Your SlideShare is downloading. ×
0
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Jin3
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
724
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Journal Reading Divisi Penyakit Infeksi
    Evaluation of the LightCycler® SeptiFast test in the
    rapid etiologic diagnostic of
    infectious endocarditis
    J.P. Casalta. F. Gouriet. V. Roux. F. Thuny. G. Habib. D. Raoult
    Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2009) 28:569-573
    Ime. F. A/ JusakNugraha
    Senin, 25Oktober 2010
    1
  • 2. PENDAHULUAN
    KULTUR DARAH
    Gold standard
    Deteksi bakteremia
    dan fungemia
    Keterbatasa:
    - Positif palsu
    • Negatif palsu
    2
  • 3. PENDAHULUANINFEKSI ENDOKARDITIS (IE)
    3
    3
    Bakteremia
    Diagnosis: kultur darah
    Kultur darah gagal mengisolasi
    2,5 – 31 % kasus
    3
  • 4. Penggunaan antibiotika sebelumnya, kuman
    patogen intraselular, kuman fastidious yang tidak
    terdeteksi dengan kultur standar kultur
    negatif
    PENDAHULUAN
    Perlu metode diagnostik laboratorium alternatif,
    termasuk pemeriksaan patologi sampel katup
    jantung, Immunochemistry, serologi, molekuler
    4
  • 5. PENDAHULUAN
    Teknik molekular komersial
    baru untuk mendeteksi
    bakteremia
    SeptiFast
    (Roche Diagnostik)
    Deteksi, identifikasi bakteri,
    jamur yg sering sebabkan
    infeksi dalam aliran
    darah selama 6 jam
    5
  • 6. 6
  • 7. 7
  • 8. 8
  • 9. Tujuan penelitian
    Membandingkan hasil uji real-time PCR
    dengan kultur darah standar untuk mendeteksi
    bakteri dan jamur dalam darah pasien dgn IE
    9
  • 10. BAHAN DAN METODE
    PERIODE
    POPULASI
    TEMPAT
    1 oktober 2005 -
    30 oktober 2006
    63 pasien dengan
    diagnosis IE
    dites sesuai prosedur
    (informed consent)
    Penelitiandilakukan
    DiRS Universitas
    Marseilles
    10
  • 11. BAHAN DAN METODE
    Protokol terdiri dari 3 unit spesimen :
    Unit pertama:
    - 2 botol kultur darah (aerob, anaerob) (Bactec, BD)
    - 1 tabung (serum) untuk mendeteksi faktor rheumatoid
    (RF Rapitex, Dade Behring), penentuan antibodi spesifik
    Coxiellaburnetii, Bartonellaspp, Brucella spp.,
    Chlamydia spp., Mycoplasmapneumoniae,
    Legionellapneumophila,Aspergillusspp.,
    - 1 tabung (darah EDTA) untuk pemeriksaan
    real- time PCR (SeptiFast test)
    11
  • 12. BAHAN DAN METODE
    - Unit kedua dan ketiga: masing-masing tdd 2 botol kultur
    darah digunakan berturut turut pada jam ke 2 dan ke 4
    setelah tabung pertama
    Spesimen: 1.5 mL darah EDTA (real-time PCR)
    Dilisiskan dengan SeptiFast Lys.
    DNA diekstraksi dengan SeptiFast Prep
    Digunakan hybridization probe
    12
    Internal Control (IC) dilakukan pd masing-masing
    sampel.
  • 13. BAHAN DAN METODE
    InternalTranscribedSpacer (ITS): target spesifik
    untukmendeteksipatogenbakteridanjamur.
    Kontrol positif: Reagen kontrol.
    Kontrol negatif disediakan oleh produsen dalam
    setiap seri ekstraksi.
    Fluoresensidiukur pada panjang gelombang
    610, 640, 670, dan 705 nm.
    13
  • 14. BAHAN DAN METODE
    BAHAN DAN METODE
    Identifikasi spesies dan pelaporan digunakan
    SeptiFast Identification Software (SIS)..
    Perhitunganstatistikdenganmenggunakan
    softwareEpi Info
    Proporsidibandingkandenganmenggunakan
    Yates’ corrected Chi-square testatau
    Fisher’s exact test
    14
  • 15. HASIL
    15
  • 16. hasil........
    52
    (IE jantung kiri)
    63 pasien
    11
    (pace maker)
    39
    (IE jantung)
    Kultur darah
    41
    2
    (pacemaker)
    16
  • 17. 17
  • 18. hasil........
    19
    Positif pada saat masuk
    Kultur darah
    41
    22
    Negatif saat
    masuk RS
    Positif sebelum
    Masuk RS
    18
  • 19. hasil........
    hasil........
    SeptiFast
    41
    11 Positif
    pada saat masuk
    8 Positif,
    pada pasien dengan kultur darah positif saat masuk
    3 Positif,
    pada pasien dengan kultur darah positif sebelum masuk
    (11/41 dibanding 19/41, P=0.1)
    19
  • 20. 20
  • 21. hasil........
    Diantara19 pasiendengan kultur
    darahnyapositif, ujiSeptiFast mempunyaisensitivitas yang rendah,hanya 8
    yang terdeksi (42,1%) (Tabel 3)
    Di antara 22pasiendgnkulturdarahnegatifsaat masuk rumahsakit, ujiSeptiFastmendeteksi3 bakteri (S. gallolyticus, S. aureus, danEnterococcusfaecalis).
    21
  • 22. hasil..........
    22
  • 23. DISKUSI
    23
  • 24. 24
  • 25. Diskusi...........
    Teknik-teknikbarumolekulermunculuntukmendeteksibakteridalamdarah .
    Amplifikasi gen 16S ribosomal DNAdigunakanuntukmendeteksibakteri
    25
  • 26. Diskusi.......
    Wilayah yang ditargetkandenganujiSeptiFastterletakantaraurutan 16S dan 23S rDNAbakteridanantaraurutan18S dan 5.8S rDNAjamur (ITS).
    Tahun 2002, Rothman et al.uji pada 51 penderita demam, penggunanarkobasuntikan. Hasilpenelitianmenunjukkanbahwa, dibandingkandengan kulturdarah, PCR yang menggunakan universal 16S rRNA primers mempunyaisensitivitasdanspesifisitas secara berturut-turut 86,7% dan 86,9%.
    26
  • 27. Diskusi.......
    Sensitivitas yang lebihtinggidiperoleh jika dibandingkandengan gen-gen single-copy, karenabeberaparibosomal operons paling sering ditemukan dalamgenomesbakteridanjamur.
    Spesifisitas yang lebihtinggidiperoleh jika dibandingkandenganrRNA,karena ITS lebihspecies-specific.
    27
  • 28. Diskusi
    SensitivitasanalitikdariSeptiFastdiuji dengan menggunakanbakteriyang diencerkan 100, 30, dan 3 CFU / ml dalamdarah EDTA.
    Sensitivitas minimal dari 30 CFU / mLdiperolehpadasemuaspesieskecualiStaphylococcus epidermidis, Staphylococcushaemolyticus Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, dan Candida glabrata (100 CFU / mL).
    28
  • 29. Diskusi
    SensitivitasujiSeptiFastkurang baikjika dibandingkandengankulturdarah.
    UjiSeptiFastdirancanguntukmendeteksidanmengidentifikasi 25 spesiesbakteridanjamurpenyebab bakteremia
    29
  • 30. Diskusi
    UjiSeptiFast tidak dapat mendeteksibakterifastidious groupHACEK (Haemophilusspp, Actinobacillusactinomycetemcomitans, Capnocytophaga spp., Cardiobacteriumhominis, Eikenellacorrodens, Kingellakingae) yang dianggapsebagaiagenetiologi prevalensi IE.
    30
  • 31. Diskusi
    Bakteremiaterkaitdengan IE biasanya kontinu, jumlahnya sedikit,cutoffSeptiFast dibuat agak tinggi terutama untuk streptokokusdan staphylococcus koagulase-negatifuntukmenghindarifalse positif karena kontaminasiflora normal kulitnilai cutoff inimungkintelahmenghambatdeteksinya
    31
  • 32. Diskusi
    Interpretasihasil PCR komplekskarenaDNA yang dideteksi bukan dari patogenhidup,risiko terkontaminasi, adanya DNAbackgrounddalamdarah.
    UjiSeptiFastbaikuntukS. aureus, Streptococcus, danenterococci, burukuntuk Staphylococcus koagulase-negatif (0/15 dibanding 3/15 pada infeksipace makers, P= 0.2) danorganismeatipikallainnya (0/6 dibandingkan 4/6, P=0.03).
    32
  • 33. Diskusi
    Tiga Staphylococci koagulase-negatifdantigaenterobacteriaditemukandengan kultur danbukan denganujiSeptiFast.
    IE yang sebelumnyadiobatidenganantibiotik, dengan kulturdarahnyanegatifpadasaat masuk RS, uji SeptiFast memberikanetiologidalam tiga kasus.
    33
  • 34. Diskusi
    Streptococci danenterococcicepathilangdaridarahpasien IE yang diobati kulur darah negatif
    hanya dapat diidentifikasidgn analisismolekular dari penggantian katup jantung
    • Uji SeptiFastmembantu mengidentifikasi patogen penyebab (dalam 2 dari 12 kasusendokarditispada kultur darahnegatif yang disebabkanolehStreptococciatauenterococci)
    34
  • 35. simpulan
    Kultur darahadalahkuncidiagnostik IE, tetapimemilikibeberapaketerbatasan:hasilnegatifakibatpengobatanantibiotik.
    Dalampenelitianini, uji SeptiFast mendeteksi bateri pada 3 pasien IE yang telah diobatidenganantibiotik,dengankultur darahnegatifpadasaat masukRS.
    UjiSeptiFast PCR adalahteknikkomersialbaruuntukmendeteksibakteremia yang dapatbergunadalam IE yang telah diobatidenganantibiotiksebelummasuk.
    35
  • 36. Thank You !
    Thank You !
    36
  • 37. Prinsip dasar PCR: pelipatgandaan segmen DNA target (template) dalam tabung reaksi dengan bantuan enzim DNA Polimerase
    Pelipatgandaan DNA in vitro dilakukan dengan menambahkan primer – sepotong DNA pendek yang berpasangan dengan DNA target pada kedua ujung target dan kemudian memperpanjang rantai seukuran dengan DNA target, secara berulang, dengan bantuan DNA polimerase.
    37
  • 38. Metode PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target
    Metode PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifisitas yang tinggi.
    Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985
    38
  • 39. Di dalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi
    39
  • 40. TAHAPAN PROSES PCR
    PRE-PCR :
    - preparasi reagensia
    - preparasi spesimen: isolasi/purifikasi DNA/RNA
    PCR : proses amplifikasi:
    - denaturasi (pemisahan rantai DNA)
    - annealing (penempelan primer)
    - extension (pemanjangan oleh enzim)
    POST-PCR:
    - deteksi/ analisa hasil PCR
    40
  • 41. PRE-PCRPreparasi spesimen:Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
    Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/ RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekuler biologi
    Ekstraksi DNA/RNA dai organisme eukariotik manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses:
    - penghancuran dinding sel
    - penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel
    - pengendapan DNA/RNA
    - pemanenan
    41
  • 42. PROSES PCR: Aplifikasi
    Denaturasi oleh panas
    Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung sekuen target
    Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai Komplemen Nukleotida
    Akhir siklus PCR ke-1 hasil 2 tiruan dari sekuen target
    Target amplifikasi: siklus PCR diulang
    42
  • 43. PROSES REVERSE TRANSKRIPTASE-PCR (RT-PCR)
    Master Mix + Target RNA
    Primer berlabel biotin menempel pada sekuen target RNA
    rTth DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer dengan nukleotida komplemennya
    Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA) terhadap sekuen target
    43
  • 44. PCR step 1 – denaturasi oleh panas
    PCR step 2 – penempelan primer pada cDNA
    PCR step 3 – rTth DNA Polymerase mengkalisa pemanjangan primer
    Akhir siklus ke- 1 PCR: hasil tiruan untai ganda DNA (amplikon) dari sekuen target
    44
  • 45. Deteksi/ analisa hasil PCR
    Elektroforesis gel agarosa (horizontal)
    Elektroforesis gel poliakrilamid (vertikal)
    Enzym labelling oligonucleotide
    Biotin-labelled oligonucleotide
    Digoxigenin-labelled oligonucleotide
    Selanjutnya RFLP, Sequencing dll.
    45
  • 46. Real-Time PCR
    Real-time PCR berarti amplifikasi dan analisa terjadi bersamaan
    Dikenal sebagai ‘Rapid Cycle PCR’ dengan siklus temperaturantara 20-60 detik
    Produk PCR dpt dianalisa selama proses amplifikasi
    Menggunakan pewarna DNA dan Probe fluoresensi
    Data dikoleksi dari tabung yang sama di dalam instrumen yang sama
    Tidak ada transfer sampel, penambahan reagensia atau gel separasi
    46
  • 47. Real-Time PCR
    Format deteksi:
    - SYBR Green I
    - Hybridization Probe (HybProbe Probes)
    - Hydrolisis probes/ Taqman Probes
    - SimpleProbe Probes
    Dapat melakukan real time quantitative PCR
    Real time PCR adalah metode yang powerful. Sederhana, dan cepat
    47
  • 48. Reaksi PCR berlangsung sangat cepat dengan bantuan alat DNA Thermal Cycler dan ditemukannya enzim tahan panas Taq DNA Polimerase oleh Dr. Gelfand tahun 1988.
    Proses reaksi PCR perlu kelengkapan komponen-komponen dasar, yaitu enzim DNA target, primer, monomer DNA (dNTPs), dan bufer reaksi.
    Segmen spesifik DNA hasil amplifikasi dapat dilihat langsung melalui reaksi gabungan PCR-Elisa yang menghasilkan spektrum warna tertentu. Pendeteksian Elisa sekarang banyak dikembangkan.
    48
  • 49. FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
    Senyawa fluorescent menyerap cahaya pd panjang gelombang tertentu (absorbance spectrum)
    Cahaya yang diserap diemisikan (fluorescence spectrum)
    Sumber cahaya putih melalui filter untuk memilih warna spesifik yang mengoptimasi absorpsi fluorescent (excitation filter)
    Warna spesifik pada spektrum fluorescen dibaca dengan detektor
    49
  • 50. Format deteksi Real-time PCR dengan pewarnaan Fluoresensi
    Format SYBR Green I
    • ketika SYBR Green I berikatan dgn primer dsDNA, akan terjadi peningkatan fluoresensi
    • 51. selama tahapan PCR yg berbeda, intensitas dari sinyal fluorsensi akan berbeda, tergantung dari jumlah dsDNA yg ada
    Format hybridization probe/hybprobe
    • hybridization probe merubah fluoresensi pada saat hibridisasidengan “fluoresence resonance energy transfer (FRET)”
    • 52. 2 probe oligonukleotidasekuenspesifikdilabeldenganpewarna yang berbeda (donor & aseptor) danditambahkankedalam ‘master mix’
    • 53. DalamanalisaHybProbeadanyaprodukamplifikasispesifikdapatdibacasecarakuantitatifberdasarkanpeningkatanfluoresensi
    50
  • 54. Format deteksi Real-time PCR dengan pewarnaan Fluoresensi
    Format Hybridization Probe / HybProbe
    • Spesifikkarena 2 probe dihbridisasidengan target dengancara yang sangatsekuenspesifik
    • 55. Primer-dimertidakterdeteksikarena probe sekuenspesifiktidakmengenalinya
    • 56. Dapatuntukaplikasideteksimutasi, analisis SNP, genotyping SNP, qPCRdan multiplex tes.
    51
  • 57. Format deteksi Real-time PCR dengan pewarnaan Fluoresensi
    Format Hydrolysis Probes
    • Dikenaljugadengannama ‘Taqman Probe’
    • 58. Menggunakanaktivitasexonuclease 5’ dari DNA polymerase
    • 59. Sebuah probe terdiridari 2 label, fluorecence reporter danfluorecence quencher, yang sangatdekatsatusama lain. Ketika probe masihutuh, quencher menahansinyalfluoresensi reporter
    • 60. Padaproses PCR, aktivitasexonuclease 5’ dari DNA polmemotonghidrolisis probe, danmemisahkan reporter & quencher
    • 61. Sinyalfluoresensi reporter tidaklagitertahandandapatmemancarkansinyalfluoresensi
    • 62. Peningkatansinyalfluoresensidari reporter berbandinglangsungdenganakumulasiproduk PCR.
    52
  • 63. Format deteksi Real-time PCR dengan pewarnaan Fluoresensi
    Format Simple Probes
    • Simple Probe adalahbentuksederhanadarihibridization probe danhanyamenggunakan 1 probe saja
    • 64. Ketikaterjadihibridisasi, akanmemancarkansinyalfluoresensi yang lebihbesar
    • 65. Perubahansinyalfluoresensitergantungdari status hibridisasidari probe. Semakinstabilhibridisasinya, semakintinggitemperatur melting
    • 66. Untukaplikasi SNP genotyping dandeteksimutasi
    53

×