La práctica describe el uso de la electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN o ARN basándose en su tamaño. Se explican los materiales, métodos y protocolo para preparar un gel de agarosa al 1% y realizar la electroforesis. Los resultados muestran la formación del gel y la separación de moléculas a través de la formación de bandas, aunque estas no pudieron observarse sin luz UV. La conclusión es que la electroforesis permite determinar el tamaño de los fragmentos obtenidos por PCR.

1. PRACTICA DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
Fecha de entrega: 14/01/2011
Bustos Claudia, Cango Andrea, Chalán Lucía, Espinoza Sofía, Vargas Vanessa.
Tema:
Introducción:
La electroforesis en gel es un grupo de
técnicas empleadas para separar
moléculas basándose en propiedades
como el tamaño, la forma o el punto
isoeléctrico La separación puede
realizarse sobre la superficie hidratada
de un soporte sólido, o bien a través de
una matriz porosa, o bien en disolución.
Dependiendo de la técnica que se use, la
separación obedece en distinta medida a
la carga eléctrica de las moléculas y a su
masa.
La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos
nucleícos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Al
poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir
pasando por la malla del gel, por lo que las pequeñas se moverán mejor y más rápido.
Objetivos:
Evaluar la talla del producto PCR mediante la utilización de electroforesis en gel.
Separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos mediante la
técnica de la electroforesis en gel.
Materiales y métodos:
 El marcador de peso molecular usado es de 100 pb de marca invitrogen:
 Para el reactivo de tinción usamos Gel Red.
Adicional para prepararlo tenemos que tomar 5 ml del buffer SB 20X, 10 ml colorante
Gel Red y 85 ml de Agua; esto para un volumen de 100ml.
 Para preparar el buffer SB 20X usamos: 8 g. de NAOH, 47g. de ácido bórico y
aforamos a 900 ml agua; medimos el pH entre 8.0 y 8.2-8.3 y luego aforamos a
1000ml.
PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA
PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN GEL AL 1% (250 mL)
1. Materiales -Botella de vidrio con más de dos veces
-Pipetas de 2-20uL y de 20-200uL el volumen de la solución de agarosa a
-Cámara de electroforesis horizontal preparar.
-Peines para las bandejas -Guantes de látex
-Bandeja para la preparación del gel -Guantes para calor
-Fuente de poder
-Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL

2. 2. Reactivos
-Syber safe o Bromuro de etidio -TBE 10X
-Agarosa grado molecular -Agua Destilada 3
3. Preparación de soluciones:
A) Preparación de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para diferentes
volúmenes
Volumen del gel (mL)
40 120 250
% Gel Agarosa TBE 10X Agarosa TBE 10X Agarosa TBE 10X
(g) (mL) (g) (mL) (g) (mL)
2 0,80 2 2,4 6 5 12,5
1,5 0,60 2 1,8 6 3,75 12,5
0,8 0,32 2 0,96 6 2 12,5
B) Preparación de un litro de TBE 10X
Reactivo Cantidades
Tris Base 108g
Acido Bórico 55g
EDTA 0.5M 40mL
4. Protocolo de preparación de un gel de agarosa al 1%
1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende
del modelo de cámara utilizado) y póngale los peines.
2. Pese 2,5 gr. de agarosa.
3. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL
de buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el baño de María
hasta su completa disolución.
4. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura
soportable por la mano, agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución
madre 10 mg. mL-1) o 25 uL de SYBR Green *1 (dilución final de la
solución comercial es 1 en 10.000).
5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular,
evitando que se formen burbujas en la solución.
6. Sirva la solución en la bandeja
de corrida vertiendo la solución
lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las
burbujas que queden sobre el área de corrida de las muestras con
una punta limpia.
7. Deje polimerizar la agarosa
8. Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con
buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel.
9. Conecte los electrodos

3. Resultados:
Observamos como el gel se vino a hacer de una consistencia gelatinosa y
burbujas en cada uno de los contenedores al inyectarles corriente a nuestros
pocillos con la fuente de poder y medimos el tamaño de los fragmentos de PCR
obtenidos inicialmente.
También mediante está técnica hubo separación de moléculas, y formación de
bandas las cuales no las pudimos observar por no disponer de luz uv. Ya que al
igual que en la práctica virtual hubiéramos podido medir con exactitud y ver si
existía alguna anomalía en nuestros fragmentos de PCR, basándonos en el
tamaño y secuencia de los mismos.
Conclusiones:
Los fragmentos obtenidos por PCR se pueden cargar en un gel de agarosa separados
por electroforesis.
Este análisis permite: Determinar el tamaño exacto del fragmento.
La electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende de
distintos parámetros. Basándose en la ley de Ohm se tiene que
Bibliografía:
 http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis
 Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José Javier Higuera,
Vicente Mariscal, Emilio Fernández Reyes. Comprobación de colonias
transformantes mediante PCR y electroforesis. Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,
14071-Córdoba. http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/41%20COMPROBACI%C3%93N%20COLONIAS%20TRANSFORMANTES
%20PCR.pdf
 Reacción en cadena de la polimerasa (la PCR) “Evaluación del Producto”Jean-
Pierre HERVEG*, Maritza BARCIA-MACAY et Bernard LETHE* Universidad Facultad
Biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006.
http://genemol.org/biomolespa/PCR/PCR.html
 http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/biol2013/electroforesisDNA.htm
 Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores
Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.
www.ivic.gob.ve/.../Electroforesis%20del%20ADN%20en%20geles%20de%20agarosa
.pdf