Cancer

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Espero que este artigo. possa ajudar aos estudantes da área da saúde.

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  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO: BIOMEDICINA PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL E DO PERFIL DE BIODISPONIBILIDADE DE NANOCÁPSULAS, CONTENDO O ÁCIDOFUMARPROTOCETRÁRICO EXTRAÍDO DE Cladonia verticillaris (Raddi) Fr. MILENA SALES FERRAZ Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães Recife-PE/2003
  • 2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO: BIOMEDICINA PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL E DO PERFIL DE BIODISPONIBILIDADE DE NANOCÁPSULAS, CONTENDO O ÁCIDOFUMARPROTOCETRÁRICO EXTRAÍDO DE Cladonia verticillaris (Raddi) Fr. MILENA SALES FERRAZ Projeto de iniciação científica apresentado ao Curso de Biomedicina, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), como cumprimento das exigências impostas por essa instituição . Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães. Recife-PE/2003
  • 3. I) INTRODUÇÃO O câncer é causado em todos (ou quase todos) os casos por mutação ou por ativaçãoanormal de genes celulares que controlam o crescimento e a mitose celular. Esses genesanormais são chamados de oncogenes [1]. Carcinogênese ou oncogênese são termos quedesignam o processo de desenvolvimento de uma neoplasia, desde as alterações maisprecoces no DNA, que supostamente ocorrem em uma só célula ou em um pequeno grupodelas, até a formação de um tumor que pode destruir o organismo hospedeiro. Este processoneoplásico é um processo dinâmico, que evolui em muitas etapas [2]. Devido à importância epidemiológica dos processos neoplásicos, inúmeras abordagensterapêuticas vêm sendo propostas. As categorias básicas para o tratamento são: cirurgia,radioterapia e quimioterapia. Esta última apresenta desfavorável aspecto, devido àinespecificidade da droga e à dificuldade em se estabelecer uma dose efetiva para destruir omáximo de células com o mínimo de efeitos colaterais para as células normais [3]. A maioria das drogas utilizadas atualmente no tratamento de câncer ou danificam oDNA ou inibem a sua replicação [4]. As células cancerosas, por crescerem maisrapidamente que as células normais da maioria dos tecidos, têm necessidades maiores denucleotídeos como precursores na síntese de DNA e RNA, assim são, em geral, maissensíveis aos inibidores da biossíntese de nucleotídeos do que as células normais [5]. A eficácia da presente quimioterapia do câncer está principalmente limitada pelatoxicidade associada com as drogas anticancerígenas nos tecidos normais [6]. Umaestratégia pode ser a associação de drogas antitumorais com nanopartículas coloidaisvisando sobrepor os mecanismos de resistência celular e não-celular e aumentar aseletividade de drogas em células cancerosas enquanto reduz a sua toxicidade em tecidosnormais [7]. Uma estratégia alternativa para a realização mais seletiva de tratamento decâncer é o desenvolvimento de drogas direcionadas especificamente contra os oncogenesque conduzem o crescimento do tumor [4] As nanopartículas podem agir como um veículo de droga capaz de atingir tecidostumorais ou células, em uma certa extensão, enquanto protege a inativação prematura dadroga durante o seu transporte [7]. A encapsulação permite uma melhora da estabilidade dadroga, em decorrência da sua proteção (condições de estocagem) e redução dos efeitostóxicos ou adversos. O principal interesse desses vetores coloidais baseia-se na melhora do
  • 4. efeito terapêutico pelo direcionamento das moléculas ativas em seus sítios de ação e peloocasionamento de uma elevada concentração local [8].II) OBJETIVOS O objetivo principal desde projeto baseia-se na determinação das atividadescitotóxica e antitumoral e do perfil de biodisponibilidade de um sistema carreador defármaco, nanocápsulas de um polímero biodegradável (PLGA), contendo o ácidofumarprotocetrárico. O estudo desses parâmetros permitirá a melhor compreensão dospadrões ideais de funcionamento desses carreadores, como sistemas de liberação controladade fármacos, visando a sua futura e possível erradicação das células neoplásicas, assimcomo a observação do mecanismo de biodistribuição da droga, ao ser administrada in vivo.III) JUSTIFICATIVA O fundamento desse projeto consiste na aplicação de uma nova tecnologia devetorização de fármacos, nanoencapsulação, a fim de utilizar substâncias liquênicas,extraídas da flora do nordeste brasileiro, com potencial atividade antineoplásica. Aconstatação das atividades citotóxica e antitumoral permitirá a continuidade de estudos debiodisponibilidade desses carreadores coloidais.III) PLANO DE TRABALHOParte I: Determinação da atividade citotóxica Etapa 1: Análise citotóxica segundo protocolo do National Cancer Institute [9]Parte II: Estudo da Atividade Antitumoral Etapa 1: Determinação da atividade antitumoral in vivo do ácidofumarprotocetrárico, livre e encapsulado, frente ao Sarcoma 180, em camundongos; Etapa 2: Estudos histopatológicos dos tumores e órgãos dos animais tratados como ácido fumarprotocetrárico, livre e encapsulado.Parte III: Determinação do perfil de biodisponibilidade A biodistribuição do ácido fumarprotocetrárico será determinada, in vivo, em suasformas livre e encapsulada.
  • 5. IV) METODOLOGIA O presente projeto é constituído de três partes fundamentais, tais como: o estudo dasatividades citotóxica e antitumoral das formulações e avaliação do perfil de biodistribuiçãodas nanocápsulas, constituídas de ácido fumarprotocetrárico. As nanocápsulas de copolímero de ácido lático e glicólico (PLGA), contendo oácido fumarprotocetrárico, obtidas segundo o método de deposição interfacial do polímeropré-formado[10], serão analisadas da seguinte maneira:A) Determinação da atividade citotóxica: O estudo da citotoxicidade será realizado pelo método de cultura de tecidos comcélulas da linhagens contínuas KB (carcinoma nasofaríngeo), Hep-2 (carcinomaepedermóide de laringe), Hela (adenocarcinoma de útero), P815 (mastocitoma- leucemiamurina) camundongo DBS/2, U-937 (linfoma leucemia humana), todas em faseexponencial de crescimento, e desenvolvidas em meio mínimo essencial (MME),suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de glutamina e 1% de antibióticos(penicilina, estreptomicina e carnamicina) [11]. As células serão repicadas rotineiramente para manutenção, em dias alternados e 6semeadas em 10 células por frasco. As utilizadas para teste serão repicadas 24h antes doexperimento em monoestrato, removidos com 0,25% de tripsina [12], e diluídas no meio a30.000 células /ml. As amostras purificadas serão utilizadas nos ensaios de citotoxidade de acordo como protocolo para triagem de agentes químicos e produtos naturais (Protocol for ScreeningAgents and Natural Products-NCI) [9]. As amostras testes serão acrescentadas ao meiocontendo células, a concentrações variadas. Em seguida, as placas serão incubadas por 72hem atmosfera de 5% de CO2. A atividade citotóxica será medida através da percentagem de inibição docrescimento da amostra em relação ao grupo controle. Nestes ensaios serão utilizados ostestes: método calorimétrico de MTT (brometo 3-4,5 dimetiltiazol-2,5 difeniltetrazólio ousal tetrazólio) [13]; ensaio de vermelho neutro (NRU) [14]; e também será determinado oconteúdo de DNA [15].
  • 6. B) Estudo da atividade antitumoral das formulações: Este estudo será realizado com o objetivo de avaliar a atividade antitumoral in vivofrente ao tumor sarcoma-180. Células do tumor ascítico (5,0 x 106 células ml –1 ) serãoinoculadas via subcutânea (s.c) na região dorsal direita do camundongo. O tratamento será iniciado, 24 h após inoculação por 7 dias consecutivos. Após umasemana de tratamento os animais serão sacrificados, tumores removidos, mensurados epesados. Os órgãos (fígado, rins e baço) serão dessecados e submetidos a estudoshistopatológicos. A inibição tumoral será determinada a partir do peso médio dos grupos deanimais tratados em relação ao grupo controle não tratado.C) Determinação do perfil de biodisponibilidade do ácido fumarprotocetrárico, invivo, livre e encapsulado: O estudo da biodisponibilidade será realizado para observação das etapas deabsorção, metabolismo e eliminação do fármaco, como também sua fixação emdeterminados tecidos do organismo. A distribuição dos sistemas nanoparticulados contendoa substância liquênica, ácido fumarprotocetrárico, previamente marcada com fluoresceínaisotiocianeto dextran (FITC-Dx) será determinada após sua administração por viaintravenosa. Este marcador fluorescente será adicionado à fase orgânica do processo depreparação das nanocápsulas anteriormente relatado. Em intervalos de tempo pré-determinado serão coletadas amostras de sangue e, consecutivamente, os animais serãosacrificados e os órgãos (fígado, baço, rins, pulmão e coração) removidos. A fluorescênciaserá determinada em espectrofluorímetro e o resultado será expresso em percentagem defluorescência presente no sangue e no sobrenadante, resultante da centrifugação de cada umdos respectivos órgãos, nos determinados intervalos de tempo [16].
  • 7. VI) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. GUYTON, A.C. & HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica, 10a ed. Ed.GuanabaraKoogan S/A, Rio de Janeiro-RJ, cap.03, p.: 34, 2002.2. MONTENEGRO, M.R. & FRANCO, M. Patologia Processos Gerais, 4a ed., Ed.Atheneu, São Paulo-SP, 1999.3. SANTOS, N. P. Nanocápsulas de PLGA contendo ácido úsnico de Cladoniasubstellata com potencial ação antitumoral., 2003. 124 p. Tese (Doutorado em CiênciasBiológicas), Universidade Federal de Pernambuco, Pernambuco, Brasil.4. COOPER, G. M. A célula: uma abordagem celular, 2a ed. Ed. Artmed, Porto Alegre-RS,cap.15, p.: 633-674, 2001.5. NELSON, D. L. & COX, M. M. Lehninger. Princípios da Bioquímica, 3a ed. Ed. Sarvier,São Paulo-SP, cap.15, p.: 417-418, 2000.6. MITRA, S., GAUR, U., GHOSH, P.C. & MAITRA, A.N. Tumor targeted delivery ofencapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier.Journal Controled Release.v. 74: 317-323, 2001.7. BRIGGER, I., DUBERNET, C. & COUVREUR, P. Nanoparticles in cancer therapy anddiagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 54: 631-651, 2002.8.GUINEBRETIÈRE, S., BRIANON, S., FESSI, H., TEODORESCU, V.S. &BLANCHIN, M.G. Nanocapsules of biodegradable polymers: preparation andcharacterizatin by direct high resolution electron microscopy. Materials Science &Engineering.v. 21: 137-142, 2002.9. GERAN, R. I., GREENBERG, N. H., MACDONALD, M. M., SCHUMACHER, A. M.& ABBOT, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products againstanimal and other biological systems, 3a ed. Cancer Chemotherapy Reports. v. 3, Part III,2, 1972.10. FESSI, H. PUISIEUX, F. DEVISSAGUET, J. AMMOURY, N. e BENITA, S. Int. J.Pharm. v. 55: pR1-R4, 1989.11. EAGLE, H. Biology and Medicine, Baltimore. v: 9: 362-364, 1959.12. EDWARD S. G.; FOGH, J. Cancer Reash, Pliladelphia. v. 9: 362-364, 1959.
  • 8. 13. DENIZOT, F., LANG, R. J. Immunol. Methods.v. 89: 271-277, 1986.14. BOREFREUND, E., PUERNER, J.A. J. TISS. Cult. Methods.v. 9: 7-9, 1984.15. CINGI, M. R. DE ANGELIS, I. FORTUNATI, E. E., REGGIANI, D., BIANCHI, V.,TIOZZO, R., ZUCCO, F., Toxicol. In vitro. v. 5 : 19-125, 1991.16. GAUR, U., SAHOO, S. K., DE, T.K., GHOSH, P.C., MAITRA, A. & GHOSH, P. K.Biodistribuiton of fluoresceinated dextran using novel nanoparticles evadingreticuloendothelial system. International Journal of Pharmaceutics. v. 202: 1-10, 2000.VII) CRONOGRAMA: NOVEMBRO (2003) - AGOSTO (2004)TRIMESTRES 1 2 3 4Pesquisa bibliográfica X X XDeterminação da atividade citotóxica X XDeterminação da atividade antitumoral X XEstudo da biodisponibilidade X XRedação e defesa da monografia X