Th5

1,548 views
1,383 views

Published on

0 Comments
2 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
1,548
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
22
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
2
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Th5

  1. 1. TUTORHEMATOLOGI 6/13/2011 1
  2. 2. TUTOR HEMATOLOGI PENGECATAN SITOKIMIA PADA LEUKEMIA Oleh : PANTJARARA B. Pembimbing YETTY HERNANINGSIH LABORATORIUM / INSTALASI PATOLOGI KLINIKFAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA RSU Dr. SOETOMO SURABAYA 2009 6/13/2011 2
  3. 3. •PENDAHULUANPemeriksaan morfologi darah, membantudiagnosis dan klasifikasi leukimia.Abnormalitas atau imaturitas dari sel sering sulitdiidentifikasi tipenya dengan tepat. 6/13/2011 3
  4. 4. •Pengecatan sitokimia pada leukemiadapat membantu membedakan tipesatu sel dengan yang lain, terutamamembedakan antara leukimia Limfoiddan Mieloid. 6/13/2011 4
  5. 5. Pasien dengan tipe laukemia tertentu diklasifikasikan sehubungandengan penentuan tindakan pengobatan yang akurat danprognosis yang lebih baik. Klasifikasi FAB membagi leukamia akut menjadi 2 kelompok yaitu: 1. Acute Myeloid Leukemia, di bagi menjadi: M0 AML, diferensiasi minimal M1 AML, tanpa maturasi M2 AML, dengan maturasi M3 Leukemia Promielositik Akut, hipergranuler M3v Leukemia Promielositik Akut varian, mikrogranuler M4 Leukemia Mielomonositik Akut M4eo Leukemia Mielomonositik Akut, dengan eosinifilia M5a Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi rendah M5b Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi baik M6 Eritroleukimia Akut M7 Leukemia Megakarioblastik Akut 6/13/2011 5
  6. 6. 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: - L1, - L2 dan - L3. 6/13/2011 6
  7. 7. Pengecatan sitokimia:Sudan black, Periodic acid-Schiff (PAS),Terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT),Leukocyte alkaline phosphatase (LAP),Tartrate-resistent acid phosphatase (TRAP),Myeloperoxidase,Leukocyte spesific esterase danLeukocyte nonspecific esterase. 6/13/2011 7
  8. 8. Masing-masing metode mempunyaispesifikasi dan mekanisme terjadinya hasilpositif (+) dan negatif (-).Pada tugas tutor ini:Myeloperoxidase,Sudan black,Periodic acid-Schiff (PAS),Leukocyte Alkaline Phosphatase danNon Spesific Esterase. 6/13/2011 8
  9. 9. Tujuan Pemeriksaan Sitokimia:-Membedakan antara leukimia Limfoid dan Mieloid,-diagnosis dan klasifikasi Leukemia Mielositik Akut. 6/13/2011 9
  10. 10. Pengecatan Sitokimia •1 Mieloperoksidase Prinsip: Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi substrat dengan adanya hidrogen peroksida membentuk presipitat warna coklat. SH2+H2O2═S+2H2O Mieloperoksidase terdapat pada: granula dari sel netrofil, eosinofil dan monosit. 6/13/2011 10
  11. 11. Reagen:Fiksasi: Formal aseton bufer. BFA (Buffered Formal Aceton)Substrat: 3,3`diaminobenzidine tetrachloride (DAB)H2O2 ( Hidrogen peroksida, 30% w/v).Bufer: Sorensen’s phosphate buffer pH 7,3Counterstain: Aquous haematoxylin 6/13/2011 11
  12. 12. Metode:•Hapusan difiksasi dalam buffer formal aseton selama 45 detik.•Bilas dengan air kran dan keringkan.•Inkubasi dalam larutan substrat selama10 mnt. Campur 30 mg DAB dalam 60ml bufer, tambahkan H2O2 120 µl•Bilas dengan air kran.•Counterstain dengan Carazzi`s hematoksilin 1 menit.•Bilas dengan air kran dan keringkan. 6/13/2011 12
  13. 13. Interpretasi:Pengecatan myeloperoksidase membedakan antara sel-sel immatur pada leukemia mieloblastik akut (+) dan pada leukemia limfoblastik akut (-). Mieloperoksidase terdapat pada netrofil, eosinofil dan monosit. Sel-sel Limfoid dan eritroid tidak memiliki enzim dengan aktifitas peroksidase.Sel eosinofil positif kuat (+).Sel basofil, limfosit dan seri eritrosit memberi hasil negatif (-).Pada sel monosit: ada granula halus, tidak begitu terang seperti granulosit, monosit negatif(-) atau positif (+).Pada AML (Leukimia mielositik akut) lebih dari 5% sel muda hasil positif(+). 6/13/2011 13
  14. 14. •2 Pengecatan dengan sudan blackPrinsip: Sudan Black mewarnai granulasitoplasma yang mengandung fosfolipidintraseluler dan lipid yang ada dalamlekosit darah, berwarna coklat hitam. 14 6/13/2011
  15. 15. Reagen:• Sudan Black B.•Bufer fenol.•Working stain solution. Tambahkan 40 ml buffer ke dalam 60 ml Sudan Black B.•Counterstain:May-Grunwald-Giemsa atau Leishman stain 6/13/2011 15
  16. 16. Metode:• Fiksasi dalam formalin selama15 menit.• Bilas dengan cepat dengan air kran dan keringkan.• Celupkan dalam working stain selama satu jam.• Cuci dengan etanol 70%.• Counterstain dengan Leishman`s atau MGG (May-Grunwald-Giemsa) 6/13/2011 16
  17. 17. Interpretasi: Hasil reaksi: granuler berwarna hitam.Membedakan antara leukemia limfoblastik akut (-) dan leukemia myeloblastik akut (+). Umumnya sel dengan peroksidase positif (+) memberi reaksi positif (+) pada pewarnaan Sudan black. Seri mielosit stadium muda granula sitolplasma berwarna hitam coklat (agak pucat). Stadium matang netrofil mempunyai granula coklat hitam (yang jelas). Monosit (+) lemah, berwarna hitam coklat. Limfosit dan Limfoblas negatif (-). Basofil (-)/ bright red/purple metakromasi. Megakariosit, eritroblas, normoblas dan trombosit (-). 6/13/2011 17
  18. 18.  Kelebihan sudan black kdibanding mieloperoksidase: dapat menggunakan hapusan darah atau sumsum tulang yang lebih lama dan hasilnya lebih awet. 6/13/2011 18
  19. 19. •3 Periodic-Acid Schiff (PAS)Prinsip:Pewarnaan PAS (periodic acid-schiff) untukmendeteksi glikogen dan mukopolisakaridaintraseluler. Reaksi yang terjadi adalah oksidasiglikogen oleh periodic acid menjadi dialdehida,kemudian dialdehida bereaksi dengan reagenschiff membentuk warna merah. 6/13/2011 19
  20. 20. Reagen:Fiksasi: MetanolPeriodic-acid solution.Reagen schiff : basic fuchsinCaunterstain:aqueous Haemtoxylin. 6/13/2011 20
  21. 21. Metode:1.Fiksasi selama15 mnt dalam metanol.2.Bilas dengan cepat dengan air kran.3.Tambahkan Periodic-acid solution selama10 mnt.4.Cuci dengan air kran dan keringkan.5. Celupkan dalam reagen Schiff`s basic fuchsin selama 30 mnt.6. Cuci gengan air kran.7. Counterstain Carazzi`s aqueous Haematoxylin selama 5-10 mnt. 6/13/2011 21
  22. 22. Interpretasi: Hasil reaksi adalah mulai dari pink sampai dengan merah terang.Pengecatan PAS dapat digunakan pada identifikasi eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah merah yang immatur.→(+) kuat Granulosit prekursor positif lemah, lebih nyata pada stadium matang.Pengecatan PAS tampak pada sel-sel muda pada akut limfoblastik maupun akut mielogenik leukimia. 6/13/2011 22
  23. 23. Leukosit Alkalin Fosfatase (LAP)Prinsip: Pada granula neutrofilik terdapat enzim fosfatase yangmampu menghidrolisis substrat yang megandung naptol fosfatmenjadi produk yang berikatan dengan zat wana membentukkomplek warna biru. Substrat mengandung naptolfosfat →hidrolisis→naptol+azodye 6/13/2011 23
  24. 24. Aktifitas Alkalin fosfatase ditemukan dalam sitoplasma: Netrofil, osteoblas, sel endotelial vaskuler, dan limfosit.Kadar alkalin fosfatase netrofil dalam darah perifer dihitung sebagai skor LAP (Leukocyte Alkaline Phosphatase).Leukocyte Alkaline Phosphatase merupakan enzim yang terdapat dalam granula sekunder dari sel Polimorfonuklear. 6/13/2011 24
  25. 25. Reagen :Fiksasi : Metanolformalin 4%Substrat : Naphtol AS phosphateBuffer : Tris buffer 0,2 mol/L pH 9,0Stock substrate solution : Larutkan naphtol AS phosphate dalam N,N- dimethylformaldehide. Tambahkan Tris buffer 100 ml 0,2 mol/l, pH 9,1.Coupling azo-dye: garam Fast Blue BBCounterstain : Aqueous Netral red 0,02%. 6/13/2011 25
  26. 26. Metode:•Fiksasi hapusan darah selama 30 detik dalam formalin metanol 4%•Bilas dengan air kran dan keringkan•Siapkan larutan working substrat: stock substrate solution 40ml. Tambahkan Fast Blue BB 24mg. Inkubasi selama 15 menit.•Bilas dengan air kran dan keringkan.•Counterstain selama 3 menit dalam Aqueous neutral red, bilas dengan cepat dan keringkan. 6/13/2011 26
  27. 27. Hapusan darah harus segera dibuatsebelum 30 menit, sebab aktifitaslekosit alkali fosfatase menurundengan cepat pada pengunaanEDTA. Hapusan harus segera dicatdalam waktu 6 jam. 6/13/2011 27
  28. 28. Interpretasi: Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP) dapat diukursecara kasar dengan menentukan skor ukuran dan intensitasgranula yang terwarnai.Normal :15-130, nilai yang mungkin mulai 0 maksimal 400Penghitungan pada 100 sel netrofilIntensitas pewarnaan: 0 (tanpa pewarnaan) sampai dengan 4(pewarnaan kuat dan dalam).0 Negatif, tanpa granula, sitoplasma tidak tercat.1 Positif lemah, granula jarang.2 Positif lemah, jumlah granula sedang.3 Positif kuat, granula banyak.4 Positif sangat kuat dengan banyak granula kasar dalam sitoplasma, sering menutupi nukleus. 6/13/2011 28
  29. 29. Kondisi yang berhubungan dengan skor abnormal Leukosit Alkalin FosfataseSkor LAP < 15CMLParoxysmal nocturnal hemoglobinuriaHematologic neoplasmsMyelodysplastic syndromesInfeksi atau keracunanSkor LAP >130InfeksiGrowth factor theraphyMyeloproliferative disorder selain CMLInflammatory disordersKehamilan, kontrasepsi oralStressobat (lithium, korticosteroid, estrogen) 6/13/2011 29
  30. 30. Nonspesific (alpha-naphthyl butirate oralpha-naphthyl acetate) EsterasePengecatan non spesific esterase digunakanuntuk identifikasi sel monosit tetapi tidakuntuk granulosit atau eosinofil. Limfosit Tmatur yang tercat dengan karakteristik fokal,dotlike pattern. 6/13/2011 30
  31. 31. Prinsip:Lekosit esterase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisisacyl atau chloroacyl ester dari α- naphtol atau naphtol AS.Perbedaan pemeriksaan antara alpha-naphthyl butirate danalpha-naphthyl acetate Esterase : pada substrat spesifik dan pH. 6/13/2011 31
  32. 32. α- Naphtyl butyrate esteraseReagen:Fiksasi: Buffered Formalin asetonBufer: Bufer fosfat 100 mmol/L pH 8,0Substrat: α- Naphtyl butyrate 100µL dalam 5ml asetonCoupling reagent: Fast garnet GBC 15 mg atau Fast Blue BBCounterstain: aqueous haematoxylin 6/13/2011 32
  33. 33. Metode:1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik2. Bilas dgn air kran dan keringkan3. Tambahkan Fast Garnet GBC pada bufer4. Tambahkan 0,5 ml α- naphtol butyrate atau larutanaseton5. Inkubasi selama 20-40 mnt6. Bilas dengan air kran.7. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 1-5mnt 6/13/2011 33
  34. 34. Interpretasi:Hasil reaksi granuler coklatMayoritas monosit (>80%) tercat kuat.Netrofil, eosinofil, basofil dan platelet negatif (-)Limfosit B (-), T tidak tercat.Pada bone marrow : monosit dan makrofag teracat kuat. α – Naphtol butyrate lebih spesifik untuk identifikasi komponen monosit dalam AML dari pada α- Naphtol acetate. 6/13/2011 34
  35. 35. α- Naphtyl acetate esteraseReagen :Fiksasi : Buffered Formalin asetonBufer : Bufer fosfat 66 mmol/L pH 6,3Substrat: α- Naphtyl acetate 100µL dalam 5ml etilen monometil eter.Medium inkubasi.Coupling reagent: pararosanilineCounterstain: aqueous haematoxylin 6/13/2011 35
  36. 36. Metode:1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik2. Bilas dgn air kran dan keringkan3. Celupkan slide dalam medium inkubasi selama 30-60 mnt.4. Bilas dengan air kran dan keringkan.5. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 2-5 mnt 6/13/2011 36
  37. 37. InterpretasiHasil reaksi: warna merah/coklat rata.Monosit normal dan lekemik tercat kuatGranulosit normal negatif (-)Mielodisplasi atau AML positif (+).Megakarioblas lekemik (+)Limfosit, Limfoblas T (+) dotlikeLeukaemic eritroblast (+) 6/13/2011 37
  38. 38. NORMAL HEMOPOIETIC CELLS IN CYTOCHEMICAL STAINS Peroxidase reaction Peroxidase reaction Sudan black B reaction Internet atlas of hemayology 6/13/2011 38
  39. 39. PAS reaction PAS reactionAS-D-chloroacetate esterase reaction Butyrate esterase reaction Internet atlas of hematology 6/13/2011 39
  40. 40. MPO (-) Sudan Black (-)PAS (-) PAS (+) Data pasien40 6/13/2011
  41. 41. CONTOH HASIL POSITIFReaksi Peroksidase. Granulosit positif kuat pada sel leukemia. Pembesaran 1000X Reaksi Peroksidase pada sumsum tulang. Pembesaran 1000X. Internet atlas 6/13/2011 Leukemia library 41
  42. 42. Sudan Black B pada sumsum tulang (Leukemia Mielositik akut) (FAB M1) Sudan Black B (Leukemia Promielositk Akut) Internet atlas 6/13/2011 Leukemia library 42
  43. 43. Granula kasar, PAS positif pada sitoplasma. Pembesaran 1000X.Granula kasar, PAS positif dalam sitoplasma limfoblas sumsum tulang.Pembesaran 1000X. Internet atlas 6/13/2011 Leukemia library 43
  44. 44. Neutrophyl Alkaline Phosphatase. Positif kuat ( 4+) dan positif sedang (3+ dan 2+) Reaksi Alpha- Naphthylacetae esterase pada sumsum tulang. Limfoblas negatif. Pembesaran 500X. Internet atlas 6/13/2011 Leukemia library 44
  45. 45. Reaksi Alpha- Napthylacetate esterase pada darah perifer, sel leukemia positif kuat.Pembesaran 1000X. Dengan aktifitas yang sangat tinnggi pada sel leukemia. Pembesaran 1000X. Internet atlas 6/13/2011 Leukemia library 45
  46. 46. LAP, A=0 LAP, B=1+ LAP, C=2+ 6/13/2011 Wintrobe’s 46
  47. 47. LAP, D=3+ LAP, E=4+ 6/13/2011 Wintrobe’s 47
  48. 48. G= PAS, granula positif pada malignant lymphoid cell (sezary syndrom) H= PAS, sel ALL dengan granula kasar 6/13/2011 48 Wintrobe’s
  49. 49. I= Peroksidase, Granula biru dari sitoplasma mieloblas pada pasien acute myeloblastic leukemia J= Peroksidase, Granula matur warna biru 6/13/2011 Wintrobe’s 49
  50. 50. K= Sudan Black L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orange 6/13/2011 Wintrobe’s 50
  51. 51. M= Chloroasetate esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML 6/13/2011 Wintrobe’s51
  52. 52. Histochemical Features of AMLFAB HISTOCHEMISTRYM1 Occasional peroxidate+ granules, PAS-M2 Strongly peroxidase+, PAS-M3 Strongly peroxidase+, PAS-M4 Strongly peroxidase+, some cells may be PAS+M5 Many be peroxidase+ and PAS+, nonspecific esterase stains are strongly + .M6 Red cell precursors are PAS+, ringed sideroblasts are seen with iron stainsM7 Variable, platelet peroxidase can be demonstrated by electron microscopy Color atlas hematologi Harald Theml dkk 6/13/2011 52
  53. 53. Hasil tes sitokimia pada AML dan ALLJenis tes sitokimia AML Klasifikasi FAB M0 M1-3 M4 M5 M6 M7 ALL Mieloperoksidase - + + - - - - Chloroacetate - + + +/- - - -α - naphtol acetate - - + + - +/- - Sudan Black B - + + - - - - PAS - - +/- +/- + - + E.N Kosasih 6/13/2011 53
  54. 54. 6/13/2011 54
  55. 55. 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: L1: ALL dengan sel limfoblas kecil-kecil dan merupakan 84% dari ALL. L2: ALL sel lebih besar, inti ireguler, kromatin bergumpal, nukleoli prominen dan sitoplasma agak banyak. Merupakan 14% dari ALL. L3: ALL mirip dengan limfoma burkitt, yaitu sitoplasma basofil dengan banyak vakuola, 1% dari ALL. 6/13/2011 55
  56. 56. Pengecatan sitokimia:Merupakan suatu metode yang digunakan dalampengecatan pada sampel darah dengan berdasarkanreaksi dan menggunakan bahan-bahan kimia 6/13/2011 56
  57. 57. Metode: Non spesifik esterase1, Hapusan difiksasi dengan udara kering dalam paparan formalin →4 menit2. Bilas dengan air suling dan keringkan3. Inkubasi dalam chloroacetate substrate solution → 5-15menit →suhu kamar.4. Bilas dengan air suling dan keringkan.5.Inkubasi dalam butyrate substrate solution → 15-30menit→ suhu ruangan dan hindari sinar.6. Bilas dengan air suling7. Caunterstain dalam aqueous haematoxylin →5 menit8. Bilas dengan air suling keringkan dan periksa. 6/13/2011 57
  58. 58. Isoenzim dibagi dalam 2 kelompok:1. Bands 1,2,7,8 dan 9 berhubungan dengan sterase spesifik dai netrofil khususnya pengecatan dengan naphtol AS-D chloroacetate sterase (chloroacetate esterase, CAE).2. Bands 3, 4, 5 dan 6 berhubungan dngan non spesifik esterase (NSE) pengecatan dengan α- naphtyl acetae esterase (ANAE) dan α- naphtyl butirat esterase.MPO terdapat pada granula primer dan sekunder dari netrofil,dan prekursornya di granula eosinofil dan di granula azurofilikdari monosit.MPO pada granula eosinofil, resiste terhdap sianida, dimanapada netrofil dan monosit sensitif. 6/13/2011 58
  59. 59. Interpretasi: Pengecatan non spesific esterase →identifikasi sel monosit tidak untuk granulosit atau eosinofil. Pengecatan limfosit T matur →karakteristik fokal, dotlike pattern. Selain pada monosit, reaksi juga terjadi pada : makrofag, histiosit, megakariosit, dan beberapa sel karsinoma. Pengecatan alpha naphthyl butyrate →lebih spesifik →kurang sensitif, dari pada alpha- naphthyl acetate. Perbedaan pengecatan dengan esterase: pada megakarioblas, yang tidak tercat dengan alpha naphthyl butyrate tetapi tercat dengan substrat alpha- naphthyl acetate. 6/13/2011 59
  60. 60. Sel-sel dengan granula primer →promielosit→azurofilik →netrofil,eosinofil, basofil dapat dilihat hanya deganElektron mikroskop. Granula sekunder→mielositGranula sekunder→alkali fosfataseGranula tersier→tampak pada akhirmielosit→ pada human netrofil 6/13/2011 60
  61. 61. 6/13/2011 61
  62. 62. 6/13/2011 62
  63. 63. Keterangan gambar:LAP:A= 0, B=1+, C=2+, D=3+, E=4+G= PAS+ (Sezary syndrome)H= PAS, ALL, granulakasar I= Peroksidase, granula biru, AMLJ = Cat biru pada granula maturK= Sudan BlakL= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orangeM= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, ada pasien AMLN= Tartrat-resistent acid phosphat, granula sitoplama warna gelap. 6/13/2011 63
  64. 64. M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML 6/13/2011 64
  65. 65. MPO (-) Sudan Black (-)PAS (-) PAS (+) 6/13/2011 65
  66. 66. Perbedaan ALL dan AMLSitokimia ALL AMLMieloperoksidase - +Sudan black - +Esterase non spesifik - +PAS (kasar) + (monositik) Hematologi klinik ringkas, EGC 6/13/2011 66
  67. 67. •1 MieloperoksidasePrinsip:Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi substratdengan adanya hidrogen peroksida membentukpresipitat warna coklat. SH2+H2O2═S+2H2OMieloperoksidase terdapat pada:-granula primer dari sel promielosit.-granula sekunder dari sel mielosit 6/13/2011 67
  68. 68. • MPO Tidak dihambat EDTA, oxalat ataupun heparin, slide bisa dikerjakan 12jam setelah pengambilan darah.•Pengecatan masih bisa dilakukan pada slide yang disimpan selama 1 minggu, pada suhu kamar•Kekurangan MPO: - Sensitif dengan cahaya, panas dan metanol - Pengecatan pada hapusan darah harus dilakukan segera, tidak boleh lebih dari 3 minggu. 6/13/2011 68
  69. 69. Interpretasi:Pengecatan PAS digunakan paling awal pada identifikasi eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah merah yang immatur.Reaksi positif (+) →adanya glikogen atau polisakarida setelah penambahan diastase.Sel netrofil: semua stadium hasil positif (+), lebih nyata pada stadium matang. Glikogen berada dalam sitoplasma tidak dalam granula.Eosinofil: Hasil positif (+).Mieloblas: Bervariasi antara negatif (-) dan hanya beberapa butir granula halus.Monosit: Pewarnaan samar-samar.Limfosit : Dapat mengandung granula kecil atau besar. 6/13/2011 69

×