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Determinacion de biomasa_microbiana

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  • 1. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA 1
  • 2. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA I. INTRODUCCIÓN Biomasa es un termino general que se refiere a los M’os presentes en un sistema. Cantidad células personas masa de seres vivos 2
  • 3. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA I. INTRODUCCIÓN La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. 3
  • 4. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA I. INTRODUCCIÓN Es una variable clave para establecer: Consumo de nutrientes Calculo de balance de masas de cualquier proceso biológico. Tasas de producción 4
  • 5. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA I. INTRODUCCIÓN • Existen 2 métodos principales de estudiar poblaciones microbianas en la naturaleza: MÉTODO DIRECTO MÉTODO INDIRECTO 5
  • 6. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Observación de los organismos En el microscopio óptico Conteo del número de M’os A. MÉTODO DIRECTO 6
  • 7. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Requiere de preparaciones puras sin ningún tipo de partículas que puedan interferir en los resultados y:  Se refiere básicamente a la medida de la masa celular. A. MÉTODO DIRECTO 7
  • 8. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA A. MÉTODO DIRECTO 8
  • 9. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse:  En términos de peso seco por unidad de volumen. PESO SECO 9
  • 10. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA PESO SECO Los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado. DESVENTAJAS Se puede determinar M’os activos y no, material inerte, materia orgánica y polímeros extracelulares. 10
  • 11. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. PESO HÚMEDO 11
  • 12. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA PESO HÚMEDO Técnica útil para grandes volúmenes de muestra El diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. 12
  • 13. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA MÉTODOS INDIRECTOS Actividad metabólica Consumo de un nutriente característico Métodos turbidimétricos Espectrofotométricos Nefelométricos Determinación nitrógeno total B. MÉTODOS INDIRECTOS 13
  • 14. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA B. MÉTODOS INDIRECTOS Medidas de turbidez Los métodos turbidimétricos de análisis tienen como fundamento: La formación de partículas de pequeño tamaño que causan la dispersión de la luz cuando una fuente de radiación incide sobre dichas partículas. 14
  • 15. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA El grado de dispersión de la luz (o turbidez de la solución) es proporcional al número de partículas que se encuentran a su paso, lo cual depende de la cantidad de analito presente en la muestra. B. MÉTODOS INDIRECTOS Medidas de turbidez 15
  • 16. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. B. MÉTODOS INDIRECTOS Escala de Mc Farland 16
  • 17. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Se basa en la capacidad de: 1% de Cl2Ba Cantidades crecientes de SO4H2 al 1% Precipitado de BaSO4 B. MÉTODOS INDIRECTOS Escala de Mc Farland 17
  • 18. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Su utilidad es la de poder elaborar suspensiones bacterianas, Ajustadas a un patrón y valorar su concentración B. MÉTODOS INDIRECTOS Escala de Mc Farland 18
  • 19. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y,  Estado de agregación (sólido, líquido, gas). B. MÉTODOS INDIRECTOS Espectrofotometría 19
  • 20. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Las principales ventajas de la espectrofotometría son:  Sensibilidad relativa elevada.  Facilidad para realizar mediciones rápidas.  Grado de especificidad relativamente elevado. B. MÉTODOS INDIRECTOS Espectrofotometría 20
  • 21. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado espectrofotómetro. B. MÉTODOS INDIRECTOS Espectrofotometría 21
  • 22. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA • El espectrofotómetro, mide la absorbancia, A, que se define por: T= transmitancia D.O. = A = -logT/100 Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia. B. MÉTODOS INDIRECTOS Espectrofotometría 22
  • 23. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA II. OBJETIVOS • Lograr determinar la biomasa Microbiana, a través de diversos métodos. 23
  • 24. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Métodos directos: determinación del peso húmedo y peso seco  Materiales: Levadura de panificación “Fleishmann” Agua destilada Pipetas de 5ml Tubos de ensayo Balanza analítica Centrifuga Estufa 24
  • 25. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Métodos directos: determinación del peso húmedo y peso seco 25
  • 26. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Peso Seco:  Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y colocar en 3 tubos de ensayos previamente pesados.  Luego llevar los tubos a la centrifuga y hacerlo girar a 4 000 rpm, por un tiempo de 10 minutos.  Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica y anotar los pesos.  Posteriormente, llevar los tubos a estufa, a una Tº de 105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas.  Pasado el tiempo anotar, los pesos y luego obtener un promedio. (Anexo 1). 26
  • 27. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS  Por ultimo expresar los datos en la siguiente formula. Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla 27
  • 28. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Peso Húmedo:  Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y colocar en 3 tubos de ensayos previamente pesados.  Llevar los tubos a la centrifuga, donde se hacen girar a 4 000 r.p.m., por un tiempo de 10 minutos.  Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica, anotamos los pesos y luego promediar (Anexo 1). 28
  • 29. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS  Por ultimo expresar los datos en la siguiente formula. Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla 29
  • 30. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Figura 01: Metodología de peso seco y húmedo Fuente: Google Imágenes 30
  • 31. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Métodos indirectos: determinación de turbidez a través de la Escala de McFarland y espectrofotometría  Materiales: cepa de E. coli Agar Nutritivo Solución Salina 0.85% BaCl2 1% H2SO4 1% Agua destilada estéril Tubos de ensayo Pipetas Espectrofotómetro 31
  • 32. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Métodos indirectos: determinación de turbidez a través de la Escala de McFarland y espectrofotometría 32
  • 33. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Nefelométria de McFarland:  Agregar los reactivos a los tubos rotulados de manera apropiada (1 a 10) en las cantidades que se indican a continuación: Estándares de sulfato de bario Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1%(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 H2SO4 1%(ml) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 Densidad aprox. De células (x108/ml 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
  • 34. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS  Sellar los tubos y rotular. El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células homogéneas de Escherichia coli por mililitro.  Luego, se toma una alícuota de la muestra de bacterias.  Se inocula en un tubo contenido de solución salina fisiológica (0,85%) y se procede a comparar el tubo con los de la escala estándar y obtener los resultados de la densidad. 34
  • 35. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Figura 02: Escala de Mc Farland Fuente: Google Imágenes 35
  • 36. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS • Espectrofotometría:  En el espectrofotómetro establecer la absorbancia a 546 nm de longitud de onda, de cada uno de los tubos de la escala de MacFarland.  Con estos datos, teniendo en cuenta las concentraciones celulares correspondientes a cada tubo y mediante el uso de un papel milimetrado semilogarítmico establezca una curva patrón de número de bacterias con relación a la absorbancia. 36
  • 37. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS  Prepare diluciones seriadas de la muestra biológica en SSF. Para ello, utilice los tubos de 15x125mm y las pipetas estériles. Realice las siguientes diluciones: 10-1, 10-2,10-3,10-4,y 10-5.  Establezca la absorbancia de las diluciones y a través de la curva patrón determine el número de bacterias presentes en cada dilución y teniendo en cuenta el factor de dilución del tubo trabajado, establezca el número de bacterias por mililitro.  Promediando estos datos, determine el número de bacterias presente en la muestra. 37
  • 38. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Figura 03: Espectrofótometro Fuente: Google Imágenes 38
  • 39. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA III. MATERIALES Y MÉTODOS  Adicional a esto realice una siembra incorporación de las muestras en una placa con agar nutritivo, incubarlas a 37ºC por horas; realice un recuento y compare si los resultados obtenidos concuerdan con lo esperado. 39
  • 40. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Figura 04: siembra por incorporación Fuente: propia 40
  • 41. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA BIBLIOGRAFÍA • RICE, C.W., MOORMAN, T.B. & BEARE, M. (1996) Role of Microbial biomass C and N in soil quality. (pág. 203-216) • VAN GESTEL, M., LADD, J.N. & AMATO, M. (1991), Carbon and Nitrogen mineralization from two soils of contrasting texture and micro aggregate stability: influence of sequential fumigation, drying and storage. • SMITH, J.L.; D PAUL, E.A. (1990), The significance of soil microbial biomass estimations. In: Soil Biochemistry. Bollag, J.M. and Stosky G. (eds). Dekker. New York. (Vol. 6, pág. 357-396.) • BEDING, GD; TURNER, MK; RAYUS, F; MARX, AZAM, F; FAROOQ, S; LADHI, A. (2003). Microbial biomass in Agricultural soils – determination, synthesis dynamics and role in plant nutrition. Pakistan Journal of Biological Sciences 6(pág. 629- 639). • AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prácticas: Laboratorio de Microbiología Celular, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnología, 1era Edición, Pág. 63-68. • ARNÁIZ,C., ISAC,L. LEBRATO, J. (2000). Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Sevilla-España. • GARCÍA HOLOLAVSKY, REGINA (2001) Manual de prácticas de Laboratorio de Ingeniería Sanitaria. Universidad Autónoma de Chihuahua. • GIL, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribución de abonos. Escuela superior de agricultura de Barcelona. • MADIGAN M. et al (1998). Brock Biología de los microorganismos Octava Edición, Prentice Hall, España, P. 155 – 156. • RODRÍGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNÁNDEZ, F. GARCÍA, J. (2005). Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. • SILVA, C., GARCÍA, J. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Editorial MAD, S.L. Sevilla. • TORO R. (2005), Manual de Introducción al Laboratorio De Microbiología, editorial universidad de caldas, 2005. • UNAM, (1986); “Biología Celular”, Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad autóctona de México. Pág. 20 – 28. • VALENCIA, H. (2001). Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Universidad Nacional de Colombia. 2001. • Granda Elena. (2008), Manual de Prácticas: Tema 7: Escala McFarland, Pontificia Universidad Católica Del Ecuador- Escuela De Bioanalisis-Carrera De Microbiología 41
  • 42. UNJBG FACULTAD DE CIENCIAS E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA ECOLOGÍA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA Gracias por su atención 42