Your SlideShare is downloading. ×
Ti2
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×

Introducing the official SlideShare app

Stunning, full-screen experience for iPhone and Android

Text the download link to your phone

Standard text messaging rates apply

Ti2

406
views

Published on


0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
406
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Tutor Kimia Klinik
    15 Maret 2010
    Elektroforesis Protein
    ResnaHermawati
    Dra. Soehartini B.S., MS, Apt
  • 2. 2
    Tutor kimia klinik
  • 3. Elektroforesis protein
    3
    Tutor kimia klinik
  • 4. PrinsipDasarElektroforesis
    A. Partikelbermuatanpada media penyanggaakanbermigrasimenujuelektrodadenganmuatan yang
    berlawanan.
    B. Molekulorganikbanyak yang bersifat
    amfoterik.
    Muatandanbesarnyamuatanpartikel
    dipengaruhipH.Misalnya protein akan
    bermuatannetralpada pH isoelektrik (pI)
    bermuatanbermuatan + pH < pI
    bermuatan - pH > pI
    Power supply
    /Wicks
    4
    Tutor kimia klinik
  • 5. C. KecepatanMigrasiLanjutanprinsipdasar…
    5
    Tutor kimia klinik
  • 6. D. ResolusiLanjutanprinsipdasar…kemampuanmemisahkanfragmen. Makin resolusinyajarakantarfragmen yang miripmakinlebar
    Resolusitergantungbeberapafaktor :
    6
    Tutor kimia klinik
  • 7. E. KualitaselektroforesisLanjtanprinsipdasar…
    Voltase,
    arus,panas
    pH, kekuatan ion
    7
    Tutor kimia klinik
  • 8. KOMPONEN SISTEM ELEKTROFORESIS
    Alatelektroforesis :
    Power supply
    Media Penyangga
    Sampel
    Wicks
    8
    Tutor kimia klinik
  • 9. SAMPEL
    Tergantung Media penyangga
    diataskertas, dilubangi, well
    9
    Tutor kimia klinik
  • 10. BUFER
    Fungsi
    1. Menentukandanmenjaga pH konstan
    2. Mengalirkanlistrik
    Syarat
    a. Tidakbereaksidengansampel
    b. pH optimal dantidakmendenaturasipartikel(protein pH 8-9
    muatan - )
    c. Kekuatan ion bufer(ionic strength)
    rendahmempercepatmigrasi
    tinggimemperlambatmigrasiresolusitinggi(panas-
    denaturasi protein)
    Seringdipakai :
    Bufer barbital, trisboric acid -EDTA
    10
    Tutor kimia klinik
  • 11. Media Penyangga
    Tidakjernih, pita lebar
    Absorpsi protein
    Ukuranporitidakseragam
    Pita lebar, resolusirendah
    11
    Tutor kimia klinik
  • 12. Lanjutan Media Penyangga…
    12
    Tutor kimia klinik
  • 13. Lanjutan Media penyangga…..
    ENDOSMOSIS
    .
    13
    Tutor kimia klinik
  • 14. Power Supply
    0- 500 volts
    0- 100 miliampere
    Voltaseatauaruskonstan
    Pemisahan < 30 menit : voltasekonstan
    Pemisahanlebih lama : aruskonstan ( minimalisasikenaikansuhu)
    14
    Tutor kimia klinik
  • 15. Pewarna
    Merahterang, serapsinar 525 nm
    15
    Tutor kimia klinik
  • 16. Pembacaanhasil
    .Pita dipotong
    .Dieluasikan
    .fotometer
    . Pita lgsdiukurdlmsistemoptik
    . Area dibawahpuncakkurva
    .Otomatis
    16
    Tutor kimia klinik
  • 17. Lanjutanpembacaanhasil…
    Serum electrophoregram normal
    17
    Tutor kimia klinik
  • 18. Lanjutanpembacaanhasil…
    Nilairujukan protein serum( A manual of laboratory and diagnostic test, 2000)
    18
    Tutor kimia klinik
  • 19. Lanjutanpembacaanhasil…
    19
    Tutor kimia klinik
  • 20. Gambaran abnormal elp
    Peningkatanα1 : inflamatory state (α1 antiprotease ), kehamilan.
    Peningkatanα2 : nephrotic syndrome, inflamatory state, terapi steroid, kontrasepsi oral, hipertiroidisme, hemolisis in vivo, penyakit liver.
    Peningkatan ß : hiperlipidemia, hemoglobinemia,anemiadefisiensibesi.
    Peningkatan Ƴ polyclonal gammopathies : penyakitliver,sirosis, infeksikronis, penyakitautoimun.
    Peningkatan Ƴ monoclonal gammopathies : multiple myeloma, waldenstormmacroglobulinemia, lymphoid malignancies.
    20
    Tutor kimia klinik
  • 21. Lanjutangbranabn
    Penurunanα1 : defisiensiα1 antiprotease
    Penurunanα2: hemolisis in vivo, penyakit liver
    Penurunanß : hypo ßlipoproteinemia.
    Penurunan Ƴ : Defisiensiimun
    21
    Tutor kimia klinik
  • 22. Lanjutangambaranabn…
    B
    22
    Tutor kimia klinik
  • 23. Lanjutangambaranabn…
    23
    Tutor kimia klinik
  • 24. ELEKTROFORESIS DI LAB PK
    Alat : SebiaHydragel Protein(E) K 20
    K 20 electroporesis chamber
    Applicators
    applicators carriers
    24
    Tutor kimia klinik
  • 25. Lanjutanalatelp PK…
    Media penyangga :
    Agarose gel (agarose 0,8 g/dl) &
    Tris barbital bufer
    pH :
    basa
    Filter paper thin
    25
    Tutor kimia klinik
  • 26. Lanjutanalatelp PK…
    Bufer : Tris barbital bufer, pH 8,5 ± 0,3
    A. Fixative solution
    etanol, as asetat, aquabidest
    B. Staining :Amidoblack
    C. Destaining
    as sitrat
    C
    C
    C
    B
    A
    26
    Tutor kimia klinik
  • 27. Lanjutanalatelp PK…
    Power supply
    Incubator dryer IS 80
    27
    Tutor kimia klinik
  • 28. Lanjutanalatelp PK…
    Scanner ג 570 nm atau filter kuning
    Komputer
    28
    Tutor kimia klinik
  • 29. PROSEDUR
    4 tahap :
    29
    Tutor kimia klinik
  • 30. MIGRASI
    30
    Tutor kimia klinik
  • 31. Lanjutanmigrasi…
    Terendam 1 cm
    Waktu 15`, 165 V, 7 ± 2 mA(set alat 60 mA)
    Volbufer 300 ml
    pH 8,5 ± 0,3
    31
    Tutor kimia klinik
  • 32. FIKSASI
    Biarkandingin ± 1`
    32
    Tutor kimia klinik
  • 33. Staining-destaining
    Gel menghadapkebawah, λ 570 nm
    33
    Tutor kimia klinik
  • 34. Hasil scanning
    konsentrasirelatif (persentase).
    34
    Tutor kimia klinik
  • 35. DaftarPustaka
     
    1. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical chemistry: Principles,
    procedurs, correlations. 5th edition. Baltimore: Lippincott
    Williams&Wilkins; 2005. 105-07, 207-11.
    2. Word KM, Lehmann CA, Leiken AM. Clinical laboratory instrumentation and automation : principles, application and selection. Philadelphia: WB Sunders Company; 1994. 158-70.I.
    3. Merck E. Clinical laboratory. 11th edition. Germany; 1974. 145-60.
    4. Henry JB. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th edition. Philadelphia : WB Saunders Company;2001. 249-61.
    5. Sebia. Instruction manual. Sebia. 2002.
  • 36. TERIMAKASIH
  • 37. Quality control
    Komersial kit (assayed control serum, Sebia PN 4783).
    Membuatsendiridari 90 orangdewasasehat (priadanwanita) mencarinilaimean± 2 SD
    37
    Tutor kimia klinik
  • 38. Tambahan
    Tris barbital buffer: pH 8,5 ± 0,3
    0,92 % barbital
    5,15 % Na barbital
    0,10 % sodium azide
    1 vial dilarutkandalam I liter aquadesttahanhingga 1 tahun, suhuruangan.
    Amidoblack stain, PH 2
    Amidoblack0,4 g/dl danEthylene glycol 6,7 %
    Gantitiap staining 10 gel
    Larutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest.
    Working solution stabilhinggasetahun.
    38
    Tutor kimia klinik
  • 39. Destaining solution
    0,05 g/dl citric acid
    1 ml stock solutiondalam 1 liter
    Working solution stabil 1 minggudalamsuhuruangan, padabotoltertutup
    Bilaterjadiperubahanwarnakontaminasibakteri
    + 5 uL/dl Proclin 300
    Fixation solution
    60 % etanol
    10 % asamasetat
    30 % aquadest
    Tutuprapatuntukmencegahevaporasi. Gantisetiap 3 bulan. Janganmencampur > 4 gel dalamfixation solution.
    39
    Tutor kimia klinik
  • 40. Endosmosis
    ketika media penyanggabermuatannegatif
    Muatan - menarikmuatan + daribufer.
    Ketikadialirilistrik ion + kekatoda, berlawananarahdengangerakanmuatan - (misalnya protein) yang bergerakkearahanoda.
    Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerakatauterdorongkearahkatoda.
    40
    Tutor kimia klinik
  • 41. Wick flow
    Wick flow :
    1.Gerakan keatasdarilarbufer
    melaluikeduatepimembran
    yang terendam
    2.Menggantikan kelembaban
    yang hilangakibat
    pemanasan
    3.Memperlambat gerakan
    partikelpada media
    penyangga
    41
    Tutor kimia klinik
  • 42. Konsentrasi normal protein serum
    α1 globulin : 0,1 – 0,3 g/dl
    α1 Globulin : α1 antiprotease(90 %),α1 acid glycoprotein, α1 lipoprotein
    α2 globulin : 0,6-1,0 g/dl
    α2 globulin : α2macroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin.
    β globulin : 0,7-1,4 g/dl
    ß globulin : transfferin, hemopexin, complement C3, ß lipoprotein.
    γ globulin : 0,7-1,6 g/dl
    Ƴ globulin : immunoglobulin G, A, D, E, dan M
    42
    Tutor kimia klinik
  • 43. TahapPersiapan
    Preparasireagenpada The Hydragel protein(E) K20 kits
    Agarose gels
    Siappakai
    Disimpanpadaposisi gel
    horizontal danmenghadapkeatas
    Bisadisimpanpadasuhu
    ruang/refrigeranated (2-8 ⁰C)
     
    Tris Barbital Buffer
    a. Setiap vial stock buffer solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest.
    b. Contoh 50 ml stock diencerkansampai 500 cc aquabidest
    c. Vial yang sudahdiencerkandapattahanselama 1 tahunpadasuhuruang
    43
    Tutor kimia klinik
  • 44. d. Setelahpemakaian(di chamber), larutaninidisimpanpadatempat lain untukmenghindarikerusakanelektrodapada chamber.
    e. Ganti buffer pada chamber setelah 1 minggupemakaianatausetiap 1 kali migrasi( 1 full gel
    agarose)
    f. 0,05 M Na barbital 10,309 gram
    o,o1 M Barbital 1,842 gram
    Aqaudest 1 liter.
     
    Amidoblack Stain
    a. Setiap vial stock amidoblack stain(botolcoklat) ditambahkandengan
    staining solution diluents(60 cc) laludiencerkansampai
    200 cc denganaquabidest.
    b. Stabilselama 1 bulan
    44
    Tutor kimia klinik
  • 45. c. Menggantiamidoblack stain setiapbuka kit baru.
    Destaining solution
    a. Setiap vial sock destaining solutiondiencerkan
    sampai 100 L denganaquabidest
    b. Contohuntuk 1 ml stock solution diencerkansampai 1
    L denganaquabidest.
    c. Working reagenstabilsampai 1 minggubila
    disimpanpadasuhuruangdandisimpanpadabotol
    tertutup.
    e. Digantisetiapselesaidestaininguntuk 1 kali
    migrasi(chamber I)
    45
    Tutor kimia klinik
  • 46. Applicators
    a. Siappakai
    b. Disimpanpadatempat yang keringpadasuhuruang  
    Filters papers thin
    Siappakai
    Fixative solution
    a. Etanol 180 ml, acetic acid 30 ml, aquabidest 90 ml
    b. Disimpanpadasuhuruang, ganti 3 bulan/ setelah
    pemakaian 4-6 gel untuktiap 300 cc
    46
    Tutor kimia klinik
  • 47. Migrasi
    TempatkanHydragel K-20 aplicatorcarierpadapermukaan yang datar
    Tambahkan 10 μl serum padasumuranaplicators, patahkanujungaplictor
    47
    Tutor kimia klinik
  • 48. Buka pack hydragelagarose plate
    Serap buffer padaagarose gel dengan paper filter thin secukupnya(harus rata) janganterlalukering
    48
    Tutor kimia klinik
  • 49. Tempatkanagarose gel padahydragel K-20 aplicatordenganposisikutub (+) beradadiatas
    Tempatkanaplicator yang telahberisi serum padaaplicator carrier diposisi 6
    49
    Tutor kimia klinik
  • 50. Turunkanaplicatorsampaimenyentuhpermukaanagarose gel denganmemutar switch perlahan-lahan
    Setelah 40 detik, angkatperlahan-lahanaplicator
    50
    Tutor kimia klinik
  • 51. Pindahkanagarose gel ke chamber denganposisikutub(+) kearahkutub(+) pada chamber.
    Agarose gel harusterendam 1 cm padamasing-masingujungnyadidalambufer
    51
    Tutor kimia klinik
  • 52. Nyalakan power supply dengan setting sbb :
    Volume bufer per compartement 150 ml
    Total volume bufer 300 ml
    Waktumigrasi 15 menit
    Voltase 165 volt
    Arus 7 ± 2 mA ( set padaalat 60 mA)
    52
    Tutor kimia klinik
  • 53. FIKSASI
    Setelahmigrasi, pindahkan gel untukdifiksasi
    Fiksasi gel dalamlarutanfiksasiselama 15 menit
    53
    Tutor kimia klinik
  • 54. Keringkan gel dalaminkubator IS 80 padasuhu 80 selama 10 menit(sampaikering)
    Biarkandinginsekitar 1 menit
    54
    Tutor kimia klinik
  • 55. Staining-destaining
    Lakukanpewarnaanpadalarutan staining selama 4 menit
    Lakukandestainingpadalardestainingdlm 3 kali rendamansampaibenar-benarbersih
    55
    Tutor kimia klinik
  • 56. Keringkan pd IS 80 incubator dryer
    56
    Tutor kimia klinik
  • 57. Scanning
    Lakukanpembacaanhasilpadascanner denganposisi gel menghadapkescanner(kebawah) dengan λ 570 nm atau filter kuning.
    57
    Tutor kimia klinik
  • 58. 58
    Tutor kimia klinik
  • 59. Sampel : serum yang baru, bisadisimpansuhu 20 – 80 C segerasetelah sampling maksimalsatuminggu. Sampel plasma: fibrinogen memberigambaranmonoclonal gammopathydanmerubahpersentasedari zone ELP
    Fraksi beta 2 akanhilangsetelah 3 hari.
    Penyimpananbekustabilsampai 1 bulan (sodium azide0,02 g/dl).
    Sampel yang hemolisis me alpha 2 dan beta zones
    Sampel serum yang mengandungcryoglobulinataucryogelsangatkentalmengganguprosesdifusi.
    + fluidil 25 uLuntuk 75 ul serum.
    59
    Tutor kimia klinik
  • 60. 60
    Tutor kimia klinik
  • 61. 61
    ELP protein urine (Sebia K20)
    Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria
    Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin
    Tutor kimia klinik
  • 62. 62
    Tabel 3. Interpretasi ELP protein urine
    Tutor kimia klinik
  • 63. 63
    Interpretasi…….
    Tutor kimia klinik
  • 64. 64
    Media Penyangga
    1. Paper
    Terdiri dari serabut-serabut selulose,murah dan mudah, perlu waktu >16 jam, memisahkan fraksi protein serum menjadi 5 fraksi
    2. Starch gel (tepung kanji)
    Perlu persiapan, harus dipurifikasi (pemurnian dulu), mempunyai pori-pori tertentu sehingga dapat memisahkan 20 fraksi, endosmosis flow besar
    Agarose gel
    Mengandung agarose dan agar opectin. Tidak mengandung asam sulfat dan carboxylic acid sehingga efek endosmosis kecil. Agarose Sebia K20 mengandung agarose 0,8 g/dl, 0,61 % barbital. Penyimpanan suhu ruangan atau 2 – 8 C. stabil hingga tanggal kadaluarsa. Jangan digunakan bila ada cristal, pertumbuhan bakteri, cairan eksudasi dari gel.
    Tutor kimia klinik
  • 65. 65
    3. Agar gel
    Perlu persiapan, lebih murni dari starch gel, endosmosis flow besar, waktu separasi protein ± 60 menit.
    4. Polyacrylamide gel
    Inert, muatan netral sehingga endosmosis flow -, pori - pori yang bermacam – macam (25 fraksi protein), interpretasi sukar.
    5. Cellulose acetat
    Banyak dipakai, tanpa persiapan khusus, sampel sedikit, waktu separasi 30 menit, pemisahan fraksi baik, dapat dibuat trasnparan, hasil dibaca dengan densitometer.
    Tutor kimia klinik
  • 66. 66
    b.Sellulosaasetathasilreaksiantaracellulosedanacetic anhydride. Keuntunganband lebihtajam, protein terpisahlebihcepat, dapatdisimpandalamwaktu lama.
    Kerugiannya hasilakhirburamharusditambahkancairan yang melarutkanseratcellulose asetatfraksi protein yang tercatdenganlatarbelakangtransparan.
    Tutor kimiaklinik
  • 67. 67
    c.Starch gel  amilosedanamilopectin.
    Kerugian hasilburamdanharusdirendamsemalamuntukhasil yang jernih ,kuantitasterkadangmasihtidakakurat.
    d.Poliacrylamide gel pemisahanalkalinphospataseisoenzim
    Keuntungan : stabilpadapemanasan,transparan, tidakbermuatanmenghilangkanefek endosmosis.
    Kerugiannyaacrylamideberpotensikarsinogenik.
    Tutor kimia klinik
  • 68. 68
    e. Agar gel agarosedanagaropectinbermuatannegatif.
    - Agarosefraksiimmobile.
    - Agaropectinberikatansecarareversibledengansebagianasam amino dan hemoglobin padapermukaanluar. Hemoglobin-agaropectinkompleksbermigrasikeanoda, hemoglobin yang tidakterikatbergerakkekatoda.
    Tutor kimia klinik
  • 69. 69
    f. Agarose gel lebihmurnidibanding agar gel karenatidakmengandungagaropectin.
    Keuntunganefek endosmosis kecil,resolusibaik ,hasilakhirjernih , waktulebihsingkat.
    Kerugiannya tidakdapatdisimpan lama.
    Tutor kimia klinik
  • 70. 70
    Tutor kimia klinik
  • 71. 71
    Tutor kimia klinik
  • 72. 72
    Endosmosis flow
    Endosmosis (electroendosmosis/wick flow) terjadiketika media penyanggabermuatannegatifakibatadsorbsi ion hidroksildari buffer. Muatan - menarikmuatan + dari buffer, ketikadialirilistrik ion + bergerakkekatoda yang berlawananarahdenganpergerakanmuatan -. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerak.
    Efekinidapatdikurangi : penambahansukrosaatausorbitol yang meningkatkanosmolalitasdan gel hampirbebasdari endosmosis (agarose gel).
    Tutor kimia klinik
  • 73. 73
    Teknik Elusi
    Tanpa dilakukan clearing, masing –masing band dipotong, masukkan tablet elusi (larutan Na2CO 3 0,5 %). Masing – masing larutan elusi baca dengan fotometer 590 nm, kolorimeter dengan filter oranye. OD (optical density) sesuai dengan konsentrasi protein.
    Kesalahan teknik ini besar:
    Pemotongan band, elusi yang tidak sempurna, pembacaan fotometer.
    Tutor kimia klinik
  • 74. 74
    Barbital buffer
    Tidak mengadakan interaksi dengan protein, tidak menyebabkan denaturasi dari protein
    0,05 M Na barbital 10,309 gram
    o,o1 M Barbital 1,842 gram
    Aqaudest 1 liter.
    Tutor kimia klinik
  • 75. 75
    Staining solution
    Yang sering dipakai: Ponceau, Sudan Black, Coomasie, Brilliant blue.
    Ponceau S 0,5 gram
    Trichloracetic acid 5 gram
    Aquadest 100 ml
    Tutor kimia klinik
  • 76. 76
    Prosedur ELP cellulose acetat
    Alat dan reagensia :
    Cellulose acetat membran
    Kertas saring
    Applicator/mikropipet
    Beberapa kotak pengecatan
    Kotak kaca untuk clearing solution
    Obyek glass
    Oven/hair dyer
    8. Power supply
    9. Electrophoresis chamber.
    10. Densitometer
    Tutor kimia klinik
  • 77. 77
    Prosedur….
    Running phase.
    • Penjenuhan cell. Acetat membran dalam larutan buffer PH 8,6 selama 5 menit.
    • 78. Persiapan sampel, serum dengan sedikit bromphenol blue dengan applicator letakkan pada 1/3 tepi cell. Acetat membran
    • 79. Letakkan pada supporting plate dalam electrophoresis chamber
    • 80. Pengaturan power supply voltage 20 V (panjang strip), 0,8 mA (lebar strip) selama ± 20 menit
    Tutor kimia klinik
  • 81. 78
    2. Staining phase.
    1 2 3 4 5 6 7
    Ponceauacetic acid dehydration clearing
    solution solution
    Prosedur….
    Tutor kimia klinik
  • 82. 79
    Prosedur….
    cell. Acetat membran direndam dalam staining solution 5 menit.
    Lakukan destaining (2,3,4 dan 5) untuk melarutkan sisa cat yang tidak terikat oleh protein
    Masukkan dalam dehydration solution (6)
    Tempelkan cell. Acetat membran pada obyek glass (hindari gelembung udara)
    Masukkan dalam clearing solution (7) sehingga menjadi trasparan
    3. Pembacaan (kualitatif dan kuantitatif)
    Tutor kimia klinik
  • 83. 80
    Tris barbital buffer: PH 9,2 ± 0,3
    0,92 % barbital
    5,15 % Na barbital
    0,10 % sodium azide
    1 vial dilarutkan dalam I liter aquadest tahan hingga 1 tahun, suhu ruangan.
    Tutor kimia klinik
  • 84. 81
    Amidoblack stain, PH 2,
    Amidoblack 0,4 g/dl dan Ethylene glycol 6,7 %
    Ganti tiap staining 10 gel
    Larutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest.
    • Working solution stabil hingga setahun.
    Destaining solution
    • 0,05 g/dl citric acid
    1 ml stock solution dalam 1 liter
    Working solution stabil 1 minggu dalam suhu ruangan, pada botol tertutup
    Bila terjadi perubahan warna kontaminasi bakteri
    + 5 uL/dl Proclin 300
    Tutor kimia klinik
  • 85. 82
    Fixation solution
    60 % etanol
    10 % asam asetat
    30 % aquadest
    Tutup rapat untuk mencegah evaporasi. Ganti setiap 3 bulan. Jangan mencapur > 4 gel dalam fixation solution.
    Tutor kimia klinik
  • 86. 83
    PROTEIN
    CONC.RANGE (g/L)
    M.WEIGHT
    ACTIONS
    CHARACTERISTIC OF MAJOR PLASMA PROTEINS
    Prealbumin
    Albumin
     
    1-Antitrypsin
    2-Macroglobulin
    Haptoglobin
     
    -Lipoprotein
    Transferrin
    C3
    Fibrinogen
    IgA
    IgD
    IgE
     
    IgG
    IgM
    0.15-0.36
    39-51
     
    2.0-4.0
    1.5-3.5
    0.4-2.9
     
    2.7-7.4
    2.0-4.0
    0.6-1.4
    1.0-4.0
    0.4-3.5
    0.1-0.4
    50-600(g/L)
     
    7-15
    0.25-2.0
    62,000
    66,000
     
    54,000
    725,000
    100,000
    type1-1
    380,000
    80,000
    185,000
    340,000
    160,000
    180,000
    180,000
     
    150,000
    850,000
    Binds thyroxine: transport vit.A
    Oncotic pressure: amino acid reservoir: carries small molecules
    Protease inhibitor
    Protease inhibitor
    Binds hemoglobin
     
    Lipid transport
    Transport Iron
    Component of complement system
    Clot formation
    Surface immunity
     
    Binds to mast cell: hypersensitivity reactions
    Humoral immunity
    Humoral immunity primary response
     
    Tutor kimia klinik
  • 87. 84
    pendahuluan
    Hemoglobin merupakan konjugasi komplek protein yang mempunyai BM mendekati 64.500.
    Hemoglobin:
    - Heme : komplek dari fe (II) dan
    protoporphyrin.
    - Globin : 2 pasang rantai polipeptida
    dari asam amino.
    Tutor kimia klinik
  • 88. 85
    Tutor kimia klinik
  • 89. 86
    pendahuluan
    Kelainan Hemoglobin terdiri:
    1. Kualitatif -> struktural, substitusi
    asam amino dari rantai polipeptida
    ( Hemoglobinopati ).
    Hb S -> α2β26 glutamic->valin
    Hb C -> α2 β26 glutamic -> lysin
    Tutor kimia klinik
  • 90. 87
    2. Kuantitatif :
    Penurunan sintesis dari 1 atau
    beberapa rantai globin.
    Talasemia α, kelainan pada rantai alfa.
    Talasemia β, kelainan pada rantai beta.
    Tutor kimia klinik
  • 91. 88
    Elektroforesis dalam suasana asam memakai media agar gel (Citrate agar electrophoresis pH 6,2 ) dapat memisahkan Hb S dari Hb D dan Hb G juga Hb C dari Hb E dan Hb O.
    Tutor kimia klinik
  • 92. 89
    ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN( Indikasi )
    Anamnesis : mempunyai riwayat Anemi dan ikterik serta kelainan yang berhubungan dengan darah.
    Riwayat keluarga
    Pemeriksaan fisik didapati Hepatosplenomegali.
    Anemia,MCV↓, MCHC↓,MCH↓,RDW↑.
    Tutor kimia klinik
  • 93. 90
    prinsip
    Hemoglobin bersifat amfoter ( dapat bermuatan positif dan negatif ).
    Pada pH basa akan bermuatan negatif dan akan bergerak ke kutub positif ( anoda ).
    Pada PH asam akan bermuatan positif dan akan begerak ke kutub negatif ( katoda ).
    Tutor kimia klinik
  • 94. 91
    Macam – macam metode pemisahan hemoglobin
    Elektroforesis basa -> starch gel, polyacrylamide gel, cellulose asetat, agarose gel. Pada pH 8,6.
    Elektroforesis pada suasana asam -> agarose gel dan agar gel/ agar citrat. Pada pH 6,2.
    Tutor kimia klinik
  • 95. 92
    Macam – macam metode pemisahan hemoglobin
    Globin chain elektroforesis -> cellulose asetat, agar citrat. Pada pH basa dan asam.
    Isoelectric focusing ( IEF ) -> polyacrilamide gel dan agarose gel. Pada pH gradient.
    Tutor kimia klinik
  • 96. 93
    PROSEDUR KERJA
    1. Pembuatan sampel
    2. Fase migrasi
    3. Fase fiksasi
    4. Staining dan Destaining
    5. Scanning
    Tutor kimia klinik
  • 97. 94
    SAMPEL
    Darah + antikoagulan ( EDTA, Citrat, Heparin ).
    Dibuat Hemolisat :
    1. Sentrifuse sampel 5000 rpm, 5 menit.
    2. Buang plasmanya.
    3. Cuci eritrositnya 2 x dengan 10 volume
    saline, sentrifuse 5000 rpm, 5 menit.
    4. Buat hemolisat 10 µl sel darah merah dengan
    130 µl Hemolizing solution.
    5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi 5
    menit pada suhu ruangan.
    Tutor kimia klinik
  • 98. 95
    Elektroforesis Hemoglobin (Sebia K20)
    Sampel : darah + antikoagulan (EDTA, Citrat, atau
    heparin). Penyimpanan maksimal 5 hari 20 – 80 C.
    Persiapan hemolisat :
    1. Sentrifus sampel 5000 rpm ,5 menit.
    2. Buang bagian plasma.
    3. Cuci eritrosit 3 X dengan 10 volume saline;sentrifus masing – masing 5000 rpm, 5 menit.
    4. Buat hemolisat 10 uL sel darah merah dengan 130 uL Hemolizing solution.(1 : 13)
    5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi suhu ruangan 5 menit.
    Tutor kimia klinik
  • 99. 96
    Prosedur ELP Hb (Sebia K20)
    1. Tempatkan hydragel K20 applicator carrier
    pada permukaan datar.
    2. + 120 uL aquabidest pada applicator carrier.
    3. Tempatkan aplikator pada permukaan datar.
    4. + 10 uL hemolisat pada masing sumuran pada aplikator, patahkan ujungnya
    5. Buka bungkus hydragel agarose gel plate.
    6.Serap buffer pada agarose gel dengan filter paper .
    7. Tempatkan agarose gel pada hydragel K 20 applicator dengan posisi kutub + diatas
    Tutor kimia klinik
  • 100. 97
    Lanjutan…….
    8. Tempatkan applicator pada applicator carrier diposisi no 4.
    9. Turunkan applicator sampai menyentuh permukaan agarose gel dengan memutar switch perlahan –lahan,
    10.Tunggu 1 menit, kemudian angkat perlahan – lahan.
    11.Pindah agarose gel ke chamber dengan posisi kutub + kearah kutub + pada chamber. Posisi agarose gel menghadap kebawah.
    12. Nyalakan power supply dengan kondisi:
    - volume buffer per compartement 150 ml
    - total volume buffer 300 ml
    Tutor kimia klinik
  • 101. 98
    Lanjutan……..
    - waktu migrasi 5 menit
    - Voltage 165 Volt
    - Arus ampere 7 ± 2 mA
    13. Pindah gel untuk difiksasi 15 menit.
    14. Keringkan gel (inkubator IS 80),suhu 800 C, 10 menit. Biarkan dingin selama 1 menit.
    15. Pewarnaan (staining) selama 5 menit.
    16. Destaining 3 tahap .
    17. Keringkan pada inkubator IS 80.
    18. Pembacaan hasil (posisi menghadap kebawah)
    Tutor kimia klinik
  • 102. 99
    Hasil ELP Hb (Sebia K20)
    Gambar 14.
    Tutor kimia klinik
  • 103. 100
    Nilai normal Hb electrophoresis
    Dewasa
    Hb A : >95 %
    Hb A2 : 1,5 – 3,5 %
    Hb F : < 2 %
    • Quality control
    Assayed blood sample berisi Hb A, F, C dan S atau
    populasi sehat 200 dewasa (laki dan wanita) untukmencari mean ± 2 SD
    Tutor kimia klinik
  • 104. 101
    Hasil ELP protein serum
    Tutor kimia klinik
  • 105. 102
    Tutor kimia klinik
  • 106. 103
    Tutor kimia klinik
  • 107. 104
    Tutor kimia klinik
  • 108. 105
    Tutor kimia klinik
  • 109. 106
    Tutor kimia klinik
  • 110. 107
    Quality Control
    Kontrol dari sampel patologis yang sudah diketahui.
    Kontrol komersial yang mengandung Hb A, Hb F, Hb C, Hb S.
    Tutor kimia klinik
  • 111. Scanning
    Scan dengan densitometer/scanner pada 570 nm ataudengan filter kuning.
    QUALITY CONTROL
    Padasetiapserianalisisdianjurkanuntukmemakaidarahkontrolassayed (misalnyakontrolHb A2 normal, Sebia, PN 4778 ataukontrolHb A2 patologis, Sebia, PN 4779) atausampeldarahassayed yang mengandungHb A, F, S dan C (misalnyakontrolHb AFSC, Sebia, PN 4792).
    108
    Tutor kimia klinik
  • 112. 109
    Sampel bertahan 1-2 hari pada suhu 4ºC atau – 20 ºC selama 1 bln.
    Tutor kimia klinik
  • 113. 110
    Agarose gel dan agar gel
    Agar gel tediri dari: agarose dan agaropectin
    Agarose gel td : bentuk murni dari agar dimana agaropectinnya sudah tidak ada..
    Untung agarose gel: mengurangi efek endosmosis ok agaropectinnya tidak ada.
    Tutor kimia klinik
  • 114. 111
    EL. Hb pada agar gel ph 6,2
    Agar gel : agarose dan agaropectin.
    Agarose menjadi zat yang immobile,agaropectin akan berikatan dengan hemoglobin.
    Hb S terletak dipermukaan punya afinitas tinggi thdp agaropectin. Hb D,G terletak
    lebih dalam lagi punya afinitas rendah thdp agaropectin.
    Hb C punya afinitas yang tinggi thdp agaropectin, Hb E tidak.
    Tutor kimia klinik
  • 115. 112
    GLOBIN CHAIN ELEKTROFORESIS
    - Pemisahan rantai globin sangat berguna jika hasil antara cellulose asetat dan agar citrat mempunyai hasil yang sama ( Hb E dan O ).
    - Penggunaan mercaptoetanol dan urea dapat memisahkan heme dan globin, serta memisahkan rantai α dan non α.
    - Rantai globin mempunyai muatan yg beda dan migrasi yg beda antara asam dan basa.
    Tutor kimia klinik
  • 116. 113
    Metode IEF
    Mirip elektroforesis, kec pemisahan partikel partikel pada pH gradien dengan penambahan amfolites. Kutub anoda dilakukan pada cairan asam dan kutub katoda diletakkan pada cairan basa.
    Pada pH gradien
    Protein akan bergerak sesuai isoelektrik point.
    Tutor kimia klinik
  • 117. 114
    Teknik Elusi
    Tanpa clearing, masing-masing band dipotong, masukkan tablet elusi ( larutan Na2 CO3 0,5%) kedalam tabung. Masing- masing larutan dibaca denagn fotometer 590 nm, kolorimeter denag filter oranye.
    Kesalahan:
    pemotongan band, elusi tidak sempurna, baca fotometer.
    Tutor kimia klinik
  • 118. 115
    ELP protein urine (Sebia K20)
    Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria
    Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin
    Tutor kimia klinik
  • 119. 116
    Interpretasi
    Tutor kimia klinik
  • 120. 117
    Interpretasi…….
    Tutor kimia klinik
  • 121. ELP protein cerebrospinal fluid
    Bahan cerebrospinal fluid perlu disentrifus 400 – 500 rcf 5 menit
    Agarose gel : hidragel HR K20
    Reference value:
    Protein 15 – 45 mg/dl
    Prealbumin 2- 7 %
    albumin : 56 – 76 %
    α1 globulin: 2 – 7 %
    α2 globulin : 4 – 12 %
    ß globulin: 8 – 18 %
    Ƴ globulin : 3 – 12 %
    118
    Tutor kimia klinik
  • 122. 119
    ELP protein synovial fluid
    Protein 1 – 3 g/dl
    albumin : 55 – 70 %
    α1 globulin: 6 – 8 %
    α2 globulin : 5 – 7 %
    ß globulin: 8 – 10 %
    Ƴ globulin : 10 – 14 %
    Tutor kimia klinik
  • 123. 120
    Hasil ELP protein urine
    Tutor kimia klinik
  • 124. 121
    Hasil ELP protein urine
    Tutor kimia klinik
  • 125. Tutor kimia klinik
    122
    Sejarah Elektroforesis
    1900 Michaelis - pergerakan ion dalammedanlistrik
    1937 Tiselius – moving boundary, larutanbebas.
    1946 Consden – silica gel.
    1950an Starch gel, agar gel, celulose acetate, Polyacrylamide gel, immunoelectrophoresis.
  • 126. Tutor kimia klinik
    123
    1960an Isoelectric focusing
    1990an Capillary electrophoresis / teknikotomatis
    2000 Electrophoresis microchip multichannel.
  • 127. Tutor kimia klinik
    124
    Perkembangan Tehnis Baru
    Isoelectric Focusing
    High Resolution Protein Electrophoresis
    Capillary Electrophoresis
  • 128. Tutor kimia klinik
    125
    Isoelectric focusing (IEF)
    Resolusisangattinggi.
    Prinsipkerja: molekulbermigrasimelaluigradienpH. Anode: larutanasam; padakatode: larutanbasa, ruangdiantaranyadiisiampholyte. AmpholytemenujupI.
    Media pilihan: polyacrylamide gel.
    Aplikasiklinis: isoenzymacid phosphatase, isoformcreatininekinasedan alkaline phosphatase, deteksi pita oligoclonalcairanserebrospinal.
  • 129. Tutor kimia klinik
    126
    High Resolution Protein Electrophoresis (HRE)
    Agarose gelpadavoltasetinggi (> 250 volts), dalamsuatusistem water cooled.
    Dapatmendeteksi 15 pita ataulebih, tergantungkemurnian media, komponen buffer, macam cat, misalnya:
    amido black 10B mendeteksi protein > 30 – 50 mg/dL.
    Pengecatanperakmendeteksi protein 100μg/dLtanpakonsentrasisampel.
  • 130. Tutor kimia klinik
    127
    Aplikasi klinis HRE
    elektroforesiscairanserebrospinalpadapenyakitdemyelinisasi,
    deteksi pita oligoklonalpada multiple sclerosis,
    deteksi monoclonal gammopathy,
    separasidankarakterisasi protein urindariglomerulusmaupundaritubulus.
  • 131. Tutor kimia klinik
    128
    Capillary Electrophoresis (CE)
    Terdiridari:
    Sebuahkapilerfused silica,
    Duapenampung buffer elektrolit,
    Sumbertenagabertegangantinggi(10 – 30 kV) denganmedanlistriktinggi (100 – 1000 V/cm)
    Sebuahdetektor yang dihubungkandenganalatpengolah data.
  • 132. Tutor kimia klinik
    129
    Gambar CE
  • 133. Tutor kimia klinik
    130
    Sampelmasukkedalamkapilerdengancaraelectrokinetic injectionatauhydrostatic injection.
    Volume sampelhanyasedikitsekali (nanoliterataupicoliter).
    Sample dipisahkanolehpengaruhaliranelektrosomotik.
    Kelebihan CE : cepat, resolusitinggi, otomatisasi.
  • 134. Tutor kimia klinik
    131
    Gambar elektroosmotik
  • 135. Tutor kimia klinik
    132
  • 136. Tutor kimia klinik
    133
    Gambar cara sampel masuk (sample injection)
  • 137. KESALAHAN DAN KETERBATASAN :
    Janganmenggunakansampel yang sudahlisis.
    Aplikasisampel :
    Hindariaplikasisampel yang berlebihan. Sampel yang berlebihandapatmenyebabkandistorsi pita yang terbentuk. Beberapaprosedurmembutuhkanjumlahsampel yang spesifik yang bisadidapatkandenganmenggunakanmikropipet. Cara lain denganmemakaiaplikator. Pemakaianaplikatorharusbersihdanlurusdanpastikanmemakaiukuran yang tepat.
    134
    Tutor kimia klinik
  • 138. Bufer :
    Bufer yang terkontaminasiatausudah lama, akanmenghasilkanpolamigrasi yang pendek. Jikasedangtidakdigunakan, buferharusdidinginkanuntukmenghindaritumbuhnyamikroorganisme.
    Media penyangga :
    Perlakukan media penyanggadenganhati-hati. Hindarisidikjariataukontaminasilainnyasebelum media dibersihkandandikeringkan. Memasukkan media kedalambuferharusperlahansehinggatidakadagelembungudara yang terperangkap. Mengeringkan gel padakertas filter untukmengurangikelebihancairan, karenameletakkansampelpada gel yang terlalubasahakanmenghasilkan pita yang melebar.
    135
    Tutor kimia klinik
  • 139. Pewarnaan :
    Sebagianbesarpewarnadapatdigunakanbeberapa kali. Sebagaipegangan, 100 mLstaining solutiondapatdigunakanuntuk total 387 cm2 (60 inchi2) cellulose acetateatauagarose gel.
    Keadaan-keadaan yang dapatterjadisaatproseselektroforesisdengan SEBIA:
    Tidakterjadimigrasibisadisebabkankarena power supply yang tidakterhubung, elektrodaterbalik, media tidakadadi buffer atau pH yang tidaksesuai.
    Jarakmigrasi yang pendekdapatdisebabkankarenavoltaseterlalulemahatauwaktuprosesterlalusingkatdan buffer sudah lama atauterkontaminasi.
    136
    Tutor kimia klinik
  • 140. Jarakmigrasijauhdapatdisebabkankarenavoltaseterlalutinggi, waktuprosesterlalu lama dan buffer sudah lama atauterkontaminasi.
    Migrasilambatdapatdisebabkankarenaberatmolekultinggi, muatanrendah, kekuatan ion terlalutinggiatauvoltaseterlalulemah. Dapatdiatasidenganmenggunakanukuranpori-pori yang besar, mengganti pH danmengencerkan buffer.
    Pita-pita yang menyebardapatdisebabkankarena media terlalubasahketikasampeldiletakkan, waktuprosesterlalu lama, buffernyakurangtepat, teknik yang kurangpadasaatmeletakkansampel.
    137
    Tutor kimia klinik
  • 141. Gambarmelengkungditepidapatdisebabkankarena media terlalupanasatauterlalukering. Diatasidenganmelembabkanruangandanmemeriksakekuatan ion buffer.
    Pita yang tipisdantajamdapatdisebabkankarenaberatmolekulsampelsangattinggiuntukukuranpori-pori media(kecil)
    138
    Tutor kimia klinik