A : >95 %<br /> Hb A2 : 1,5 – 3,5 %<br /> Hb F : < 2 %<br /><ul><li>Quality control</li></ul> Assayed blood sample berisi Hb A, F, C dan S atau<br />populasi sehat 200 dewasa (laki dan wanita) untukmencari mean ± 2 SD<br />Tutor kimia klinik<br />
  104. 104. 101<br />Hasil ELP protein serum<br />Tutor kimia klinik<br />
  105. 105. 102<br />Tutor kimia klinik<br />
  106. 106. 103<br />Tutor kimia klinik<br />
  107. 107. 104<br />Tutor kimia klinik<br />
  108. 108. 105<br />Tutor kimia klinik<br />
  109. 109. 106<br />Tutor kimia klinik<br />
  110. 110. 107<br />Quality Control<br />Kontrol dari sampel patologis yang sudah diketahui.<br />Kontrol komersial yang mengandung Hb A, Hb F, Hb C, Hb S.<br />Tutor kimia klinik<br />
  111. 111. Scanning<br />Scan dengan densitometer/scanner pada 570 nm ataudengan filter kuning.<br />QUALITY CONTROL<br />Padasetiapserianalisisdianjurkanuntukmemakaidarahkontrolassayed (misalnyakontrolHb A2 normal, Sebia, PN 4778 ataukontrolHb A2 patologis, Sebia, PN 4779) atausampeldarahassayed yang mengandungHb A, F, S dan C (misalnyakontrolHb AFSC, Sebia, PN 4792).<br />108<br />Tutor kimia klinik<br />
  112. 112. 109<br />Sampel bertahan 1-2 hari pada suhu 4ºC atau – 20 ºC selama 1 bln.<br />Tutor kimia klinik<br />
  113. 113. 110<br />Agarose gel dan agar gel<br />Agar gel tediri dari: agarose dan agaropectin<br />Agarose gel td : bentuk murni dari agar dimana agaropectinnya sudah tidak ada..<br />Untung agarose gel: mengurangi efek endosmosis ok agaropectinnya tidak ada.<br />Tutor kimia klinik<br />
  114. 114. 111<br />EL. Hb pada agar gel ph 6,2<br />Agar gel : agarose dan agaropectin.<br /> Agarose menjadi zat yang immobile,agaropectin akan berikatan dengan hemoglobin.<br /> Hb S terletak dipermukaan punya afinitas tinggi thdp agaropectin. Hb D,G terletak<br /> lebih dalam lagi punya afinitas rendah thdp agaropectin.<br />Hb C punya afinitas yang tinggi thdp agaropectin, Hb E tidak.<br />Tutor kimia klinik<br />
  115. 115. 112<br />GLOBIN CHAIN ELEKTROFORESIS<br />- Pemisahan rantai globin sangat berguna jika hasil antara cellulose asetat dan agar citrat mempunyai hasil yang sama ( Hb E dan O ).<br /> - Penggunaan mercaptoetanol dan urea dapat memisahkan heme dan globin, serta memisahkan rantai α dan non α.<br /> - Rantai globin mempunyai muatan yg beda dan migrasi yg beda antara asam dan basa.<br />Tutor kimia klinik<br />
  116. 116. 113<br />Metode IEF<br />Mirip elektroforesis, kec pemisahan partikel partikel pada pH gradien dengan penambahan amfolites. Kutub anoda dilakukan pada cairan asam dan kutub katoda diletakkan pada cairan basa. <br />Pada pH gradien<br />Protein akan bergerak sesuai isoelektrik point.<br />Tutor kimia klinik<br />
  117. 117. 114<br />Teknik Elusi<br />Tanpa clearing, masing-masing band dipotong, masukkan tablet elusi ( larutan Na2 CO3 0,5%) kedalam tabung. Masing- masing larutan dibaca denagn fotometer 590 nm, kolorimeter denag filter oranye.<br />Kesalahan:<br /> pemotongan band, elusi tidak sempurna, baca fotometer.<br />Tutor kimia klinik<br />
  118. 118. 115<br />ELP protein urine (Sebia K20)<br />Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria<br />Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin<br />Tutor kimia klinik<br />
  119. 119. 116<br />Interpretasi<br />Tutor kimia klinik<br />
  120. 120. 117<br />Interpretasi…….<br />Tutor kimia klinik<br />
  121. 121. ELP protein cerebrospinal fluid<br />Bahan cerebrospinal fluid perlu disentrifus 400 – 500 rcf 5 menit<br />Agarose gel : hidragel HR K20<br />Reference value:<br /> Protein 15 – 45 mg/dl<br /> Prealbumin 2- 7 %<br /> albumin : 56 – 76 %<br />α1 globulin: 2 – 7 %<br />α2 globulin : 4 – 12 %<br /> ß globulin: 8 – 18 %<br /> Ƴ globulin : 3 – 12 %<br />118<br />Tutor kimia klinik<br />
  122. 122. 119<br />ELP protein synovial fluid<br />Protein 1 – 3 g/dl<br /> albumin : 55 – 70 %<br />α1 globulin: 6 – 8 %<br />α2 globulin : 5 – 7 %<br /> ß globulin: 8 – 10 %<br /> Ƴ globulin : 10 – 14 %<br />Tutor kimia klinik<br />
  123. 123. 120<br />Hasil ELP protein urine <br />Tutor kimia klinik<br />
  124. 124. 121<br />Hasil ELP protein urine<br />Tutor kimia klinik<br />
  125. 125. Tutor kimia klinik<br />122<br />Sejarah Elektroforesis<br />1900 Michaelis - pergerakan ion dalammedanlistrik<br />1937 Tiselius – moving boundary, larutanbebas.<br />1946 Consden – silica gel.<br />1950an Starch gel, agar gel, celulose acetate, Polyacrylamide gel, immunoelectrophoresis.<br />
  126. 126. Tutor kimia klinik<br />123<br />1960an Isoelectric focusing<br />1990an Capillary electrophoresis / teknikotomatis<br />2000 Electrophoresis microchip multichannel.<br />
  127. 127. Tutor kimia klinik<br />124<br />Perkembangan Tehnis Baru<br />Isoelectric Focusing<br />High Resolution Protein Electrophoresis<br />Capillary Electrophoresis<br />
  128. 128. Tutor kimia klinik<br />125<br />Isoelectric focusing (IEF)<br />Resolusisangattinggi.<br />Prinsipkerja: molekulbermigrasimelaluigradienpH. Anode: larutanasam; padakatode: larutanbasa, ruangdiantaranyadiisiampholyte. AmpholytemenujupI.<br />Media pilihan: polyacrylamide gel.<br />Aplikasiklinis: isoenzymacid phosphatase, isoformcreatininekinasedan alkaline phosphatase, deteksi pita oligoclonalcairanserebrospinal.<br />
  129. 129. Tutor kimia klinik<br />126<br />High Resolution Protein Electrophoresis (HRE)<br />Agarose gelpadavoltasetinggi (> 250 volts), dalamsuatusistem water cooled. <br />Dapatmendeteksi 15 pita ataulebih, tergantungkemurnian media, komponen buffer, macam cat, misalnya:<br />amido black 10B mendeteksi protein > 30 – 50 mg/dL. <br />Pengecatanperakmendeteksi protein 100μg/dLtanpakonsentrasisampel.<br />
  130. 130. Tutor kimia klinik<br />127<br />Aplikasi klinis HRE<br />elektroforesiscairanserebrospinalpadapenyakitdemyelinisasi,<br />deteksi pita oligoklonalpada multiple sclerosis, <br />deteksi monoclonal gammopathy, <br />separasidankarakterisasi protein urindariglomerulusmaupundaritubulus.<br />
  131. 131. Tutor kimia klinik<br />128<br />Capillary Electrophoresis (CE)<br />Terdiridari: <br />Sebuahkapilerfused silica, <br />Duapenampung buffer elektrolit, <br />Sumbertenagabertegangantinggi(10 – 30 kV) denganmedanlistriktinggi (100 – 1000 V/cm) <br />Sebuahdetektor yang dihubungkandenganalatpengolah data. <br />
  132. 132. Tutor kimia klinik<br />129<br />Gambar CE<br />
  133. 133. Tutor kimia klinik<br />130<br />Sampelmasukkedalamkapilerdengancaraelectrokinetic injectionatauhydrostatic injection.<br />Volume sampelhanyasedikitsekali (nanoliterataupicoliter). <br />Sample dipisahkanolehpengaruhaliranelektrosomotik.<br />Kelebihan CE : cepat, resolusitinggi, otomatisasi.<br />
  134. 134. Tutor kimia klinik<br />131<br />Gambar elektroosmotik<br />
  135. 135. Tutor kimia klinik<br />132<br />
  136. 136. Tutor kimia klinik<br />133<br />Gambar cara sampel masuk (sample injection)<br />
  137. 137. KESALAHAN DAN KETERBATASAN :<br />Janganmenggunakansampel yang sudahlisis.<br />Aplikasisampel :<br />Hindariaplikasisampel yang berlebihan. Sampel yang berlebihandapatmenyebabkandistorsi pita yang terbentuk. Beberapaprosedurmembutuhkanjumlahsampel yang spesifik yang bisadidapatkandenganmenggunakanmikropipet. Cara lain denganmemakaiaplikator. Pemakaianaplikatorharusbersihdanlurusdanpastikanmemakaiukuran yang tepat.<br />134<br />Tutor kimia klinik<br />
  138. 138. Bufer :<br />Bufer yang terkontaminasiatausudah lama, akanmenghasilkanpolamigrasi yang pendek. Jikasedangtidakdigunakan, buferharusdidinginkanuntukmenghindaritumbuhnyamikroorganisme.<br />Media penyangga :<br />Perlakukan media penyanggadenganhati-hati. Hindarisidikjariataukontaminasilainnyasebelum media dibersihkandandikeringkan. Memasukkan media kedalambuferharusperlahansehinggatidakadagelembungudara yang terperangkap. Mengeringkan gel padakertas filter untukmengurangikelebihancairan, karenameletakkansampelpada gel yang terlalubasahakanmenghasilkan pita yang melebar.<br />135<br />Tutor kimia klinik<br />
  139. 139. Pewarnaan :<br />Sebagianbesarpewarnadapatdigunakanbeberapa kali. Sebagaipegangan, 100 mLstaining solutiondapatdigunakanuntuk total 387 cm2 (60 inchi2) cellulose acetateatauagarose gel.<br />Keadaan-keadaan yang dapatterjadisaatproseselektroforesisdengan SEBIA:<br />Tidakterjadimigrasibisadisebabkankarena power supply yang tidakterhubung, elektrodaterbalik, media tidakadadi buffer atau pH yang tidaksesuai.<br />Jarakmigrasi yang pendekdapatdisebabkankarenavoltaseterlalulemahatauwaktuprosesterlalusingkatdan buffer sudah lama atauterkontaminasi.<br />136<br />Tutor kimia klinik<br />
  140. 140. Jarakmigrasijauhdapatdisebabkankarenavoltaseterlalutinggi, waktuprosesterlalu lama dan buffer sudah lama atauterkontaminasi.<br />Migrasilambatdapatdisebabkankarenaberatmolekultinggi, muatanrendah, kekuatan ion terlalutinggiatauvoltaseterlalulemah. Dapatdiatasidenganmenggunakanukuranpori-pori yang besar, mengganti pH danmengencerkan buffer.<br />Pita-pita yang menyebardapatdisebabkankarena media terlalubasahketikasampeldiletakkan, waktuprosesterlalu lama, buffernyakurangtepat, teknik yang kurangpadasaatmeletakkansampel.<br />137<br />Tutor kimia klinik<br />
  141. 141. Gambarmelengkungditepidapatdisebabkankarena media terlalupanasatauterlalukering. Diatasidenganmelembabkanruangandanmemeriksakekuatan ion buffer.<br />Pita yang tipisdantajamdapatdisebabkankarenaberatmolekulsampelsangattinggiuntukukuranpori-pori media(kecil)<br />138<br />Tutor kimia klinik<br />

×