Your SlideShare is downloading. ×
0
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Rkk20
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply
0 Comments
4 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
1,113
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
4
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. 1
    Tinjauan Pustaka Imunologi
    Pemeriksaan Serologis dan Antigenemiauntuk Infeksi Cytomegaloviruspada ibu Hamil dan Bayi Baru Lahir
    dr. Liana
    Pembimbing:
    dr. Endang Retnowati,MS,Sp.PK(K)
  • 2. 2
    Pendahuluan
    Infeksi Virus
    pada Kehamilan
    Morbiditas dan mortalitas
    Ibu hamil dan janin
  • 9. 3
    Pendahuluan
    CMV  termasuk famili Herpesviridae,
    Manusia host alami untuk CMV
    60-80% orang dewasa  seropositif terhadap antibodi anti-CMV
    Infeksi primer pada dewasa sehat  asimptomatis, kecuali pada kelompok risiko tinggi (immunocompromised)
    Setelah infeksi primertetap laten pada inang
  • 10. 4
    Pendahuluan
    Infeksi Kongenital
    Simptomatis
    Ikterus
    hepatosplenomegali
    gangguan pendengaran,
    pengelihatan
    retardasi mental
    Asimptomatis
    10% terjadi kecacatan jangka panjang
  • 11. 5
    Gambar 1. A. CMV menginfeksi fibroblas B,C,D. Tampak intranuclear inclusion bodies (IN) dan intra cytoplasmic (IC) inclusionbodies pada fibroblast yang terinfeksi CMV (Revello,2002)
  • 12. 6
    Genome CMV :
    • Terdiri dari 230 kb ds-DNA
    • 13. mengkode 200 protein
    • 14. memiliki kapsid ikosahedral
    • 15. dikelilingi lipid envelope
    • 16. Outer envelopeglikoprotein
    • 17. Viral tegumentlap. protein
    antara envelope dan kapsid
    taget respons imun seluler
     mengandung pp65
    (phosphoprotein 65)
    Gambar 1. Cytomegalovirus
    (Reschke,1998)
  • 18. 7
    Siklus hidup CMV
    1.Glikoprotein B dan H berikatan dgn reseptor sel
    2. Virus memasuki sel  melepaskan DNA virus, virion proteins and virion mRNA transcripts pada sitoplasma sel  virion mRNA ditranslasikan
    DNA virus dan viral protein masuk ke inti sel
    3. Dalam inti sel: viral and cellular gene diekspresikan  replikasi DNA virus
    4. DNA virus, viral and cellular protein, virion transcripts membentuk virion virion envelope dan partikel virus yang infeksius keluar dari sel
  • 19. 8
    Gambar 2. Siklus Hidup CMV (Huang, 2000)
  • 20. 9
    Cara Penularan
    • Transmisi CMV secara vertikal
    • 21. Acquired CMV infection
    sekret infeksius, air susu ibu, air liur, urine, muntahan, transfusi darah,aktivitas seksual,
    transplantasi organ
  • 22. 10
    Transmisi CMV Secara Vertikal
    Transmisi CMV dari ibu ke janin selama kehamilan
    Akibat infeksi primer atau ulangan
    Berat gejala tergantung status imunitas ibu.
    Infeksi primer pada awal kehamilan  memiliki prognosis lebih buruk
    Pada infeksi ulangan atau reaktivasi
    risiko transmisi ke janin relatif rendah dan sebagian besar janin lahir normal.
    Infeksi kongenital simptomatis akibat reinfeksi oleh strain CMV yang berbeda
  • 23. 11
    Gambar 3. Karakteristik CMV pada kehamilan (Stagno,1985)
  • 24. 12
    Acquired CMV Infection
    Infeksi terjadi setelah kelahiran  infeksi perinatal
    infeksi sekunder akibat terpapar sekret infeksius saat melewati jalan lahir atau melaui ASI (air susu ibu)
    >50% bayi yang minum (ASI) yang mengandung virus, menjadi terinfeksi CMV, tetapi sebagian besar tidak menunjukkan gejala
    Transfusion-acquired CMV Infection
    gejala menyerupai mononucleosis
    waktu inkubasi 20-60 hari.
  • 25. 13
    Patogenesis Infeksi Kongenital
    • Transmisi vertikal pada infeksi primer  30-40%
    • 26. Mekanisme transmisi CMV ke janin belum banyak diketahui.
    • 27. 15% infeksi primer  abortus spontan
    • 28. Plasenta merupakan tempat replikasi CMV sebelum terjadi transmisi ke janin.
    • 29. Plasenta yg terinfeksi CMV menyebabkan
    gangguan diferensiasi dan invasi
    cytothrophoblast
  • 30. 14
    Gambar 5. Skema Transmisi CMV dalam rahim (Lazzarotto,2003)
  • 31. 15
    Manifestasi Klinis Congenital CMV Infection (CCI)
    Tabel 1.Gejala Klinis Bayi dengan CCI
  • 32. 16
    Congenital CMV Infection
    CCI penyebab retardasi mental kedua setelah
    Down syndrome
    Angka kematian bayi  10-15%
    70-90% asimptomatis
    10%  gangguan pertumbuhan janin
    Infeksi Kongenital Asimptomatik
    • Wanita yang memiliki imunitas terhadap CMV
    bayi normal (klinis) saat lahir
    • 15-20% bayi mengalami ketulian 1 atau 2 sisi 
    terjadi beberapa bulan atau tahun setelah lahir 
    terkadang tidak dapat terdeteksi dgn pem.audiologi rutin
  • 33. 17
    Pemeriksaan SerologisPemeriksaan IgM anti-CMV
    Uji ELISA Tidak Langsung (Indirect ELISA)
    • Prinsip pemeriksaan :
    ikatan IgM anti-CMV (serum) dengan
    Ag CMV yang dilapiskan pada microwell plate.
    Kelemahan:
    • inhibisi kompetitif akibat adanya IgG
    • 34. Interference oleh IgM anti-Rheumatoid Factor
    (IgM-RF)
  • 35. 18
    IgM Captured ELISA
    • Prinsip:
    ikatan selektif IgM pada fase padat
    IgG tidak mengganggu pemeriksaan
    • Hasil positif palsu akibat adanya faktor rematoid dan antinuclear antibodydihindari dengan menggunakan
    fragmen F(ab’)2
  • 36. 19
    Gambar 6. Prinsip Pemeriksaan IgM capture ELISA (Handojo,2004)
  • 37. 20
    Recombinant IgM Assays
    Terdapat perbedaan besar hasil IgM antar kit  kurangnya standardisasi virus yang dipakai
    Menggunakan protein struktural dan non struktural CMV atau peptida rekombinan dan prinsip microparticle enzyme immunoassay
    Mikropartikel dilapis 3 prot.struktural (pp150, pp65, pp38) dan 1 protein non-struktural pp52
    Dikembangkan pemeriksaan dengan prinsip chemiluminescence assay.
    Dapat mendeteksi kadar IgM yang rendah.
  • 38. 21
    Gambar 7. Prinsip Pemeriksaan IgM anti-CMV
  • 39. 22
    Pemeriksaan IgG avidity
    • IgM anti-CMV tidak secara langsung berhubungan dengan infeksi primer selama kehamilan.
    • 40. Pemeriksaan IgG avidity membantu membedakan infeksi primer dan nonprimer
    • 41. IgG aviditas rendah diproduksi beberapa bulan setelah onset infeksi
    • 42. Maturasi IgG aviditas meningkat
    • 43. IgG aviditas tinggi terdeteksi pada penderita dgn infeksi CMV lama atau infeksi ulangan
  • 23
    Pemeriksaan IgG avidity
    • Aviditas dinyatakan dalam indeks aviditas % IgG yang mengikat Ag yang telah diberi agen denaturasi
    • 44. IgM yg tinggi disertai indeks aviditas rendah menunjukkan adanya infeksi primer < 4 bulan
    • 45. Indeks aviditas >65% pada trimester awal kehamilan  indikator yang baik adanya infeksi lama
    • 46. Indeks aviditas rendah  ≤ 50%  risiko adanya infeksi primer < 4 bulan
  • 24
    Gambar 8. Prinsip Pemeriksaan IgG CMV Avidity
  • 47. 25
    Deteksi Virus dan Produk Virus pada Darah Ibu
    Metode pemeriksaan:
    • menentukan viremia (penentuan CMV dalam darah)
    • 48. menentukan derajat antigenemia
    • 49. Kuantifikasi DNA CMV dalam darah (DNAemia)
    • 50. menentukan mRNACMV (RNAemia)
  • 26
    Deteksi Virus dan Produk Virus pada Darah Ibu….Antigenemia assay
    • untuk mendeteksi dan menghitung jumlah lekosit pada darah tepiterutama polymorphonuclear (PMN) yang positif mengandung matriks phosphoprotein (pp65) CMV
    Prinsip pemeriksaan:
    • PMN diwarnai dan diikat oleh Ab monoklonal terhadap matriks pp65
    • 51. Hasil  rasio jumlah sel yg positif mengandung Ag terhadap jumlah sel yg dipakai untuk membuat slide
    • 52. Digunakan untuk monitoring infeksi CMV dan terapi
  • 27
    Gambar 10. Antigenemia in vitro, PMN yang positif mengandung pp65 dari donor darah sehat setelah dikultur dengan sel endotel vena umbilikalis manusia yang terinfeksi CMV dengan pewarnaan imunofluoresen, menggunakan pool monoklonal antibodi pp65 (Revello,2002)
  • 53. 28
    • Kelebihan Antigenemia assay :
    kecepatan memberikan hasil (beberapa jam)
    • Kerugian :
    • 54. terbatasnya jumlah sampel yang dapat diproses pada tiap pemeriksaan
    • 55. subyektivitas dalam mengamati slide
    • 56. Antigenemia yang positif tidak didapatkan pada orang sehat.
  • 29
    Pemeriksaan penyaring pada ibu hamil (1):
    • Wanita hamil dengan IgG anti-CMV menularkan ke janin melalui plasenta
    • 57. Sebagian besar infeksi CMV (90%) pada wanita hamil  asimptomatis.
    • 58. IgM muncul 1 minggu setelah timbul penyakit,  dipertahankan 200-250 hari
    • 59. Produksi IgM terhadap CMV akan diikuti oleh produksi IgG
    • 60. Ig G muncul 6-8 mgg setelah inf. primer tetap terdeteksi dalam waktu lama
  • 30
    Gambar 10. CMV Serology timeline
  • 61. 31
    Pemeriksaan penyaring pada ibu hamil (2)
    Uji serologis pertama pada kehamilan trimester I  IgG dan IgM
    Jika IgG saja yg positiftidak diperlukan pemeriksaan lebih lanjut infeksi lampau/ laten
    IgM-anti CMV tidak spesifik untuk infeksi primer  karena ditemukan pada infeksi ulangan
    Jika positif keduanya pem. Lanjutan pemeriksaan IgG avidity
  • 62. 32
    Pemeriksaan penyaring pada ibu hamil:
    Peningkatan titer IgG anti-CMV tidak dapat membedakan infeksi primer atau non-primer. Sebagian penderita  titer IgG tinggi pada pemeriksaan pertama
    IgG avidity yang rendahindikator infeksi pada 18-20 minggu sebelumnya  pem. lanjutan (mendeteksi virus atau produk virus dalam darah ibu)
  • 63. 33
    Pemeriksaan penyaring pada ibu hamil:
    • Wanita hamil (risiko tinggi) memerlukan
    pemeriksaan radiologis tambahan untuk
    mengetahui keadaan janin USG dan MRI
    • Pemeriksaan laboratorium lain 
    • 64. menentukan maternal viremia (PCR) dalam darah dan urine PCR kuantitatif
    • 65. isolasi virus dari cairan amnion atau darah janin
  • 34
    Gambar 11. Algoritme Pemeriksaan Serologis Penyaring untuk Diagnosis Infeksi CMV pada kehamilan
  • 66. 35
    Pemeriksaan lab.untuk bayi baru lahir (1):
    • Bayi baru lahir diperiksa pada usia ≤ 2-3 mgg Virus yg terdeteksi menandakan infeksi kongenital
    • 67. Titer IgG-anti CMV bayi lebih tinggi secara bermakna dibandingkan ibumenunjukkan adanya infeksi kongenital aktifprakteknya sulit dibedakan
    • 68. Titer Abyg turun progresif pada pem. serologis usia 2-3 minggu, 3 bulan, 6 bulanmembantu menyingkirkan infeksi kongenital
    • 69. Titer antibodi yg konstan pem. serologis saja tidak dapat membedakan infeksi kongenital & perinatal
  • 36
    Pemeriksaan lab. untuk bayi baru lahir (2)
    Secara teoritis IgM-anti CMV berguna untuk diagnosis infeksi CMV perinatal, tetapi kurang spesifik
    Penentuan IgM-anti CMV pada bayi saat lahir menunjukkan adanya infeksi kongenital
    IgM yang negatif tidak dapat menyingkirkan diagnosis infeksi kongenital
    pp65 antigenemia secara luas digunakan dan berguna secara klinis
  • 70. 37
    Pemeriksaan lab. untuk bayi baru lahir (3)
    • Konfirmasi diagnosis pada bayi barulahirdianjurkan dgn kultur virus dengan sampel urine inkubasi 6 minggu  jarang digunakan
    Kultur virus sebaiknya saat umur bayi < 3 minggu
    Pemeriksaan lain :
    • PCR (sampel darah atau urine) CMV DNA yang positif (dari sampel urine dan cairan serebro spinal)  berhubungan dengan ggn perkembangan anak
    metode NASBA (nucleic acid sequence based amplification)  mendeteksi CMV mRNA marker replikasi virus aktif
  • 71. 38
    Pemeriksaan lab. untuk bayi baru lahir (4)
    Kultur virus yang positif pada bayi usia > 3 minggu  dianggap bayi tertular pada masa perinatal
    Bayi dan anak yang terinfeksi CMV dapat menyebarkan virus selama bertahun-tahun,  hasil kultur urine positif dan sulit diinterpretasikan
    Prosedur diagnostik dan pemilihan spesimen yang dikirim ke laboratorium virologi tergantung pada usia penderita dan gejala yang ada.
  • 72. 39
    RINGKASAN
    • Transmisi infeksi CMV dari ibu ke janin  akibat infeksi CMV primer atau ulangan
    • 73. Berbagai pemeriksaan dikembangkan untuk menegakkan diagnosis infeksi CMV selama kehamilan, antara lain: uji serologis (IgG dan IgM anti-CMV, IgG avidity)
    • 74. Indeks IgG avidity rendah kemungkinan infeksi primer (4 bulan terakhir) perlu dilakukan pem. konfirmasi lanjutan dengan deteksi virus dan produk virus dalam darah.
  • 40
    Ringkasan
    • Keuntungan utama asai antigenemia: kecepatan memberikan hasil (beberapa jam)
    • 75. Kerugian : terbatasnya jumlah sampel yang dapat diproses pada tiap pemeriksaan dan subyektivitas dalam mengamati slide.
    • 76. Bayi dengan infeksi CMV kongenital  dilakukan pemeriksaan lab. sebelum berumur 3 minggu.
    • 77. Diagnosis pasti infeksi kongenital pada bayi dengan kultur virus
  • 41
    TERIMA KASIH
  • 78. 42
    Deteksi Virus &Produk Virus pada Darah Ibu
    • CMV terdapat pada cairan tubuh :
    air liur, urine, dan sekret vagina pada rentang waktu yang berbeda, setelah terjadi infeksi primer
    • Deteksi dan kuantifikasi CMV dalam darah Virus yang terdeteksi pada penderita immunocompetent dapat digunakan untuk diagnosis infeksi primer.
  • 43
    Antigenemia
    The CINAkit allows the indirect immunofluorescence detection of internal matrix phosphoprotein (protein kinase) 65-68 kD (pp65 or pk65) of Human Cytomegalovirus (HCMV) in peripheral blood leukocytes.
    The pp65 detection in peripheral blood leukocytes allows the diagnostic of acute or reactivated infection.
  • 79. 44
    Antigenemia assay
    Advantages:
    The HCMV pp65 antigenemia is a rapid quantitative,
    simple , sensitive, easy to read method for the
    diagnostic of active Cytomegalovirus infections
    • Antigenemia is more sensitive than viral isolation, rapid culture , serology .
    In all cases the sensitivity is 100% in symptomatic patients
    Antigenemia can be detected from several days to one week before the onset of symptoms and from
    2 to 25 days before rapid culture
    positive for a longer period than viremia
  • 80. 45
    Interpretation:
    The HCMV isolation from leukocytes of peripheral blood (viremia) and/or
    pp65 antigenemia are evidence for active systemic infection
    A positive pp65 antigenemia demonstrate a disseminated infection
    that can stay assymptomatic or evolve to a visceral attack
    A single stained cell indicates a positive antigenemia
    The appearing and the severity of clinical signs is correlated with the
    number of positive cells / spot
    Generally these signs are appearing from 50 positives cells / spot of 2 x 105 cells
    Antigenemia positivity level is reciprocaly proportional to patient
    immunocompetency
    Ratios of stained cells observed on positive specimens are the
    following :1/100 to 1/100 000 for polymorphonuclear cells
    1/10 000 to 1/100 000 for monocytes
  • 81. 46
    Gambar 6. Prinsip Pemeriksaan IgM capture ELISA
  • 82. 47
    CMV IgG assay
  • 83. 48
    CMV IgM assay
  • 84. 49
  • 85. 50
    Patogenesis Infeksi Kongenital
    Mekanisme transmisi CMV ke janin memiliki hubungan erat dengan tahapan pembentukan plasenta.
    Pembentukan plasenta :
    diferensiasi epithelial stem cell (cytothrophoblast ) menjadi multinucleated syncytiothrophoblastmembentuk sederet kolom sel yang menginvasi endometrium dan 1/3 miometrium (interstitial invasion)
    Kontak antara syncytiothrophoblast dengan darah ibu terjadi transpor berbagai bahan dari ibu ke janin dan sebaliknya
    Cytothrophoblast juga menginvasi arteriol ibu (endovascular invasion) dengan mengganti sel otot polos dan sel endotel pembuluh darah rahim dengan hybrid sel janin dan sel ibu.
  • 86. 51
    Viral latency
    is defined operationally as the persistence of the viral genome in the absence of production of infectious virions, but with the ability of the viral genome to reactivate
    under specific stimuli.
  • 87. 52
    Kalsifikasi intrakranial
    digunakan untuk meramalkan adanya gangguan audiologi dan kognitif dan menunjukkan prognosis perkembangan saraf yang kurang baik. Pemeriksaan USG digunakan untuk menentukan adanya gambaran hydrops, yaitu halo disekitar kranium janin dan struktur lain yang menunjukkan adanya edema kulit, kalsifikasi intrakranial, hydrocephalus, microcephalus, gangguan jantung, dan hepatosplenomegali.
  • 88. 53
    6.2.1Viremia
    Viremia adalah ditemukannya virus dalam darah. Metode konvensional untuk menentukan dan kuantifikasi viremia memerlukan waktu lama, karena pemeriksaan ini berdasarkan pada adanya cytopathic effect, menentukan 50% kultur jaringan infeksius dan plaque assay.
    Plaque assay menggunakan pengenceran spesimen secara serial, kemudian diinokulasikan pada fibroblast monolayers. Setelah sel terinfeksi, sel dilapisi dengan medium semisolid. Virus yang menyebar pada sel fibroblast, membentuk plaque. (11,12)
    Metode konvensional telah digantikan oleh shell vial assay yang dapat memberikan hasil dalam 24 jam.Shell vial assay menggunakan asumsi bahwa setiap p72- positive fibroblast dalam human fibroblast monolayer, terinfeksi oleh single leucocyte carrying infectious virus.
    Pada pemeriksaan ini, spesimen klinis dipusingkan untuk membentuk monolayer cell, dan setelah inkubasi 24 jam diwarnai dengan tehnik imunofluoresensi atau imunoperoksidase dan menggunakan suatu antibodi monoklonal yang reaktif terhadap CMV major immediate-early protein. Jumlah inti yang positif dihitung (Gambar 4.).(6)
    Pada penderita dengan respons imun yang buruk, adanya CMV viremia umumnya dikaitkan dengan risiko tinggi terjadinya CMV disease. Pemeriksaan ini merupakan parameter yang penting pada awal pemberian terapi antivirus, monitoring terapi, dan mengetahui kegagalan terapi akibat adanya strain CMV tertentu yang resisten terhadap obat. Kerugian pemeriksaan ini adalah rendahnya sensitivitas, dan hilangnya viabilitas CMV pada sampel yang disimpan. (11)
    Pada penelitian yang dilakukan pada 52 penderita immunocompetent, dan di antaranya terdiri dari 40 wanita hamil dengan infeksi primer, didapatkan viremia terdeteksi pada 5 dari 19 (26,3%) penderita selama bulan pertama saja. (6)
  • 89. 54
    Pemeriksaan paling penting untuk evaluasi dugaan infeksi CMV adalah dengan kultur virus. Virus dapat dikultur dari sampel cairan tubuh, yaitu darah, urine, air liur, sekresi servikovaginal, cairan serebrospinal, cairan kumbah lambung atau organ yang lain. dan biopsi jaringan.
  • 90. 55
    Penelitian seroepidemiologi di beberapa negara berkembang
    seroprevalensi CMV
    mendekati 100% pada anak, tetapi morbiditas pada kelompok ini kurang mendapat perhatian.
    Infeksi CMV  penyebab infeksi kongenital yang penting di negara berkembang
    menyebabkan retardasi mental dan gangguan perkembangan janin.
    Infeksi primer pada dewasa sehat  asimptomatis, kecuali pada beberapa kelompok risiko tinggi
  • 91. 56
    Transmisi virus ke janin pada infeksi CMV primer , merangsang respon imun antivirus, sedangkan pada infeksi CMV ulangan, transmisi virus ke janin merangsang respon imun humoral dan seluler. Viremia hanya didapatkan pada infeksi primer dan infeksi ulangan pada penderita immunocompromised. Viremia tidak didapatkan pada infeksi ulangan pada penderita immunocompetent.
  • 92. 57
    Viremia Shell vial asai
    Antibodi monoklonal tunggal tidak dapat mengidentifikasi strain virus yang mengalami mutasi pada epitop tertentu pada major immediate-early protein, identifikasi virus dikerjakan dengan memakai pool monoklonal antibodi yang reaktif terhadap epitop p72 yang berbeda.
    Pemberian terapi gansiklovir pada infeksi CMV primer, kadar antigenemia dapat meningkat sampai 2-3 minggu walaupun efikasi terapi ditunjukkan dengan hilangnya viremia.
  • 93. 58
    Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) is the basis of the NucliSens system of Organon Teknika (now part of bioMerieux) and offers a simple and rapid alternative method for nucleic acid amplification. A description of the technology is available on the web site (http://www.nuclisens.com/). NucliSens represents a synergy of three key technologies – integrating isolation, molecular amplification and detection into an all-in-one system that is targeted at the sensitive and specific determination of nucleic acid sequences.
    NASBA technology is based on simultaneous enzymatic activity of reverse transcriptase, T7 RNA polymerase, and RNase in combination with two oligonucleotides. It depends on selective primer-template recognition to drive a cyclical, exponential amplification of the target sequence. NASBA has the following 1. Unlike RT-PCR, NASBA is able to selectively amplify RNA sequences in a DNA background, since DNA strands are not melted out. There are no false positive signals due to dead bacteria. 2. It can detect human mRNA sequences without the risk of DNA contamination; no intron flanking primers or Dnase approach is needed. This makes screening for gene expression in oncology or genetic diseases simple and easy. 3. RNA amplification enables direct detection of RNA viruses such as HCV and retroviruses such as HIV. 4. RNA targets permit the detection of live bacterial or viral activity following anti-bacterial/viral therapy. 5. With RNA amplification, it is possible to observe the beginning of cancer cell proliferation through qualitative and quantitative determination of gene activity.
  • 94. 59
    NASBA
    Asam nukleat dari 100ml whole blood diisolasi dengan metode Boom et al
    Sistem kontrol RNA (:8000cRNA copies) ditambahkan pada sampel sebelum isolasi asam nukleat, sebagai kontrol positif untuk isolasi, amplifikasi,deteksi.
    Briefly, nucleic acids from 100 ml of whole blood were isolated by the method of
    Boom et al. (8). System control (SC) RNA (;8,000 cRNA copies) was added to
    the samples prior to nucleic acid isolation, thus serving as a positive control for
    isolation, amplification, and detection. The SC RNA included part of the IE1
    mRNA corresponding to nucleotides 171,797 to 172,050 of the CMV (AD169)
    genome (9) and could be distinguished from wild-type (wt) RNA by insertion of
    a fragment of 134 nucleotides, as reported previously (2). wt and SC IE mRNAs
    were amplified with a primer that contained a T7 promoter and a reverse primer.
    Amplification products were detected by electrochemiluminescence with capture
    probes coupled to magnetic beads and wt- and SC-specific ruthenium-labeled
    oligonucleotide detection probes (2).
    analytical sensitivity of the NASBA for detection of IE mRNA was about 70 copies/10 ml of whole blood.
    The same
    containment measures as those used for PCR protocols (28) were adopted for
    the performance of NASBA (the use of three separate rooms as well as the use
    of separate reagents, micropipettes, and aerosol-resistant filter tips). In addition,
    negative controls were included in each test run.
  • 95. 60
    Infeksi Ulangan juga bisa sebabkan inf kongenital
    Hal ini didukung oleh kasus infeksi kongenital yang terjadi pada kehamilan berikutnya. Pada kasus tersebut, anak pertama terinfeksi berat, sedangkan anak kedua terinfeksi subklinis. Hasil analisis fragment length polymorphism menunjukkan adanya virus yang identik pada tiap pasang saudara yang terinfeksi. Penelitian prospektif lain pada 541 bayi dari ibu yang seropositif sebelum kehamilan, didapatkan prevalensi 1,9%, atau 10 janin mengalami infeksi kongenital.
  • 96. 61
    Infeksi ulangan dengan strain virus baru
    Hal ini berdasarkan ditemukannya antibodi terhadap epitop baru glikoprotein H pada CMV yang tidak ditemukan dalam darah sebelum kehamilan. Sequencing gen glikoprotein H memberikan konfirmasi adanya strain virus baru.
  • 97. 62
    Pemeriksaan IgM
    fraksi serum. yang diperoleh dengan sucrose density gradient centrifugation atau kromatgrafi kolom.
    Antigen-antibodi-konjugat enzim ditandai dengan pewarnaan, yaitu dengan penambahan substrat kromogen (TMB). Substrat akan dihidrolisis oleh enzim dan bahan berkromogen akan berubah warna menjadi biru.
  • 98. 63
    IgM capture
    Selain itu dapat terjadi mutual interference dengan antinuclear antibody.
  • 99. 64
    Deteksi dan kuantifikasi DNA CMV pada darah merupakan alat diagnostik utama bagi penerima transplantasi.
  • 100. 65
    PCR menggunakan dua macam kompetitor utama pada kuantitatif kompetitif PCR, yaitu kompetitor homolog yang mengandung delesi kecil atau insersi yang sesuai dengan target sequence, dan kompetitor heterolog yang menggunakan target sequence sebagai target asam nukleat, dengan interfering sequence yang berbeda.
  • 101. 66
    Branched DNA assay berdasarkan pada DNA amplifiers (branched probes) yang mengandung banyak binding site sebagai probe berlabel enzim. Target DNA sequence berikatan dengan molekul branced DNA, dan kompleks yang terbentuk terdeteksi oleh substrat chemiluminescent. Emisi cahaya yang dihasilkan proporsional dengan target DNA yang ada dalam sampel.
  • 102. 67
    Reverse Transcriptase PCR dapat memberikan hasil false positif. Hal ini disebabkan karena kesulitan untuk membedakan produk PCR derivat RNA dan DNA, pada kasus unspliced transcripts.
    Metode NASBA (nucleic acid sequencebased amplification) untuk mendeteksi mRNA, memberikan amplifikasi spesifik pada unspliced RNA dengan background DNA, yang sangat berguna untuk penerima transplantasi pada populasi yang berbeda.
  • 103. 68
    Viremia dapat mendiagnosis infeksi primer pada 25% kasus selama bulan pertama setelah onset infeksi. CMV yang terdeteksi pada darah donor sehat secara hipotesis dapat disebabkan karena fase penyembuhan dari infeksi primer yang asimptomatis.
  • 104. 69
    Penelitian yang dilakukan pada penderita infeksi CMV primer dengan imunitas baik masih belum banyak dilakukan. Penelitian pada 52 penderita dengan imunitas baik, diantaranya terdapat 40 wanita hamil dengan infeksi primer, yang ditunjukkan dari hasil kuantifikasi pp65 antigenemia, viremia, dan leukoDNAemia. Didapatkan pp65 antigenemia terdeteksi pada 12 dari 21, 4 dari 16, dan 0 dari 10 penderita yang diperiksa secara berurutan pada 1,2, dan 3 bulan setelah onset infeksi.
  • 105. 70
    Viremia terdeteksi pada 5 dari 19 (26,3%) penderita selama bulan pertama saja. LeukoDNAemia terdeteksi pada 20 dari 20, 17 dari 19 (89,5%), dan 9 dari 19 (47,3%) penderita yang diperiksa pada bulan 1,2, dan 3 setelah onset. DNAemia yang masih positif setelah 4-6 bulan didapatkan pada 4 dari 15 penderita (26,6%), dan tidak ada hasil yang positif setelah lebih dari 6 bulan. Tidak ada hasil pemeriksaan yang positif diantara 20 penderita dengan infeksi lama ataupun pada 9 penderita dengan infeksi ulangan. Infeksi primer dapat dengan cepat dan secara spesifik terdiagnosis dan marker virologi yang terdeteksi dalam darah, dapat dipakai untuk menentukan onset terjadinya infeksi.
    DNAemia, khususnya leukoDNAemia dapat mendiagnosis infeksi CMV primer pada 100% penderita yang diteliti dalam 1 bulan setelah onset infeksi dan 98% pada 2 bulan setelah onset infeksi. Viral DNA yang didapatkan pada lekosit orang sehat masih kontroversial. DNA virus didapatkan pada semua sukarelawan dewasa sehat yang seropositif saat dilakukan pemeriksaan monosit dan lekosit pada darah tepi. Sebagian peneliti lain gagal mendeteksi DNA virus dengan PCR pada monosit atau lekosit darah tepi, dan didapatkan hasil positif sebesar 4-6%.
    DNA virus tidak terdeteksi pada lekosit darah tepi pada orang dengan imunitas baik dengan seropositif CMV, menunjukkan bahwa pemeriksaan DNA virus dalam darah merupakan parameter yang dapat digunakan untuk diagnosis infeksi CMV primer.
  • 106. 71
    Pemeriksaan aviditas IgG menggunakan suatu chaotropic agent yang mengganggu ikatan hidrogen untuk membedakan antibodi dengan aviditas rendah dan tinggi. Urea menyebabkan terlepasnya ikatan IgG aviditas rendah terhadap antigen imobil, sedangkan ikatan IgG aviditas tinggi tidak lepas.
  • 107. 72
    CMV dapat menyebabkan infeksi laten pada monosit CD14+, yang dapat mengalami reaktivasi akibat stimulasi allogeneic oleh monosit donor.
  • 108. 73
    Dengan menggunakan teknis molekuler pada tetesan darah kering yang diperoleh saat persalinan, pemeriksaan CMV dapat secara mudah digabungkan dengan program skrining gangguan genetik dan metabolisme.
  • 109. 74
    Pada pembentukan plasenta terjadi diferensiasi epithelial stem cell, yang disebut cytothrophoblast pada floating villi, yaitu tempat terjadinya fusi menjadi multinucleate syncytiothrophoblast yang melapisi permukaan villous. Cytothrophoblast juga berdiferensiasi pada anchoring villi, yaitu tempat terbentuknya sederetan kolom sel yang menginvasi endometrium (interstitial invasion) dan sepertiga bagian miometrium. Saat terjadi kontak antara syncytiothrophoblast dengan darah ibu, maka terjadi transpor berbagai bahan dari ibu ke janin dan sebaliknya, kolom cytothrophoblast juga menginvasi arteriol ibu (endovascular invasion) dengan mengganti sel otot polos dan sel endotel dalam pembuluh darah rahim dengan hybrid sel janin dan sel ibu.
  • 110. 75
    Genome
    Untaian asam amino CMV 150K matrix phosphoprotein (pp150) terdiri dari 1048 residu asam aino, yang terbagi menjadi 95 overlapping 20 peptida asam amino yang disintesis pada polyethylene rods
    The entire amino acid sequence of human cytomegalovirus (CMV) 150K matrix phosphoprotein (pp150), consisting of 1048 amino acid residues, was divided into 95 overlapping 20 amino acid peptides which were synthesized on.
  • 111. 76
  • 112. 77
    Antigenemia
    Protein CMV, yang dianggap sebagai major immediate-early protein p72 ditransfer ke PMN dari infected permissive cells melalui transitory microfusion events antara dua adhering cells.
  • 113. 78
    RNAemia
    Monitoring CMV pp67 mRNA (late viral transcript) dengan NASBA (nucleic acid sequencebased amplification) merupakan pemeriksaan yang menjanjikan untuk penerima transplantasi organ yang mengalami reaktivasi infeksi CMV. Pemeriksaan dilakukan pada pada awal dan akhir terapi. Virus dan produk virus yang terdeteksi dalam darah penderita immunocompetent dapat digunakan sebagai alat diagnosis adanya infeksi primer.
  • 114. 79
    Neutralizing antibody assay
    Pemeriksaan neutralizing antibody merupakan parameter tambahan yang penting untuk identifikasi dan menentukan saat terjadinya infeksi CMV primer dengan sampel serum tunggal. Respons neutralizing antibody tidak terdeteksi selama 15 minggu (antara 14-17 minggu) setelah onset infeksi primer. Tidak adanya neutralizing antibody selama masa penyembuhan infeksi primer CMV merupakan petanda yang dapat dipercaya adanya infeksi primer, sedangkan adanya neutralizing antibody dapat menyingkirkan adanya infeksi primer pada 15 minggu sebelumnya. Neutralizing antibody merupakan parameter yang meningkat paling akhir setelah terjadi infeksi primer. (6)

×