• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Pagina web alexander..!
 

Pagina web alexander..!

on

  • 418 views

 

Statistics

Views

Total Views
418
Views on SlideShare
418
Embed Views
0

Actions

Likes
0
Downloads
9
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Pagina web alexander..! Pagina web alexander..! Presentation Transcript

    •  Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas(explantos) en un medio de cultivo apropiado El cultivo se desarrolla en condiciones detemperatura, humedad, fotoperíodo e irradianciacontrolados. La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar Esta técnica es importante en la propagación deespecies de interés agroforestal y agrícola:micropropagación
    •  Producen innumerables productos de importancia enla industria farmacéutica, cosmética yalimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticoso pigmentos. Los cultivos in vitro permiten obviar losinconvenientes derivados de condicionesgeográficas, climáticas y de tiempo de producción.
    •  Plasticidad Totipotencialidad Es la capacidad de una célula vegetal de darlugar al desarrollo de una planta completa. Lascélulas totipotentes son células somáticas quehan retenido su capacidad de dividirse ydiferenciarse en una planta madura si secoloca en el medio adecuado.
    • Definición Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte deuna planta en un medio nutritivo. Tipos de cultivos: cultivo de células cultivo de tejidos cultivos de órganos
    • Puede definirse como el conjunto detécnicas que permiten el cultivo encondiciones asépticas de órganos,Tejidos, células y protoplastos.CULTIVO DE TEJIDOS
    •  es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología Está técnica se basa en la "totipotencialidad celular";capacidad de una célula vegetal de formar una plantacompleta bajo ciertas condiciones químicas yfísicas, dadas en el cultivo in vitro se obtiene la propagación rápida y masiva de plantasidénticas a la original a partir de cualquier parte aisladade la planta, sean estos trozos de tejidos, ápicesmeristemáticos o incluso células aisladas. Inicialmente se usó esta técnica para la multiplicaciónmasiva de plantas élites o micro propagación y tambiénen la obtención de clones libres de virus.CARACTERISTICAS
    •  El cultivo in vitro es un métodode propagación de plantas deaplicación profesional, puesto que serealiza en laboratorio, en unascondiciones estériles y con unasinstalaciones especiales. El cultivo in vitro consiste en tomar untrocito de hoja, un embrión, unaporción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1milímetro) o cualquier otra parte deuna planta y ponerla a cultivar en untubo de ensayo sobre un medio acuosonutritivo. Lo fundamental es que se hace enunas condiciones muy controladas ytotalmente estérilesMultiplicación o reproducción de frutalin vitro
    • Organizado:Se refiere al tipo de cultivo que se inicia con una parte organizada de laplanta (ápices, hojas, brotes, semillas, etc.) y esa parte u órgano siguecreciendo in vitro manteniendo sus características estructurales. Se aplicatambién cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejidodesorganizado.Desorganizado:Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos detejidos u órganos se produce un tejido sin estructura especifica quecontiene un numero limitado de algunos tipos de células especializadasencontradas en una planta intacta. Un tejido desorganizado puede crecercon subcultivos y puede ser mantenido en medio solido o liquido durantevarios meses o años. Puede ser usado para iniciar suspensión de células yprotoplastos.
    •  Cultivos agronómicos Cultivos in vitro1. Cultivos diferenciados (raíces, tallos, embriones, raíces ytallos transformados)2. Cultivos indiferenciados (callos, suspensiones)
    •  Callos : en medio sólido,crecimiento lento, granheterogeneidad celular, Cultivos en suspensión:derivan de los anteriores,en medio líquido decomposición adecuada,crecimiento más rápido yhomogéneo. Composición del medio decultivo. Fuente de carbono,minerales, vitaminas,fitohormonas (auxinas,citoquininas)
    •  Tejidos no diferenciados ( a vecesdiferenciados), en división activa. Frecuentemente se desarrollan a partir deheridas.
    •  Mezcla de sustancias en los que lascélulas, tejidos y órganos pueden dividirse ycrecer. Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I Suplementos orgánicos complejos: leche decoco, extracto de levadura. Reguladores de crecimiento : hormonas. Fuente de carbono: sacarosa Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido.
    • Hormonas/ Fitohormonas: Auxinas: grupo de hormonas vegetales(naturales o sintéticas) que inducenla elongación, o en algunos casos ladivisión celular. Frecuentemente inducenraíces adventicias e inhiben laformación de tallosadventicios. Cytokininas: grupo de hormonasvegetales (naturales o sintéticas) queinducen división celular y frecuentementetallos adventicios y en muchos casosinhiben la formación de raícesadventicias. Reglas generales para la acción hormonal: • Auxina : Cytokinina = ~1 Callo • Auxina : Cytokinina < 1 Tallo • Auxina : Cytokinina > 1 Raíces Son producidos por microorganismos
    •  1. Explanto: porción de tejido u órgano que sesepara de la planta para iniciar el cultivo. 2. Esterilización: procedimiento para laeliminación de microorganismos. Autoclave: aparato en el que el medio, material dvidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vaporbajo presión (121oC, 15 psi, 10-20 min.). Requerimientos de asepsia: desinfección de superficiedel explanto: generalmente usando lavandina comercialdiluido para evitar el desarrollo de microorganismos. Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenidaestéril por el flujo continuo, no turbulento de aireestéril.
    •  Subcultivo: pasajedecélulas, tejidos, órganos, etc. Desde unmedio de cultivoagotado a otro mediofresco. Micropropagación:propagaciónvegetativa in vitro deplantas.
    •  Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una funciónespecífica y/o regeneración de órganos, estructuras tipoórganos (raíces, tallos) o embriones. Adventicios: desarrollo de órganos(raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-likestructures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.
    • Formación de tallos, raíces, flores, etc.¡¡Regeneración de una planta completa!!ExplantoOrganogénesisFormación de tallos Formación de raícesEnraizamiento TallosPlanta completa
    • Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de unacélula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de célulassomáticas (embriogénesis somática).
    •  Procedimiento para la regeneración víaembriogénesis somática 1. Iniciación: callos embriogénicos 2. Proliferación: callos embriogénicos, masasproembriogénicas (PEM) 3. Desarrollo y maduración de embriones :embriones 4. Germinación de embriones (Regeneración) Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: Masas proembriogénicas Estadío globular Torpedo Embrión somático
    •  Semillas sintéticas (artificiales) 1. Producción en masa de semillas genéticamentemejoradas. 2. Procedimientos: Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una cubiertaadecuada, almacenar 3. Encapsulación de embriones somáticos:protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable. Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.
    •  Variación fenotípica, genética o epigenética en suorigen. Permite describir la variabilidad genética observadaen tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro Es común cuando se regeneran plantas a partir decallos, o cuando los cultivos se establecen a partir deexplantos que no contienen un meristema pre-organizado. En muchos casos, el grado de variación es proporcionala la duración del cultivo in vitro. Se aplica para mejora de cultivos
    •  Protoplasto: célula vegetal sin pared celular Procedimiento: (1). Digestión de la pared celular: celulasa,hemicelulasa, pectinasa. Son producidos pormicroorganismos. (2). Regeneración de la pared celular:usualmente dentro de las 24 hrs. (3). División celular: la primera división ocurredentro de las 24-48 hrs (4). Proliferación y diferenciación
    • Aplicaciones: 1. Remoción de pared para captación de DNA :Microinyección y electroporación 2. estudios de síntesis de paredcelular, transporte demembrana, citoesqueleto. 3. estudio de desarrollo de embrionessomáticos. 4. hibridización somática (cybridización) deespecies sexualmente compatibles oincompatibles, por fusión de protoplastos seobtiene un nuevo germplasma.
    •  1. Mantenimiento del background genéticodeseado: micropropagación. 2. Producción en gran escala de cultivaresapropiados: embriogénesis somática 3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivocontinuo. 4. Eliminación de virus y otros patógenos. 5. Regeneración de plantas obtenidas poringeniería genética.
    •  Raíces y tallostransformados: obtenidaspor transformacióngenética con la bacteriapatógena del sueloAgrobacterium sp. Se pueden usar para laproducción de metabolitosderivados deraíces, crecimientorápido, mayor estabilidadgenética, mayorproductividad.
    •  El uso de la biotecnología moderna implica,inicialmente, el conocimiento y aislamiento desecuencias de ADN que corresponden a genesresponsables de conferir una característica deseada(fenotipo) El aislamiento de los genes de interés es realizado pormedio de técnicas de clonado molecular
    •  Inducción de la amplificación de una secuencia deADN en un organismo vivo. Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectoresen los que la secuencia de ADN es introducidausando una DNA ligasa. Cuando es necesario elfragmento de ADN de interés puede ser liberadodel vector por medio de enzimas de restricción. Una vez aislados los genes de interés sonincorporados al organismo blanco resultando enun organismo genéticamente modificado (OGM) yesta característica adquirida pasa a ser hereditaria
    •  Es posible transferir genes deanimales, bacterias o virus a lasplantas. Se amplían los recursos para elmejoramiento genético. Los genes de un organismo que soninsertados en otro se denominantransgenes y tienen la capacidad deconferirle a este último unadeterminada característica.
    •  Son excelentes modelos para el estudio de procesosgenerales básicos como regulación de la expresióngénica y la genética molecular del desarrollo ydiferenciación celular Ofrecen la posibilidad de corrección de numerosasenfermedades hereditarias: terapia génica
    •  Pueden funcionar como bioreactores para laproducción de proteínas valiosas o con propósitosindustriales Deben ser capaces de producir la proteína deinterés en niveles aceptables sin comprometer elnormal funcionamiento de sus células Deben tener la capacidad de transmitir estacaracterística a las siguientes generaciones En el caso de ser un organismo multicelular debenser capaces de producir la proteína exógena en unórgano definido
    •  Acoplar a la secuencia de ADN que codifica para laproteína de interés secuencias de ADN quecontengan señales responsables de dirigir altosniveles de producción (promotor) de la proteínadeseada en un órgano específico. Las técnicas para la inserción de ADN en célulasvegetales (transformación) usadas son: Infección con Agrobacterium tumefaciens Electroporación de protoplastos Método biolístico
    • Los primeros experimentos a campo con plantastransgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidosy en Francia.En 1996 y 1997 el número de países que ensayóplantas transgénicas a campo aumentó a 45habiéndose realizado en 2 años mas de 10 milexperimentos.Los cultivos más usados fueron:maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola.Las características genéticas introducidas sontolerancia a herbicidas, resistencia ainsectos, calidad de producto y resistencia a virus.
    •  La técnica del clonado in vitro es posible mediante elcultivo de tejidos Esta técnica se basa en la totipotencialidad de lascélulas vegetales, por medio de la regeneración invitro, vía organogénesis o embriogénesis somática
    •  Se producen cambios por inserción de un genproveniente de otro organismo La transferencia de DNA/genes de un organismo aotro se realiza sin necesidad de reproducciónsexual. La transformación exitosa depende de laincorporación estable del gen nuevo en el genomade la planta receptora y su subsiguientetransmisión a sucesivas generaciones.
    • Requerimientos Mecanismo de transferencia del gen Mecanismos de transferencia indirecta Mecanismos de transferencia directa Sistemas de regeneración
    • Mediada por Agrobacterium: Agrobacterium es una bacteria patógena del suelopara dicotiledóneas y algunas coníferas. • Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease(tumors) • Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease(hairy roots) Las Monocotiledóneas presentan resistencianatural a Agrobacterium.
    •  Agrobacterium tumefaciens & crown galldisease Crown gall disease produce nódulos anormales enraíces. Los árboles jóvenes no crecen, en losárboles adultos la corteza se pudre. Esta bacteria entra al árbol a través de heridas.
    • Agrobacterium tumefaciens La enfermedad crown gall resulta de laexpresión de genes codificados por unsegmento de DNA de la bacteria que setransfiere e integra en forma estable algenoma vegetal El fragmento de DNA bacterianocontiene genes que producen hormonascuando se expresan en las célulasvegetales ocasionando divisiones ycrecimiento anormales (tumores). Agrobacterium es un “ingeniero genéticonatural”(1983). Es un mecanismo de transferencia entrereinos
    • Transformación mediada por Agrobacterium Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A.tumefaciens) Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots (A.rhizogenes) T-DNA: DNA que se transfiere1. genes para síntesis de hormonas: codifican para enzimasinvolucradas en la biosíntesis de auxinas y citoquinias. Laexpresión de estos genes en la célula vegetal causa laenfermedad de agalla de corona o la formación de hairy roots2. Secuencias en los bordes: 25 bp direct repeats, borde derecho(RB) y borde izquierdo (LB),a ambos lados del T-DNA. Son loselementos necesarios (en la región del T-DNA ) para dirigir latransferencia del T-DNA.
    • PlásmidoTi o plásmido Ri: Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas. Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos vegetales infectadosque son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno.Clasificación de los plásmidos Ti y Ri:Plásmidos Ti: plásmidos Nopalina• Octopine plasmid• Agropine plasmid• Succimanopine plasmidPlásmidos Ri: plásmidos Manopina• Agropine plasmid• Cucumopine plasmid
    • Localizados en la región T-DNA:1.Genes de síntesis de hormonas2. Secuencias de los bordes: LB y RBLocalizados en cualquier región del plásmido Ti:3.Genes de síntesis de opinas4. Genes de virulenciaLocalizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci)Síntesis de fibrillas de celulosa por Agrobacterium para cubrir la superficie de la céluavegetal(irreversible). Clusters de Agro son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.• chvA ychvB (linked): síntesis y excreción de 1,2-glucan• cel locus: síntesis de fibrillas de celulosa• pscA locus: afectan la síntesis de cicloglicanos y ácido succinilglicano• att locus: afecta proteínas de la superficie celularAlgunos de estos loci se encuentran conservados en otras bacterias del suelo que se interasocian conplantas
    • Las células vegetales se vuelven sensibles a Agrobacteriumcuando son heridas.El proceso de transferencia se puede dividir en: En la bacteria: proceso de conjugación bacteriana En la célula vegetal: las células heridas producencompuestos fenólicos de bajo PM que actúan comoinductores específicos de los genes de expresión vir.Acetosyringona (AS), hirdroxi-acetosyringona (OH-AS)Estos compuestos fenólicos actúan a través de dos sistemas para Regular laexpresión de los genes vir
    •  Uso del plásmido Ti de Agrobacterium comovector de transformación Se remueven los genes para hormonas(desarmado) Para la transformación de introducen genes enel plásmido Ti Clonado de DNA Genes marcadores para selección: deresistencia a antibióticos Cassetes:Promotor + gen + terminador
    • Ventajas: Transformación estableDesventajas: No para monocotiledóneas
    • APLICACIONESSus aplicaciones van desde estudiosteóricos sobre fisiología y bioquímicavegetal, hasta la obtención de plantas libresde patógenos, conservación de germoplasma,producción de metabolitos secundarios, pro--pagación masiva de plantas,mejoramientogenético,inducción de mutaciones,selecciónin vitro y desarrollo de protocolos de regene--ración de plantas para su utilización en inge-niería genética .
    • ACTIVIDADES (APLICACIONES)I Producción de materiales libre de virus: Producción de material libre de virus endémicos de Ajo yPapa para luego llevar la semilla libre de virus por elprograma de Hortalizas. Producción de plantas madres de frutales de hoja caducapara vivero. Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para laintroducción y cultivo in vitro de especies de interéshortícola, frutícola, forestales y nativas.
    • II. Conservación de germoplasma: Conservación en frío a mediano plazo de más de 500materiales de interés en diversas áreas de producción.III. Aplicaciones al mejoramiento genético: Cultivo de anteras en arroz y rescate de embriones entrigo para lograr un avance generacional mediante laproducción de doble haploides para los programas demejoramiento. Inducción de variación somaclonal en durazno para lamejor tolerancia a bacteriosis
    •  Mantiene la identidad genética del material propagadosin introducir ninguna variabilidad genética Propagación clonal rápida(floricultura, fruticultura, plantasmedicinales, silvicultura) Eliminación de virus (cultivo de meristemas)hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos)
    •  Bancos de germplasma Semillas sintéticas (embriones somáticos recubiertosde gel de alginato que también encapsula nutrientespara el desarrollo del embrión)
    •  Puede ser obtenida mediante lautilización de inhibidores de proteasasvegetales o a partir de toxinasbacterianas (Bacillus thuringiensis), ogen Bt Como ejemplos de plantas resistentes ainsectos están el maíz, batata y sojatransgénicos
    •  Esta modalidad engloba a la mayorparte de las plantas transgénicasactuales Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña deazúcar Un ejemplo cotidiano es la SojaRoundup Ready
    •  Las perspectivas son cada vez mayores a medidaque aumentan los conocimientos acerca defitovirus Silenciamiento génico o protección mediada porARN Por medio de la tecnología del Agrobacteriumtumefaciens o de la biolística y el cultivo detejidos, es posible introducir en la planta genes dela cápside viral posibilitándose así la adquisiciónde resistencia por parte de la planta.
    •  Dentro del mercado de la floriculturase abren nuevas perspectivas con elclonado de genes asociados con lacoloración de las flores. También se abre la posibilidad demodificar la arquitectura de la planta yde las flores, las fragancias y la mayordurabilidad de las flores.
    •  La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácidoesteárico. Se alteró la composición en hidratos de carbono convistas a la producción de tubérculos de papa, aumentodel contenido de almidón y reducción de amilosa En el año 2000 se informó la obtención de arrozgenéticamente modificado que produce beta-carotenos, precursor de la vitamina A
    •  Es posible alterar rutas metabólicas para permitirque las plantas, o sus células, funcionen comobioreactores (reactores biológicos). Es posible, de esta manera, la producción desustancias de valor farmacológico, como porejemplo, vacunas y biofármacos. La manipulación del metabolismo secundario devegetales, por medio de la transformacióngenética, promete ser una de las contribucionesmás importantes de la ingeniería genética aplicadaa la industria.
    •  La sobre expresión constitutivade genes involucrados en la rutabiosintética de metabolitossecundarios podrá aumentarsignificativamente la cantidadde compuestos útiles producidosen plantas. Los avances en esta áreapermitirán aumentar lasproductividad de metabolitossecundarios obtenidos encultivos in vitro con laconsiguiente reducción de costosde producción o logrando laproducción de nuevoscompuestos.
    • Metabolito secundario Cultivo productorAcido rosmarínico Anchusa officinalisAjmalicina Catharanthus roseusBerberina Coptis japonicaDigoxina Digitlis lanataGinsenósidos Panax ginsengHiosciamina Hyoscyamus nigerNicotina Nicotiana tabacumPiretroides Pyrethrum cinereaShikonina Lithospermum erytrorhizonTaxol Taxus cuspidataVinblastina Catharanthus roseus
    •  Se usan para realizar reaccionesbioquímicas sencillas en las que no senecesita diferenciación ni crecimientocelular Hidroxilación estereoespecífica enposición 12- de la - metildigoxina, glicósido cardiotónico, porcélulas de Digitalis lanata.
    • Diferencias más importantes en el cultivo de célulasmicrobianas, animales y vegetalesCaracterística Células microbianas Células animales Células vegetalesTamaño 1-5 μm3 105-106 μm3 105-106 μm3Forma de crecimiento Células individuales Individuales oadheridas asuperficiesEn gruposTiempo de generación 1 hora 20horas >24 horasSensibilidad al esfuerzocortantebaja alta AltaRequerimiento de oxígeno Hasta 180 mmol l-1h-1 0.7-1.0 mmol l-1 h-1 0.5-1.8 mmol l-1h-1Requerimientos nutritivos simples complejos SimplesPoblación celular alcanzadaen cultivo líquido1010 células ml-1 106 células .ml-1 106 células .ml-1
    • El cultivo de tejidos es base importante para labiotecnología ya que al cultivar por ejemplotejidos , órganos, células in vitro y con lascaracterísticas que se requieran se puedenobtener diferentes productos de valor para elhombre como los alimentos.
    •  http://books.google.com.mx/books?id=T9QOAQAAIAAJ&pg=PA1&lpg=PA1&dq=terminos+para+identificar+los+principales+tipos+de+propagacion+in+vitro&source=bl&ots=p36OKbGhei&sig=e_R7U1ZsoyFLf2m-nzKLpZmd7O8&hl=es-419&sa=X&ei=pGkkUbaTH8KO2AWh6IFA&ved=0CDkQ6AEwAA http://html.rincondelvago.com/cultivo-in-vitro.html http://www.uam.es/docencia/LAvanFis/CI/CharlaCultinvitro0607.pdf http://www.slideshare.net/pancharas59/generalidades-de-cultivos-in-vitro http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales
    • UNIDAD II“TECNICAS DE CULTIVO”MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACIONDOCENTE:ING IRMA CASTILLOCARMONA.ELABORO :ALEXANDER LOPEZ CARDEÑAING. BIOQUIMICAMISANTLA VER, A 27 DE MAYO DEL 2013
    • Un medio de cultivo es un materialalimenticio que se usa en el laboratoriopara el desarrollo de losmicroorganismos. Una vez que ha sidopreparado, un medio de cultivo puede serinoculado (es decir, se le añadenorganismos) y a continuación incubadoen condiciones que favorezcan elcrecimiento microbiano. El crecimientode los microorganismos es el cultivo. Uncultivo axénico o puro contiene un únicotipo de microorganismos.
    • *Los medios de cultivo deben contener losnutrientes y factores de crecimientonecesarios y deben estar exentos decualquier microorganismo contaminante.*Los medios de cultivo contienen comomínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforoy sales inorgánicas. En muchos casos seránnecesarias ciertas vitaminas y otrassustancias inductoras del crecimiento.También se añaden colorantes que actúancomo indicadores para detectar, porejemplo, la formación de ácido o comoinhibidores del crecimiento de unasbacterias y no de otras.
    • La composición mineral se define enforma precisa en cada uno de losmedios y está dada tanto por losmacronutrientes(N, P, K, S, Mg yCa) como por los micronutrientes(B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I yFe). Estos nutrientes deben estaren una concentración tal quepermita el adecuado crecimientocelular.
    •  Los requerimientos de nitrógeno songeneralmente provistos por una mezclade nitrato y amonio en concentracionesvariables entre 3 y 50 mM. Cuandoestas fuentes son suplementadas enforma individual se afectan,generalmente en forma negativa, tantoel crecimiento del cultivo como laproducción de metabolitos .Pero, dadoque el uso de nitrato exige una mayordemanda energética para la asimilacióndel nitrógeno si se compara con elamonio, algunos explantos crecenmejor si se les suministra nitrógenoreducido (Krikorian, 1991),recomendándose en este caso laadición de un ácido orgánico como elsuccinato como agente bufferante.
    • Muchas células vegetales son sensibles a los niveles defosfatos en el medio.Precisamente, el mantenimiento de los niveles de fosfatopor debajo del óptimo para el crecimiento estimulaentre 3 y 4 veces la acumulación de cinamoil-putrescina en cultivos de suspensiones de Nicotianatabacum e incrementa la síntesis de alcaloides enCatharanthus roseus (Misawa, 1985).Habitualmente, los fosfatos son almacenados en lavacuola y adquiridos desde allí para el crecimiento.
    • Generalmente se agrega calcio en mayoresconcentraciones que en los medios microbianos,variando entre 1 y 3 mM.El hierro es esencial para el crecimiento celular y seagrega al medio de cultivo en una concentración de0,01 a 0,15 mM. Se aconseja la utilización del quelatoFe-EDTA que aumenta la solubilidad del hierro.La naturaleza y concentración de los micronutrientesempleados en los medios de cultivo surgenprincipalmente de resultados empíricos al evaluar lacapacidad de cada elemento de afectar el crecimiento
    • Puede ser necesario añadir al medio decultivo algunas vitaminas hasta quelos cultivos prosperen. Las vitaminasfavorecedoras del desarrollo decultivos in vitro y que se añadenrutinariamente en la mayoría de losmedios de cultivo son: tiamina(B1), piridoxina (B6) y ácidonicotínico (Otras vitaminas quesuelen ser útiles son ácidopantoténico, biotina, riboflavina(B2), colina, cianocobalamina (B12) yácido fólico. El ácido ascórbico(vitamina C) se considera benéfico enalgunos casos, pero probablementedebido más a su capacidad reductoraque a su papel como vitamina.
    • El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) serealiza con las siguientes sustancias:
    • *Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de aguadel volumen final deseado, y sobre ella se vanañadiendo uno por uno todos los componentes hastasu completa disolución. Posteriormente se ajusta elvolumen final con agua y se almacenan.*Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientespara preparar 1 L de medio de cultivo MS.
    • Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 Lde medio de cultivo MS.Usar 10 ml de la solución stock de micronutrientes parapreparar 1 L de medio de cultivo MS.Usar 10 ml de la solución stock de hierro quelado parapreparar 1 L de medio de cultivo MS.Usar 10 ml de la solución stock de vitaminas parapreparar 1 L de medio de cultivo MS.
    • En primer lugar hay que seleccionar material vegetal enun adecuado estado de nutrición y libre deenfermedades y plagas. Si en el material presentasealgún problema habría que descartarlo o realizar lostratamientos adecuados.
    • *El cultivo del meristemoapical de un tallo seemplea para laobtención de plantaslibres de virus ya queestos patógenos tienendificultades paraalcanzar esta zonacuando la planta estácreciendo activamente
    • El microinjerto es una variante del cultivo demeristemos que consiste en colocar el ápice caulinarsobre una microplanta in vitro. El meristemo sería elinjerto y la microplanta el patrón.
    • El callo es una masa de célulasindiferenciadas, coherente yamorfa que se multiplica deuna manera desorganizada. Sepuede inducir in vitromediante la transferencia deórganos vegetales establecidosin vitro a medios de cultivoadecuados, quefrecuentemente posen laauxina 2,4 D.
    • Se pueden considerar dos situaciones dependiendoque el explanto que se va a emplear esté protegido en elinterior de un órgano, como el embrión, o esté encontacto con el exterior, como brotes y yemas.Para los explantos en el interior de órganos hay querealizar los siguientes pasos:Lavar el explanto con agua y jabónLavar por 30min con cloro 10ml a 100mil de aguaRealizar una asepsia superficial del órgano con etanolal 70 %.Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar elexplanto.Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O.
    • *Cortar segmentos nodales o apicales de crecimientoactivo y de un tamaño ligeramente superior al deseado.Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en unrecipiente con agua destilada.*Lavar los explantos con abundante agua estéril ydepositarlos sobre papel de filtro para eliminar elexceso de agua.
    • *Cortar una pequeña porción del extremo del explanto(por donde se cortó inicialmente) y clavarverticalmente la parte basal (inferior) en el medio decultivo.*Colocar los explantos en una cámara de crecimiento enoscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.
    • *Vasos de cristal para el cultivo esterilizados con elmedio
    • Agua esterilizadaCultivo in vitrode plantas
    • *BISTURI
    • *MECHERO*AUTOCLAVE
    • *PINZAS
    • El paso previo a la instalación in vitrode un material vegetal es la asepsiasuperficial. El protocolo de esteproceso dependerá de lascaracterísticas del tejido empleado.Para trabajar en condicionesasépticas, es recomendable realizareste proceso en una cámara de flujolaminar y emplear material estéril. Elambiente debe mantenerse limpiocon la superficie de trabajodesinfectada con etanol al 70% antesy después de usarla. Se debe usar batade laboratorio y lavarse bien lasmanos.
    • Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar ocampana de flujo laminar es un recinto que emplea unventilador para forzar el paso de aire a través de unfiltro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a lazona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1 micras.Este tipo de equipos se fabrican en formageneralmente prismática con una única cara libre (lafrontal) que da acceso al interior, donde se localiza lasuperficie de trabajo, que normalmente permanecelimpia y estéril
    • *Dentro de estas cabinas o campanas se trabajacon obleas de semiconductor, cultivoscelulares o cualquier otro sistema que debamantenerse limpio y deba evitarse lacontaminación con partículas minúsculas.Estas cabinas están diseñadas paraproporcionar un aire limpio y constante auna velocidad de paso de aire de 0.30 a 0.50metros por segundo para así barrer lasuperficie de la zona de trabajo y evitar lasuspensión de partículas así como unaposible contaminación de las muestras.*El aire es inyectado a la zona de trabajo através de un filtro HEPA o ULPA e insufladoen forma de un flujo laminar o flujounidireccional, muy suave, hacia el usuario.La superficie de trabajo de la cabina seconstruye generalmente de acero inoxidablegrado 304 o superior para facilitar sulimpieza y aumentar su durabilidad por eluso, con acabados sanitarios, sin espacios ojuntas donde las esporas pueden llegar aacumularse.
    •  http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_Cultivo_in_vitro.pdf?sequence=6. http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%204%20%20Medios%20de%20cultivo.pdf
    • TÉCNICAS DE CULTIVO GENERALUNIDAD IIICULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESDOCENTE: IRMA CASTILLO CARMONAELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑAMISANTLA VER, A 29DE MAYO DEL 2013
    • *La ciencia del cultivo de tejidosvegetales debe su origen a lainvestigación sobre hormonascontrolan el crecimiento ydesarrollo vegetal. Esteconocimiento se combinó conlas técnicas básicas demicrobiología por las cuales losmicroorganismos se hacencrecer en medios estériles parala producción demicroorganismos eidentificación.
    • La estimulación de las yemas axilares o adventicias es elproceso más común que se conoce para la micropropagación de las plantas. Aquí, las citocininas causanuna generación continua de estas yemas en la base delcultivo que prolifera. Cada yema desarrolla en un talloenanizado el cual a su vez puede producir más yemas ensu base. Esta proliferación de tallos y yemas continuarásiempre que sea mantenido un suministro adecuando decitocinina junto con nutrientes y espacio físico porsubdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos amedio fresco cuando sea necesario.
    • *Técnica de propagación vegetativade plantas en condiciones invitro.*Producción masiva a precioscompetitivos.*Cultivo aséptico de un explantoen un medio de cultivo artificial yen condiciones ambientalescontroladas.
    • Por brotación de yemas axilares.Por brotación de yemasadventicias:•directa•indirecta
    • *Elección y preparación de la planta madre (etapa 0).*Establecimiento del cultivo y elección del medio de cultivo(etapa 1).*Multiplicación (etapa 2).*Elongación y enraizamiento(etapa 3).*Aclimatación (etapa 4).
    •  Crecimiento encondiciones de sanidadcontrolada. Tratamientos derejuvenecimiento. Pre tratamientos conreguladores decrecimiento.
    • *Este método, teóricamente, es el más eficiente para laproducción masiva de plantas in vitro debido a lanaturaleza bipolar del embrión, la posibilidad de serautomatizado todo el proceso productivo, los altoscoeficientes de multiplicación en cortos períodos detiempo, al poder aplicarse los principios de la cinéticamicrobiana y la posibilidad de encapsular estasestructuras y obtener semillas artificiales
    •  La embriogénesis somática es la formación de unembrión a partir de una célula, sin la necesidad de lafusión de gametos .Esto no es un fenómeno artificial y esconocido en la naturaleza como una forma de apomixisllamada embrionía adventicia, descrita por primera vezpor Strasburges en1878 aunque fueron Reinert (1958) ySteward et al. (1958)quienes dieron crédito por primeravez a la descripción de la embriogénesis somática en elaño 1958.
    •  Evento morfogenético que secaracteriza por su desarrollounipolar
    •  Formación de órganos directamentesobre la superficie de explantoscultivados intactos. El proceso noimplica la formación de callo.
    • *ESPECIE: Allium cepa L., cebolla*VÍA DE REGENERACIÓN: Organogénesis directa
    •  En las últimas décadas se han desarrollado diferentessistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidosy órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo ensuspensión (suspensiones celulares), el cual constituyeuna forma para mantener y propagar células vegetales.
    •  Las suspensiones celulares consisten en células libres yagregados celulares distribuidos en un medio enmovimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentesmediante el suministro continuo de nutrimentos. Mediosde cultivo Para el cultivo de suspensiones celulares deuna gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MSdesarrollado por Murashige y Skoog (1962) para elcultivo de tejidos de tabaco, como también el medio B-5de Gamborg et al. (1968).
    •  Las suspensiones celulares se inician generalmente mediantela incubación de trozos de callos friables en medios líquidosque, están en movimiento continuo. Comúnmente seemplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita elmedio líquido con los trozos de callo dispersos en el, hastallenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de tos frascos;estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 C de temperatura.Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celularesquedan establecidas después de varios días. Durante losprimeros subcultivos es recomendable usar una tasa dedilución baja (por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes demedio fresco por cada parte de suspensión celular.Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución másalta, según el objetivo para el cual se haya establecido lasuspensión.
    •  La propagación clonal o vegetativa de plantas es unaproducción a partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidosvegetales que conserven la potencialidad de multiplicación ydiferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces apartir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos.Este tipo de propagación tiene esencialmente tresvariantes, que son: 1) la micropropagación a partir de tejidosvegetales en cultivo in vitro; 2) la propagación a partir debulbos, rizomas, estolones, tubérculos o segmentos (esquejes)de las plantas que conserven la potencialidad de enraizar, y 3)la propagación por injertos de segmentos de la planta sobretallos de plantas receptivas más resistentes.
    •  La propagación clonal o vegetativa de plantas es unaproducción a partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidosvegetales que conserven la potencialidad de multiplicación ydiferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces apartir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos.Este tipo de propagación tiene esencialmente tres variantes,que son: 1) La micro-propagación a partir de tejidos vegetales en cultivoin vitro; 2) La propagación a partir de bulbos, rizomas, estolones,tubérculos o segmentos (esquejes) de las plantas queconserven la potencialidad de enraizar, y 3) La propagación por injertos de segmentos de la planta sobretallos de plantas receptivas más resistentes.
    •  http://agronomia.criba.edu.ar/carreras/ia/archivos/Materias/563/Apuntes/CultivoTejidosMorgan.pdf
    • *Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales*Obtención de plantas libres de virus*Mejoramiento genético*Conservación del germoplasma*Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales en el paísELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑAINGENIERIA BIOQUIMICA
    •  Las primeras experiencias relacionadas con elcultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902,pero recién en 1922 se logró el primerexperimento exitoso: la germinación in vitro desemillas de orquídeas. Luego de la germinación,las plántulas obtenidas se transfirieron a unmedio de cultivo en condiciones asépticas, y asíse mantuvieron protegidas del ataque depatógenos (hongos, virus y bacterias). Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones,algunas de ellas se ilustran en la Figura 1:
    • Propagación masiva de plantas, especialmente para especies dedifícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.Clonación de individuos de características agronómicas muydeseables durante todo el añoObtención de plantas libres de virusProducción de semillas sintéticas
    • Obtención de metabolitos secundariosProducción de nuevos híbridosMejora genética de plantas (incluyendo obtención deplantas transgénicas)Germinación de semillas.Producción de haploides.Estudios fisiológicos diversos.
    • Producción de material libre de virus endémicos de Ajo yPapa para luego llevar la semilla libre de virus por elprograma de Hortalizas.Producción de plantas madres de frutales de hoja caducapara vivero.Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para laintroducción y cultivo in vitro de especies de interéshortícola, frutícola, forestales y nativas.
    • Cultivo de anteras en arroz yrescate de embriones en trigopara lograr un avancegeneracional mediante laproducción de doble haploidespara los programas demejoramiento.Inducción de variaciónsomaclonal en durazno para lamejor tolerancia a bacteriosis.
    •  Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas Eliminación de virus y propagación de clonesde yuca Cultivos de tejidos de camote Micropropagación de plátanos y bananas Cultivos de tejidos de caña de azúcar Cultivos de anteras en el arroz Cultivos de tejidos en la caña de azúcar Propagación in vitro de café
    •  http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de_tejidos.htm http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de_tejidos.htm